באמצעות שיטת הר שלמה Immunohistochemical ללמוד את שימור של דרכי המרה סונקוס מורן

סיכום

גישה הר שלמה אימונוהיסטוכימי, כדי לחזות ביטוי חלבון neurofilament במערכת מרה מרהיב סונקוס murinus. מוצג כאן. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים בס מורינוס או מינים אחרים.

תקציר

עבודה זו מתארת ​​את שיטת הרמוניה של המערכת החיסונית בכללותה, תוך שימוש בנוגדן נוירופילמנט לחלבון כדי לתייג את העצבון של דרכי המרה במעי הגס של סונקוס ( S. Murinus   ). ראשית, הדגימה גזור מ מ 'מנוס ו קבוע ב paraformaldehyde 4% (PFA). שנית, טיפול אנזימטי ואקטיביזם peroxidase אנדוגני פוטנציאלי בוצעו. הדגימה נחשפה אז נוגדן ראשוני, נוגדן נוגדנים נוירופילמנט, במשך 3-6 ימים. זה היה מודגרות אז עם נוגדנים משני מצומדות עם חזרת peroxidase. התגובה הצבעונית התגלה על ידי תגובה הדגימה עם המצע של 3,3 '-diaminobenzidine (DAB). שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי לנתח את העצבון של כל האיברים הקרביים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם לבדוק נוגדנים נוירונים אחרים, אבל אופטימיזציה של antibodiEs צריך להיעשות הראשון. שיטה זו הוצגה במקור על ידי Kuratani ו Tanaka ^{1 , 2 , 3} .

מבוא

הבית מושק זועק , סונקוס murinus , שייך סדר Insectivora ואת Soricidae המשפחה. יונק זעיר זה מופץ ברחבי דרום מזרח אסיה ומתגורר בתים ואזורי עשב הממוקמים ליד היישוב האנושי או עטים בקר ⁴ . מין זה מציג מאפיינים מורפולוגיים כלליים דומים יותר לבני אדם מאשר לבעלי מעבדה אחרים, כגון עכבר, חולדה ושפן. בעבר, כל ההר immunostaining עם סמן נוירון היקפי עבור חלבון ne Murphus neurofilament (NFP) שימש התווית העצבים ההיקפיים בלבלב ⁶ , הפודילה המרכזית של התריסריון ⁷ , pylorus ⁸ , gallbladder ⁵ , ו exthepatic דרכי השתן ⁹ .

NFP הוא קומפלקס macromolecular כי הוא חלק cytoskeleton העצבית בוגרת. נוירופילמנט הקשורות חלבוןאינטראקציה בין NFP לבין הזיגוזום. הן פונקציה האנזים ואת המבנה של חלבונים מקשר מוסדרים על ידי NFP ¹⁰ . מתחם NFP מורכב משלושה פוליפפטידים: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) ו- NF-H (200 kDa). NFP ניתן למצוא אקסונים נוירונים הן במערכת העצבים המרכזית והפריפריה. נוגדן NFP אנטי אנושי הוכח לתווית אקסונים של מערכת העצבים המרכזית והפריפלית. מחקרים אנטומיים ואלקטרופיזיולוגיים הוכיחו כי הסוגר, כיס המרה, ודרכי העיכול הפרוקסימלי מחוברים ^{11 , 12 , 13 , 14} . עם זאת, התכונות המורפולוגיות של חיבורים העצבית שלהם עדיין לא הוגדרו.

עבודה זו מדגימה את השימוש של שיטת הר שלמה immunohistochemical מכתים את התווית של העצבנות של ס מורינוס bilIary עם נוגדנים NFP.

פרוטוקול

כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי אוניברסיטת טוקיו מטרופולין מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC). החיות שוכנו ומטופלות בהתאם למדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה ובמדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים ניסיוניים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים. השתמשנו בבעלי חיים וגידלנו במעבדה למורפולוגיה תפקודית, המחלקה למדעי הבריאות של הגבול, אוניברסיטת מטרופולין של טוקיו, יפן.

1. טיפול בבעלי חיים ודיור

1. השג 7 ס מורינוס (3 נקבות ו 4 זכרים במשקל 70-90 גרם) ממושבה ריבוי סגורה.
2. לכלוב את ס מורינוס בנפרד לאחר הגמילה (20 ד לאחר הלידה) בכלובי פלסטיק מצוידים תיבת קינון עץ המכילים רצועות נייר. שמור אותם בחדר חיות מותנה באופן קונבנציונלי: 23-27 ° C, ללא בקרת לחות, ו 12:12 שעה אור: מחזור כהה. ספק אספקהIal pellets ו מים המודעה libitum.

2. הכנת רקמות

1. כדי להכין 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA), להמיס 40 גרם של PFA ב 1000 מ"ל של 0.01 M זרחן שנאגרו מלוחים (PBS, pH 7.4). בתוך ארון אדים, מערבבים באמצעות מערבולת עד הפתרון ברור. חנות 4% PFA O / N ב 4 ° C.
   זהירות: ללבוש המתאים מגן אישי ציוד (PPE) בעת הטיפול PFA.
2. כדי perfuse ולתקן את החיה, להרדים אותו עם אתר ולאחר מכן לתת לו זריקה intraperitoneal של somnopentyl (pentobarbital נתרן, 0.6 מ"ל / ק"ג bodyweight).
3. לאחר החיה מסומנת לחלוטין, לפתוח את חלל הבטן עם אזמל, יצירת חתך הבטן קו האמצע 3 ס"מ. בעוד incising נחות הווריד הנבוב עבור exsanguinating, להכניס קטטר retrogradely לתוך אבי העורקים הבטן ברמה מיד מעל ההתפצלות של עורק זה לתוך העורקים השכיח המשותף.
4. להזריק somnopentyl (pentobarbital כךDium, 1.0 מ"ל / ק"ג bodyweight). לאחר המתת חסד מלאה, perfuse עם 0.01 M PBS (pH 7.4) ולאחר מכן עם PFA 4% בארון קטר.
5. לאחר זלוף, להזריק 2-3 מ"ל של לטקס נייטרן לבן (לדלל לטקס נייטרן לבן 3: 2 עם מים מזוקקים (DW)) לתייג את כלי הדם.
6. לחלץ את איברי הבטן, כולל הכבד, כיס המרה, צינור המרה משותף, תריסריון, לבלב וגוש, עם עצבים הקשורים וכלי.
7. להזריק כ 0.1 מ"ל של לטקס נייטרן כחול (להוסיף טיפה של דיו כחול ל 10 מ"ל של דיאטן לטקס נייטרן לבן מדולל) כדי כיס המרה כדי התווית מערכת המרינה.
8. לאחר תיקון לילה עם PFA 4% ב 4 ° C עבור immunostaining הר כולו.
   זהירות: PFA הוא רעיל. הימנע טיפול PFA ישירות. PFA יש להשתמש בארון קטר.

3. שלמה הר אימונוהיסטוכימיה

הערה: לאורך הפרוטוקול, כולל במהלך כביסה, הדגירה נוגדנים, צבע, thE specimen חייב להישאר על nutator, בעדינות נדנדה ב RT או 4 ° C.

1. יום 1: טיפול אנזימטי ו inactivation פוטנציאל peroxidase אנדוגני
   1. שטפו את הדגימה מוכנה עם DW 4x עבור 1 שעות כל ב RT ב בקבוקון בגודל מתאים. רוק את הדגימה בעדינות על nutator כדי להסיר את PFA. הימנע נזק הדגימה בעת החלפת פתרונות.
   2. כדי להכין 1% (w / v) חומצה אורתופריאודית, להמיס 1 גרם של חומצה אורתופריאודלית ב 100 מ"ל של DW.
   3. דגירה הדגימה של 1% אורטופרידיום חומצה במשך 20 דקות ב RT כדי למנוע כל תגובה peroxidase מהותי.
   4. הכן 0.004% (w / v) papain על ידי המסת 0.004 גרם של papain ב 100 מ"ל של 0.025 mol / L Tris-HCl חיץ (pH 7.6).
   5. שטפו את הדגימה עם DW במשך 10 דקות ב RT.
   6. דגירה הדגימה של פאפאין 0.004% מוכן טרי עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט טמפרטורה קבוע עם נדנדה עדינה.
   7. לשטוף את הדגימה עם DW עבור 50-60 דקות ב RT.
   8. חנות הדגימה 4% PFA ב 4 ° CO / N.
2. יום 2: טיפול אנזימטי
   1. שטפו את הדגימה המאוחסנת עם DW 4 פעמים במשך שעה 1 ב RT.
   2. דגירה הדגימה של פאפאין 0.004% מוכן טרי עבור 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט טמפרטורה קבוע עם נדנדה עדינה.
   3. שטפו את הדגימה עם DW עבור 50-60 דקות ב RT. חנות הדגימה 4% PFA ב 4 ° CO / N.
3. יום 3: הקפאת הטיפול
   1. שטפו את הדגימה המאוחסנת עם DW 4x עבור 1 שעות כל ב RT, כאמור.
   2. הכינו 2.5% (w / v), 5% (w / v) ו -10% (w / v) סוכרוז על ידי המסת 2.5 גרם, 5 גרם, 10 גרם סוכרוז, בהתאמה, ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS ( PH 7.4).
   3. לטבול את הדגימה ב 2.5% (w / v), 5% (w / v), ו 10% (w / v) סוכרוז במשך 30 דקות כל אחד.
   4. להקפיא את הדגימה ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 - 60 דקות ולאחר מכן להפשיר לחלוטין אותו RT; לחזור על מחזור 3x.
   5. חלק עליוןReare 2% Triton X-100 (v / v), להוסיף 2 מ"ל של טריטון X-100 ל 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
   6. חנות הדגימה 2% Triton X-100 ב 4 ° CO / N.
4. יום 4: הדגירה נוגדן ראשוני
   1. הכן את הפתרון דילול של הנוגדן העיקרי על ידי המסת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA), 0.3 מ"ל של טריטון X-100, ו 0.1 גרם של אזיד נתרן ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
      זהירות: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד. שאיפה ונוגע יש להימנע. ללבוש PPE המתאים.
   2. לדלל את הנוגדן העיקרי (NFP) 1: 600 במאגר דילול לעיל (שלב 3.4.1). דגירה הדגימה עם נוגדן NFP ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3-6 ימים, שמירה על הדגימה בעדינות נדנדה על nutator. דגימות גדולות יותר ידרשו פעמים הדגירה גדל.
5. הדגירה נוגדן משני
   1. לשטוף את הדגימה PBS 4x עבור 1 שעות כל ב RT כדי להסיר נוגדן העיקרי מאוגד.
   הכן את פתרון דילול הנוגדנים משני על ידי המסת 0.2 גרם של BSA ו 0.3 מ"ל של טריטון X-100 ב 100 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7.4).
   2. לדלל את הנוגדנים המשניים (peroxidase- מצומדות, זיקה מטוהרים כבשים אנטי עכבר IgG-HRP) 1: 600 במאגר דילול (שלב 3.5.2). דגירה הדגימה עם נוגדנים משני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ד, ולשמור על הדגימה נדנדה בעדינות על nutator.
6. צבע
   1. הכן DAB פתרון צבע על ידי הוספת 0.002 גרם של 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ל 100 מ"ל של 0.05 מ"ל / L Tris-HCl חיץ (pH 7.6) תחת ארון אדים, שמירה על הפתרון בחושך.
   2. שטפו את הדגימות ב RT ב PBS 4x עבור 1 שעות כל אחד.
   3. הוסף 10 μL של 30% H ₂ O ₂ ב טריים מוכן DAB פתרון צבע ו דגירה עם הפתרון ב 4 ° CO / N או במשך 3 ד בעוד נדנדה בעדינות על הנוטאטור.
   4. עצור את התגובה על ידי פלהCing הדגימה PBS עם 0.04% Azide נתרן כאשר עוצמת מכתים אופטימלי הוא הגיע.
      הערה: הימנע משימוש של אזיד הנתרן עד שלב זה, כפי שהוא מעכב peroxidase חזרת.
7. הדמיה של הרקמה המוכתמת
   1. בזהירות להעביר את הדגימה לצלחת זכוכית פטרי (5 ס"מ גבוה, 10 ס"מ קוטר) המכיל PBS. לכידת שלם הר תמונות באמצעות מצלמה רכוב על stereomicroscope.
      הערה: כל הר רקמת מוכתם צריך להיות צילמו בעוד שקוע לחלוטין PBS על צלחת זכוכית שקופה.

תוצאות

איורים 1 - 4 מראים תוצאות טיפוסיות עבור סיבי עצב NFP חיובי במערכת המעי הרגיז ב S. Murinus . נוגדן נגד NFP שכותרתו את העצבון בתמונה כולה של דרכי מרה מרהיב ( איור 1 ), כיס המרה ( איור 2 ), צינור המרה העליונה ( איור 3 ), ואת אזור האפיפיור התריסריון ( איור 4 ), עם סגוליות גבוהה מינימלי רקע כל...

דיון

עבודה זו מתארת ​​את הליך הניסוי להדמיה של העצבון של דרכי המרה המרגיעה באמצעות נוגדנים נגד חלבון neurofilament. פרוטוקול זה הותאם מן הפרוטוקול המתואר על ידי Kuratani ו Tanaka ^{1 , 2 , 3} .

עבור ניסוי זה, לתכנן את ציר הזמן עבור כל אחד הניסויים, כמו כל גישת מכתים הר נמשך 2-3 שבועות. כלי המכיל את הרקמה חייב להיות מסובב על nuta...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חומצה אורתפריודית	Wako	162-00732
papain	Wako	164-00172
אלבומין בסרום בקר (BSA)	Wako	010-15131
נתרן אזיד	Nacalai Tesque	312-33
נוגדן חלבון נוירופילמנט (NFP)	Dako	M0762, lot 089, שיבוט: 2F11
מצומד פרוקסידאז כבשים מטוהרות זיקה נגד עכבר IgG-HRP	MBL	קוד 330
3,3'-דיאמינובנזידין טטרהידרוכלוריד (DAB)	Wako	349-00903
סיגמא	0125