הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55466

⸱

16 במרץ 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University

במאמר זה

סיכום

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

תקציר

סחר חלבון הממברנה הבנה, הרכבה, וביטוי דורשים גישה מבדילה בין גרי אברונים התאיים ואלה מקומיים על קרום הפלזמה. מדידות קרינה מבוססת מסורתיות חוסר היכולת להבחין חלבונים בממברנה המתגוררים אברונים שונים. מתודולוגיות חוד החנית להתעלות שיטות מסורתיות על ידי צימוד fluorophores pH רגיש עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM). תאורה TIRF שמרגש המדגם עד כ 150 ננומטר מממשק זכוכית מדגם, ובכך להקטין רקע, הגדלת יחס אות לרעש, ושיפור הרזולוציה. היקף עירור TIRFM מקיף קרום הפלזמה האברונים סמוך כגון ER הפריפריה. Superecliptic pHluorin (ספטמבר) הוא גרסת pH רגישה של GFP. גנטי קידוד ספטמבר לתוך התחום התאי של חלבון הממברנה של עניין ממקם את fluorophore עלצד luminal של ER ובאזור התאי של התא. ספטמבר הוא פלורסנט כאשר pH גדול מ -6, אך נשאר במצב כבוי בערכי pH נמוכים. לכן, קולטני מתוייגים עם לזרוח ספטמבר כאשר המתגוררים reticulum endoplasmic (ER) או עם החדרת בקרום פלזמה (PM) אבל לא כאשר מרותק שלפוחית ​​סחר או אברונים אחרים כגון Golgi. ה- pH התאי יכול להיות מותאם כדי להכתיב את הקרינה של קולטנים על קרום התא. ההבדל הקרינה בין תמונות TIRF ב- pH תאיים נייטרלי חומצי לאותו תא מתאים המספר היחסי של קולטנים על קרום התא. זה מאפשר מדידה בו זמנית של קולטנים תושב קרום תאיים ופלזמה. אירועי כניסת שלפוחית ​​יחיד ניתן גם למדוד כאשר pH התאי הוא ניטראלי, המקביל ל שלפוחית ​​סחר pH נמוכה פיוזינג עם קרום הפלזמה ומעבר למצב ניאון. versatil זהטכניקת דואר ניתן לנצל כדי ללמוד לוקליזציה, ביטוי, וסחר של חלבונים בממברנה.

מבוא

שינויים בביטוי קולטן, הפצה, והרכבה חוברו למגוון רחב של מחלות, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סיסטיק פיברוזיס, והתמכרות לסמים 1, 2, 3, 4, 5. לדוגמא, ניקוטין הליגנדים ניקוטינית אחרים להשפיע על הסחר של קולטני אצטילכולין ניקוטינית (nAChRs) מובילים לשינויים בסחר, ביטוי upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. ניקוטין מגדיל את המספר הכולל של nAChRs התאסף בתוך תא, מגביר סחר כלפי הממברנה הפלזמה,ד משנה את ההרכבה של יחידות משנה להעדיף גרסת רגישות גבוהה של תת מסוימים. פתרון שינויים בולטים בסחר, הרכבה, וביטוי של קולטנים מודל המחלה מספק פרטים מכניסטית מכריע כי הם חיוניים כדי להגדיר מטרות תרופה. גישה אידיאלית תהיה להבדיל במהירות בין קולטנים תאיים ואלה מקומיים על קרום הפלזמה. זה מאתגר במיוחד במקרים בהם רוב של חלבון מסוים מתגורר intracellularly, כגון עם nAChRs. מאחר שרוב nAChRs הם נקודות אל reticulum endoplasmic, מדידות מסורתיות חסרות את הרזולוציה במרחב ובזמן דרושים כדי לאתר שינויי לוקליזציה וסחר לאורך מסלול ההפרשה. מחקרים סחר וביטוי קולטן של nAChRs נערכו בעיקר באמצעות radioligand מחייב 11, מבחני biotinylation 12, 13 סופג המערבי, או techniq immunoprecipitation UES 12. אלה תלויים הסגוליים המחייבים של מולקולת כתב או קיבעון של תאים חסרים את היכולת להבחין בו זמנית בין תושב הממברנה הפלזמה קולטנים תאי. לכן, מחקרים של דינמיקת שלפוחית הרכבת ערוץ היון הסתמכו בעיקר על טכניקות אלקטרו נמוכה תפוקת 14.

רזולוציה במרחב ובזמן Superior אפשרית עם התקדמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גנטי מולקולות כתב מקודדות, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), על גרסותיה, תמנע בעיות מחייב ספציפיות ולהגדיל רגישות 15. גרסת pH רגישה של ה- GFP, המכונית pHluorin superecliptic (ספטמבר), שניתן להשתמש בם כדי לנצל הבדלי pH טמונים בין תאים בתוך תא לקבוע לוקליזציה 5, 7, 8,נ"צ "> 9, 16, 17, 18. ספטמבר מאיר כאשר pH גבוה מ -6, אך נשאר במצב כבוי ב- pH נמוך. לכן, קולטני מתוייגים עם ספטמבר בצד לומינל שלהם מזוהים כאשר נוכח reticulum endoplasmic ( ER) או על הכניסה לתוך קרום התא (PM), אבל לא כאשר מרותק שלפוחית ​​סחר. מניפולציה של ה- pH תאיים במגע עם הקולטנים על קרום התא וכתוצאה מכך משנה את הקרינה ולכן זיהוי של קולטנים אלה. אם לאותו תא ברצף הוא צלם בשתי חומציות תאיים ניטראלית ואז pH נמוך מ -6, ההבדל בין התמונות מיוחסים קולטנים הממוקמים על קרום התא. הדבר זה מאפשר מדידה בו זמנית של תאיים (ER ההיקפי) ואת הקולטנים תושב קרום פלזמה 5, 7, 8 p>, 9. אירועי כניסת שלפוחית ​​יחיד יכולים להיפתר גם כאשר pH התאי הוא ניטראלי. פעם שלפוחית סחר pH נמוכה נתיכים עם קרום הפלזמה, צד luminal של שלפוחית חשופת הפתרון הניטראלי התאי, גרימת מעבר זוהה כמו פרץ של קרינה 7, 18, 19, 20. ספטמבר מאפשר המדידה של קולטנים מקומיים על קרום פלזמת reticulum endoplasmic פריפריה, ומספק אמצעי למדידת סחר של קולטנים בין אזורי subcellular אלה 5, 7, 18.

כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר על הממברנה הפלזמה, קולטן עם ספטמבר מקודדים גנטי הוא צלם על ידי מיקרוסקופ בתפרחת ההשתקפות הפנימית המוחלט (TIRFM). שיטה זו היא במיוחדשימושי אם רוב הקולטנים הם נקודתיים לאזורים תאיים, מאז TIRFM מגדילה את הנראות של קרום הפלזמה. TIRFM גם מאפשר הרזולוציה של דינמיקת סחר של שלפוחית ​​אחת נושאת קולטנים שכותרתו ספטמבר על להכניסו PM. השתקפות פנימית מוחלטת המתרחשת בבית הממשק של חומרים עם מדדי שבירה שונים, כגון בין תא לבין כיסוי החלקת זכוכית 21, 22. ספטמבר מאיר כאשר מוקרן עם עירור 488 ננומטר, אשר מכוון להשיג השתקפות פנימית מוחלטת על הממשק של פתרון זכוכית תא. זה יוצר גל חולף החודרת כ 150 ננומטר לתוך המדגם, fluorophores מרגש רק בתוך הכרך הזה. רק ספטמבר המכילים קולטני בסביבת pH ניטרלי בטווח זה של עירור מזוהים, המתאימים לאלה המתגוררים על קרום הפלזמה או reticulum endoplasmic הפריפריה. מאז גילוי מוגבל to עירור על ידי הגל החולף, קרינת רקע מהאזור התאי מצטמצם ואת יחס האות לרעש הוא גדל 21, 22. בנוסף, מאז קרינה אינו חודר את חלק הארי של התא, נזקי ממוזער המאפשר הדמיה תא חי במשך זמן. כתוצאה מכך, TIRFM בשילוב עם מקודד גנטית ספטמבר מספק את הרזולוציה והרגישות הגבוהה הנדרשת כדי למדוד הדינמיקה לוקליזציה וסחר subcellular של קולטני קרום לאורך מסלול הפרשה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבות Transfection ניידות

  1. לשמור 2a נוירובלסטומה העכבר (N2a) תאי תקשורת צמיחה.
    1. הפוך 500 מ"ל התקשורת צמיחה N2a מ 200 מ"ל בינוני הנשר של Dulbecco (DMEM) עם גלוקוז גבוה, 250 מ"ל מופחת התקשורת בסרום, 50 מ"ל סרום שור העובר (FBS), ו -5 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין (100x).
    2. שמור על תאים בבקבוק T75 ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO.
    3. פיצול תאים 01:15 בעת הצורך, או על כ 80-90% confluency. זה בדרך כלל 2-3 פעמים בשבוע.
  2. מעיל 35 מ"מ זכוכית צלחת תחתית עם פולי- D- ליזין.
    1. בארון בטיחות ביולוגי זרימה למינרית, להוסיף 200 μl של 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר פולי- D- ליזין על אזור זכוכית בתחתית צלחת 35 מ"מ סטרילי.
    2. מניחים צלחת בתוך 37 ° C חממה עבור שעה 1.
    3. בזהירות לשטוף צלחת עם DDH 2 O 3-4 פעמים.
    4. אפשר מנות להתייבש לחלוטין עבור יותר מ 1 hr.
    5. Sterilize מנות באמצעות אור UV בקבינט הבטיחות הביולוגי במידת צורך.
  3. פלייט תאים N2a הדמיה TIRFM.
    1. סר מדיה צמיחה מתאית חסידה.
    2. ניתוק התאים מהבקבוק ידי דוגרים עם 1 מ"ל 1x טריפסין (+ EDTA) במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה 2 5% CO.
    3. להשבית טריפסין על ידי הוספת 9 מ"ל התקשורת צמיחה. מערבבי תקשורת, טריפסין, ותאים מנותקים בעזרת פיפטה.
    4. חזותי לספור תאים באמצעות hemocytometer ולחשב את הנפח הנכון להוסיף 90,000 תאים לכל צלחת תחתית זכוכית מצופית פולי- D- ליזין. צפיפות זה נדרש עבור transfection יעיל הדמיה TIRF תא בודד.
    5. הוסף 2 מיליליטר צמיחת תקשורת על כל מנת זכוכית תחתונה המכילה 90,000 תאים.
    6. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס חממת 5% CO 2 עבור 16-24 שעות.
  4. transfection N2a
    1. השג לבנות פלסמיד המכיל fluorophore ספטמבר משולבלאזור תאי של החלבון של עניין. טכניקות שיבוט רגילות כגון הגברת 5 PCR יכולים לשמש כדי ליצור את המבנה.
      הערה: Sep צריך להיות משולב בתוך האזור התאי של החלבון הקרומי כך שהוא מתגורר בתוך לומן של שלפוחית ​​הרטיקולום או סחר endoplasmic והיא חשופה פתרון תאי כאשר מופעלים על הממברנה. ספטמבר הוא דומה בגודלו GFP ואסטרטגיות שיבוט דומה ניתן להשתמש.
    2. החלף את המדיה הצמיחה על תאים צופה עם 1.5 מיליליטר תקשורת סרום מופחת (למשל, Opti-MEM), כ -30 דקות לפני התוספת של מגיב transfection.
      הערה: כדי לחקור שינויים סמים ב קולטנים, ריכוז מתאים של התרופה ניתן להוסיף בזמן של transfection.
    3. להוסיף 500 ננוגרם של כל פלסמיד רצוי לבנות 250 μl מדיה סרום מופחת (צינור 1).
    4. הוסף 2 μl של מגיב transfection על ג בצינור נפרדontaining 250 μl של תקשורת סרום המופחתת. דגירה צינור 2 בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. היחס מגיב transfection כדי פלסמיד דנ"א צריך להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין.
    5. מערבבים צינורות 1 ו -2 לבצע פתרון המכיל 500 μl של מגיב transfection ותמהיל פלסמיד. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות.
    6. הוסף 500 μl תמהיל transfection לתאים טרום מצופה עבור בהיקף כולל של 2 מ"ל לכל צלחת.
    7. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5% למשך 24 שעות.
    8. לאחר 24 שעות, להסיר את תערובת transfection ולשטוף את התאים עם תקשורת צמיחה ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת צמיחה על כל מנה.
      הערה: אם תרופה נוספה בזמן transfection, זה יכול להיות מתחדש שוב בשלב זה.
    9. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור 5% למשך 24 שעות.
    10. תאי תמונה 48 שעות לאחר transfection.

2. הדמיה תא חי על ידי סך הכלהשתקפות ternal מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

  1. הדמיה להגדיר
    1. בצע הדמיה עם הגדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה עם שלב סריקה כפי שמוצג באיור 1. זה דורש יישור של מקור ליזר DPSS 488 ננומטר, מנוע צעד להתאים 488 עמדת קרן ננומטר, ועל צמצם מספרי גבוה (1.49 NA) טבילה אובייקטיבית שמן 60X או 100X.
    2. להעביר את קרן הלייזר דרך המסנן עירור המתאים (bandpass 488/10 ננומטר). יישר את קרן הלייזר מקוטב דרך סיב מצב יחיד המחובר משגר רכוב על מנוע צעד. במצב epifluorescence, קורה העירור מרוכז באמצע הצמצם האחורי של המטרה.
    3. כדי להשיג TIRF, השתמש מנוע הצעד לתרגם את קרן הליזר הממוקדת על פני הצמצם האחורי של העדשה האובייקטיבית עד הזווית הקריטית הוא הגיע ואת הקורה הוא כבר לא מועברת באמצעות המדגם והוא במקום לגמרי מוחזר מן-cel הזכוכיתממשק l.
    4. צלמו תמונות באמצעות EMCCD (512 x 512 פיקסלים) נשלט עם תוכנת הדמיה (למשל Metamorph) עם מסנן פליטה מתאים רכוב במסלול הפליטה (525/50 ננומטר).
  2. הכן את פתרון ההדמיה
    1. הכן 200 מ"ל פתרון תאיים (ECS) על ידי ערבוב 150 מ"מ NaCl, 4 מ"מ KCl, 2 מ"מ MgCl 2, 2 מ"מ 2 CaCl, 10 HEPES מ"מ ו -10 מ"מ גלוקוז DDH 2 פתרונות המניות O. של NaCl, KCl, MgCl 2, ו CaCl 2 ניתן להכין מראש בשילוב עם HEPES וגלוקוז טריים ביום הדמיה.
    2. התאם את ה- pH של תמיסה המכילה 100 מ"ל ECS pH 7.4. התאם את 100 מ"ל הנותרים של ECS כדי pH של 5.4. שוטפים את התאים transfected עם 2 מ"ל של ECS (pH 7.4).
    3. הוסף 2 מ"ל של ECS (pH 7.4) על התאים transfected לפני הדמיה.
  3. הדמיה תא חי ב TIRF
    1. הפעל את המערכת כולה, includinלייזר G 488 ננומטר, המצלמה, שלב התרגום, ותוכנית הדמיה. למקד את קרן epifluorescence ולהתאים את הכוח כ 1 מגה ואט עם המטרה 60X.
    2. מוסיפים שמן אל המטרה ומניחים בצלחת של תאים transfected על הבמה תרגום. אבטח את צלחת במקום באמצעות mounts הבמה כדי לוודא שהוא לא זז ביחס הבמה כך ניתן הדמיה התאים מספר פעמים.
    3. במצב epifluorescence, למקד את המיקרוסקופ ולאתר תאים פלורסנט, transfected. תאים יהיו להישאר ממוקדים על פני כמה מטוסי מוקד. אתר תאים בודדים, מבודדים כדי להמשיך עם TIRF.
    4. בתוכנית הדמיה, לקבוע את זמן החשיפה 200 msec לייעל את עוצמת הקרינה על ידי קביעת רווח EM.
    5. המעבר קרן לייזר לתוך TIRF ידי מתרגם את הקורה על פני המטרה באופן הדרגתי באמצעות מנוע צעד. ככל שיתקרב הזווית הקריטית, הקורה יתרגם בעליל, מעל הקצה בצלחת עד שהוא מתכנס ב הנקודת הדואר של החזרה גמורה במטוס מדגם.
    6. ודא כי תאים נמצאים במצב TIRF ידי התאמת ידית המוקד. ב TIRF, רק מטוס אחד של תאים יכול להיות ממוקד (כלומר כ 150 ננומטר מממשק זכוכית), לייצר תמונה מוגדרת מאוד עם רזולוציה גבוהה של קרום הפלזמה.
  4. הדמיה ספטמבר לקבוע לוקליזציה subcellular
    1. אתר בריא, transfected, תאים בודדים במישור הדמיה.
    2. רוכש תמונה ממוקדת של תאי ב- pH 7.4. ספטמבר שכותרתו קולטנים על קרום פלזמה reticulum endoplasmic צריך להיות גלוי.
    3. במהירות לחסום את קרן הלייזר מלהגיע המדגם כדי למנוע photobleaching.
    4. לשנן את עמדות בשלב המתאים לכל תא באמצעות תוכנת הדמיה מיקרוסקופ מסוגל להקליט במקומות XY מרובים.
    5. חזרו על שלבי 2.4.1-2.4.4 במשך 20-30 תאים לכל צלחת תוך שימוש בתוכנה כדי להקליט את המיקום של כל תא.
    6. באפter כל התמונות התא ב- pH 7.4 נאספים, להסיר באופן ידני את הפתרון pH 7.4 ECS בעזרת פיפטה. אל תיגע המנה כמו זה יכול להזיז את עמדות הבמה פה.
    7. בזהירות להוסיף 2 מ"ל של pH 5.4 ECS כדי בצלחת ולהמתין 10 דקות. במהלך תקופה זו, לשמור תמונות שנרכשו בעבר.
    8. על פי הסט הזהה של תנאים משמשים לאיסוף תמונות ב- pH 7.4, להזיז את הבמה לכל עמדה הצילה ולרכוש תמונה של אותו התא ב- pH 5.4. תאים צריכים להיראות פחות מוגדרים מאז כל הקרינה זוהתה היא שמקורם reticulum endoplasmic המרותק ספטמבר שכותרתו קולטנים. שמור את תמונות תא pH 5.4.
  5. אירועי כניסת שלפוחית יחיד הדמיה בתאים חיים
    1. חלף תקשורת צמיחה של תאי transfected עם 2 מיליליטר pH 7.4 ECS, או עם תקשורת L-15 של ליבוביץ. ה- pH של תקשורת L-15 של ליבוביץ הוא CO 2 עצמאי, המאפשר הדמיה להתקיים במשך תקופה ארוכה של זמן אם יש צורך בכך.
    2. placדואר המנה של תאים transfected על הבמה של המיקרוסקופ. Secure ולהתמקד תא בודד ב TIRF הבא שלב 2.3 לעיל.
    3. אם מצויד, להגדיר את הפוקוס האוטומטי ולכן ההתמקדות לא להיסחף על פני תקופת הדמיה.
    4. הקלט סדרה של 1,000 מסגרות, לכידת תמונות ברציפות בקצב מסגרת של 200 msec. פרצי הקרינה יהיו גלויים במהלך הזמן הזה, מתאים שלפוחית ​​סחר pH נמוכה פיוזינג עם קרום הפלזמה, חשיפת ה- SEP אל pH התאי 7.4.
    5. אתר אחר תא בודד וחזור על השלב לעיל. איפוס אוטומטי במידת הצורך.

3. ניתוח תמונה ועיבודים

  1. ניתוח קרינת ספטמבר לקבוע לוקליזציה subcellular
    1. פתח את תמונות תא באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון Metamorph או ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). הפחת את הרקע משני 5.4 pH ו -7.4 pH תמונות באמצעות הגדרת הכדור המתגלגל.
    2. השתמש סף עוצם מבוסס לכמת קרינה מתא בודד. בחר באופן ידני אזור של עניין סביב התא בתמונת pH 7.4.
    3. מדוד את שטח התא, אומר עצמה, וצפיפות משולבת באמצעות תוסף ב ImageJ או באמצעות מובנה פונקציה "מדוד" תחת הלשונית לנתח.
    4. חזור על שלבים 3.1.1-3.1.3 עבור אותו תא ב- pH 5.4, התאמת סף מבוסס עוצמת בזהירות האזור של עניין באותו אופן.
    5. לאחר משולבת בצפיפות מתקבלת עבור תמונות תא בשני pH 7.4 ו -5.4, לחשב את הצפיפות המשולבת קרום פלזמה על ידי הפחתת ערך pH 5.4 מערך pH 7.4. ההבדל תואם את קולטני המספר היחסי מופעל על הממברנה בתוך אזור עירור TIRF.
    6. כצעד של סחר, לחשב את האחוז היחסי של ספטמבר שכותרתו קולטנים הממוקמים על קרום התא לעומת הקולטנים הנותרים גלוי excitati TIRFעל נפח על ידי חלוקת קרום הפלזמה משולב צפיפות על ידי הצפיפות הכולל המשולבת ב- pH 7.4, כפול 100.
  2. ניתוח אירועי כניסת שלפוחית אחת
    1. פתח את סדרת 1,000 תמונות TIFF באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. הפחת את הרקע מכל המסגרות באמצעות הגדרת הכדור המתגלגל.
    2. התאם את איזון הצבעים של ההקלטה כדי למקסם האזורים אינטנסיביים מתאימים שלפוחית ​​אירועי כניסה. באופן ידני לספור את פרצי הקרינה לאורך זמן רב יותר מ -3 מסגרות (> 600 msec).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התאגדות ספטמבר לתוך קולטן מאפשרת זיהוי ישיר של קולטן כי בתוך תא חי. יחד עם TIRFM, זה מאפשר הערכה של רמות הביטוי היחסי על קרום התא וחלוקת רצפטורי במקומות subcellular באזור של עירור TIRF. אירועי סחר שלפוחית ​​יחיד יכולים להיפתר גם.

רמות הביטוי היחסי של רצפטורים ספטמבר- שכותרתו על פלזמה ממברנה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

רגישות pH של ספטמבר מאפשרת קולטנים המתגוררים מופעל על הממברנה להיות נבדלים קולטנים תאי ב reticulum endoplasmic, וזה יכול לשמש כדי לפתור אירועי החדרת קולטן נושאת שלפוחית 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . מספר טכניקות כולל משטח biotinylation ליגנד כריכת נמצאים ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על-ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים T32 DA 016176, המכון הלאומי לשימוש בסמים DA 038817 והמכון הלאומי לשימוש בסמים DA 040047.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט/חומר
צלוחיות תרבית תאים עם מכסה מסנן, סטרילי, Greiner Bio One, 75 ס"מ2VWR82050-856
צלחות פטרי תחתון זכוכית 35 מ"מ,תא E& סטרילי GGBD00002-200
פולי-D-ליזיןvwr215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), גלוקוז גבוהפישר סיינטיפיק11-965-084 
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניGibco / Fisher Scientific31-985-088
סרום בקר עוברי, מאושר, ממקור ארה"ב, סטנדרטי (מסנן סטרילי) Gibco / Fisher Scientific16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1x), ללא פנול אדוםFisher Scientific12604-021
תמיסת פניצילין-סטרפטומיציןVWR45000-652
L-15 בינוני של לייבוביץ, ללא פנול אדוםGibco / Fisher Scientific21083027אופציונלי
ליפופקטמיןפישר סיינטיפיק11668030מערבבים בעדינות; אין לערבב
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקBP358-1
אשלגן כלוריפישר סיינטיפיקP217-10
מגנזיום כלורידפישר סיינטיפיקBP214-500
סידן כלוריפישר סיינטיפיקC79-500
HEPESפישר סיינטיפיקBP310-500
D-גלוקוזפישר סיינטיפיקD16-1
שמן טבילה אובייקטיבי אולימפוססוג F
שםחברה>מספר קטלוגיתגובות<
strong>Equipment
Microscopeמצלמת אולימפוסIX81
AndoriXon Ultra 897
60X, 1.49 NA מטרת טבילה בשמןOlympusAPON 60XOTIRF
שלב ממונעקודםIXPROXY
מפעיל ממונע (מנוע צעד)ThorlabsZST213
MetaMorph (או תוכנית הדמיה אחרת)Metamorph
488 ננומטר לייזרשוק טק
סיביםבמצב יחידThorlabsSM450
מראותThorlabsBB1-E01
Dichroic 488 ננומטר LPSemrockDi02-R488-25x36
מסנן פס פס, 488 ננומטרSemrockLL01-488-12.5
מסנן פס פס, 525/50SemrockFF03-525/50-25
/

מקורות

  1. Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
  2. Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
  3. Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
  4. Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
  5. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  6. Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
  7. Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
  8. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
  11. Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
  12. Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
  13. Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
  14. Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
  15. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  16. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  17. Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
  18. Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
  19. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
  20. Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
  21. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  22. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
  23. Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תעתוע חלבוני ממברנהפלואורסצנציה בהחזרה פנימית גבולהמיקרוסקופיית TIRFכוונון pH חוץ-תאיקולטנים של ממברנת התארשתית אנדופלזמיתהכנסת וסיקולות בודדותשיטת דימוי פלואורסצנטי
ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.