פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

תקציר

רוב החלבונים פועלים בשיתוף עם אחרים; לפיכך, חיוני לאפיין את היחידות הפונקציונליות הללו על מנת להבין באופן מלא תהליכים ביולוגיים. טיהור זיקה יחד עם ספקטרומטריית מסה (AP-MS) הפך לשיטת הבחירה לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון. עם זאת, מחקרי AP-MS קונבנציונליים מספקים מידע על אינטראקציות חלבון, אך המידע הארגוני הולך לאיבוד. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה לחשיפת המכלולים הפונקציונליים המובהקים שחלבון עשוי להיות מעורב בהם, על ידי פתרון קומפלקסים של חלבונים מטוהרים בזיקה לפני אפיונם על ידי ספקטרומטריית מסה. קומפלקסים של חלבונים המבודדים באמצעות טיהור זיקה של חלבון פיתיון באמצעות תג אפיטופ ופליטה תחרותית מופרדים באמצעות אלקטרופורזה מקורית כחולה. השוואה של פרופילי נדידת חלבונים באמצעות פרופיל מתאם באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית מאפשרת הקצאה של חלבונים הפועלים באינטראקציה לישויות מולקולריות נפרדות. שיטה זו מסוגלת לפתור קומפלקסים של חלבונים בעלי משקלים מולקולריים קרובים שאולי לא ייפתרו על ידי טכניקות כרומטוגרפיות מסורתיות כגון סינון ג'ל. עם מעט יותר עבודה מאשר AP-geLC-MS/MS קונבנציונלי, אנו מדגימים שאסטרטגיה זו עשויה במקרים רבים להספיק להשגת מידע טופולוגי מורכב חלבוני במקביל לזיהוי אינטראקציות חלבון.

מבוא

בתאים, רוב החלבונים תפקידיהם באמצעות אינטראקציות חלבון-חלבון חולף או על ידי יצירת מכלולים חלבון יציב. אפיון אינטראקציות חלבון חיוני בתהליכים תאיים הבנה לחלוטין. טיהור זיקה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (AP-MS) היא אחת האסטרטגיות ביותר מיושמות כלל לזהות אינטראקציות חלבון ילידים. שיפורים משמעותיים ביכולות מכשיר השיגו בעשור האחרון הפכו גישה זו עצמה אדירה. חשוב לציין כי האינטראקציות שזוהו על ידי ניסויי AP-MS כוללות תערובת של עמותות ישירות ועקיפות בין הפיתיון פושט. בנוסף, לעתים קרובות חלבונים להשתתף בכמה מתחמים שונים בתוך אותו בהקשר הסלולר, אשר עשוי להיות תפקידים ביולוגיים שונים, ולכן interactors שמזוהים על ידי AP-MS אולי מייצגות מגוון של מכלולי חלבון נפרדים או ישויות פונקציונליות. לא ניתן לגזורמידע טופולוגי כאלה מראש מהרשימות מונו-ממדי של החלבונים שיוצרים ניסויי AP-MS פשוט. עם זאת, הטכניקה ניתן לניצול נוסף כדי להגדיר את הארכיטקטורה של קומפלקסי חלבונים על ידי שילוב עם שיטות אחת או יותר כדי לפתור מכלולים אלה.

על מנת לפתור את הטופולוגיה של אינטראקציות חלבון המזוהות באמצעות AP-MS, מספר אסטרטגיות יושמו. גישה אחת היא לבצע ניסויי AP-MS איטרטיבי באמצעות הפושט מזוהה בסיבוב קודם של ניסויים כמו פיתיונות ^1. למרות מאוד אינפורמטיבי, זה בהחלט משימת עבודה אינטנסיבית הוא בניסוי ומדוקדק. חלבון cross-linking בשילוב עם ספקטרומטריית מסה נמצא בשימוש יותר ויותר כדי להפיק מידע טופולוגי על קומפלקסים חלבונים ^{2, 3, 4, 5.} עם זאת, computatioניתוח סופי של פפטידים צולבים עדיין נותר משימה מאתגרת ולכן הוא צוואר הבקבוק בתהליך העבודה. הופעתו של ריאגנטים MS-cleavable cross-linking צריכה להקל מיפוי של שאריות חומצת אמינו הנמצאות בסמיכות אינטראקצית חלבונים ^{6, 7.} חלופה נוספת היא לשלב טיהור זיקה עם טכניקות הפרדה מאונכות לפני ^{8, 9.} חלוקת זיהוי תכונות חומרים על ידי סינון ג'ל או החלפת יונים, או חלוקת שיפוע סוכרוז יש גם לאחרונה נעשתה שימוש בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית לתאר מתחמי multiprotein ברמה מערכתית, על ידי עקיפת שלב הבידוד המורכב ^{10, 11, 12, 13.} ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) יושמה באופן נרחבלחקור אינטראקציות חלבון מקומיות, בדרך כלל אלה בקומפלקסי חלבון קרום המיטוכונדריה ^14. טכניקת פרדה זו גם שמשה לאחרונה בשילוב עם כימותי חלבון ללא תווית ו פרופיל מתאם, לא רק על מתחמי המיטוכונדריה ^{15, 16, 17,} אלא גם עבור התרת קומפלקסי חלבונים אחרים מתאי כולה ^{18, 19.} החוקרים שערו כי השילוב של טיהור זיקה עם גישות חלוקות מקורות עוקבות וכמותיים MS אמור לספק אסטרטגיה שימושית לפתרון מכלולי חלבון מרובים המכילים חלבון מסוים.

כאן אנו מתארים שיטה המשלבת טיהור זיקה מבוססת אפיטופ גנרית עם ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי הכחול של המתחמים המבודדים, ואחריו sp מסה כמותיתectrometry ו פרופיל מתאם חלבון, כדי לפתור את המכלולים המרובים חלבון עלול להיות מעורב. אנו מעסיקים תאי גזע עוברי בעכבר שבו חלבון של העניין התמזג תג epitope מתבטא מן הלוקוס אנדוגני להשיג קרוב שפע פיסיולוגי ולהבטיח ילידים יעילים בידוד מורכב. גישה זו פורמת את האינטראקציות המרובות חלבון עוסק, כדי לפתור אותן לתוך אסיפות נפרדות על פי פרופיל המתאם שלהם, בעוד שאינה מצריך עבודה יותר geLC-MS ²⁰ הקונבנציונלי.

פרוטוקול

1. בידוד של קומפלקסים חלבונים Native ידי טיהור זיקה FLAG

1. הכנות
   1. הגדרה באמבט מי C 37 ° עבור להפשרת גלולת התא.
   2. להתקרר microcentrifuge כדי 4 מעלות צלזיוס.
   3. מניחים כמה צינורות microcentrifuge בגדלים שונים (1.5 מ"ל, 15 מ"ל) וכן homogenizer בקרח.
   4. הכן 10 מ"ל של חיץ תמוגה (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 מ"מ NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) ולשמור בקרח. רק לפני השימוש במאגר, להוסיף 10 μL של 1 M DTT ולוח כתוש של מעכבי פרוטאז EDTA-free.
2. הכנת חרוזים צמוד נוגדן
   הערה: חרוזי מצופי הנוגדן ניתן להכין עד שבוע מראש לשמור במקרר עד צורך. יש חלבון G זיקה גבוהה יותר מאשר חלבון עבור רוב המינים אימונוגלובולינים תת, למעט IgG ארנב, שעבורם חלבון יש זיקה חזקה יותר.
   1. לשטוף 50 μL של חלבון G-מצופה חרוזים מגנטיים: העברת 50 &# 956; L של תרחיף חרוז צינור microcentrifuge, מניחים את הצינורית מגנט לאסוף את החרוזים על הצד של הצינור ולהסיר את הנוזל. Resuspend את החרוזים 0.5 מ"ל של Tween-20 PBS-0.01%.
   2. מניחים את הצינורית מגנט לאסוף את החרוזים על הצד של הצינור ולהסיר את הנוזל. Resuspend את החרוזים 40 μL של Tween-20 PBS-0.01%. להוסיף 10 מיקרוגרם (10 μL של 1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות) של נוגדן anti-FLAG M2. דגירה עם סיבוב עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. מניחים את הצינורית מגנט לאסוף את החרוזים על הצד של הצינור ולהסיר את הנוזל. שטפו את החרוזים עם 0.5 מ"ל של Tween-20 PBS-0.01%.
   4. עבור cross-linking את הנוגדן חרוזים, לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של 0.2 M triethanolamine pH 8.2. ואז, להשעות את החרוזים 1 מ"ל של 20 מ"מ DMP (pimelimidate דימתיל) ב 0.2 M triethanolamine pH 8.2 (פתרון DMP צריך להיות מוכן טרי מיד לפני השימוש). דגירה עם סיבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   מניח את צינורית המגנט. הסר את supernatant מחדש להשעות את החרוזים 0.5 מ"ל של 50 mM Tris-HCl pH 7.5. דגירה עם סיבוב בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
3. שטפו את החרוזים 3 פעמים עם 0.5 מ"ל של Tween-20 PBS-0.1%. השאר חרוזים בכביסה האחרונה עד צורך.

טיהור זיקה מבוססת FLAG
הערה: תשמור על לא עוזב את החרוזים ללא חיץ במשך תקופה ארוכה של זמן. כל מאגרי הצינורות צריכים להישמר קרח בכל העת. הפרוטוקול הבא מותאם במיוחד עבור הטיהור של קומפלקסי חלבונים 2-5 x 10 ⁸ תאים (lysate חלבון 10-20 מ"ג) מבטאי רמות אנדוגני של חלבון FLAG מתויג ^20.

1. להפשיר את התא גלולה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהוא מתחיל להינמס. קח את הצינור מתוך האמבטיה, לערבל אותו בעדינות עד הגלולה היא מופשרת לחלוטין, ומייד במקום הצינור המכיל השעית התא על קרח.
2. מוסיפים 5 מ"ל של חיץ תמוגה קרים כקרח(המכיל DTT וכן מעכבי פרוטאז) על השעיית תא המערבולת לערבב. מדגירי קרח למשך 10 דקות.
3. העברת lysate ל homogenizer Dounce קר. Lyse עם 20-30 משייך באמצעות העלי החזק (עד אין צמיגות מורגשת). מעבירים את homogenate לצינורות microcentrifuge קר.
4. צנטריפוגה ב 18,000 XG במשך 15 דקות ב 4 °.
5. העברת lysate פינה לצינור קר ונקי. השאירו 50 μL של lysate מאחורי. קחו aliquot 35 μL של lysate למדוד ריכוז חלבון ולפקח על טיהור.
6. הסר את Tween-20 PBS-0.1% מן החרוזים. Resuspend החרוזים עם 1 מ"ל של lysate ומערבבים עם שאר lysate. דגירה את התערובת בתוך גלגל מסתובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות.
7. לאסוף את החרוזים בצד של הצינור עם המגנט. איסוף aliquot 30 μL של supernatant וזורקים את שאר supernatant. Resuspend את החרוזים 0.5 מ"ל של IPP150 חיץ (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 מ"מ NaCl, EDTA 1 מ"מ, 0.1% NP-40) על ידי pipetting 4-6 פעמים. מעבירים צינור 1.5 מ"ל קר.
8. חזור על שטיפות עם 0.5 מ"ל של IPP150 חיץ פעמיים נוספות.
9. לשטוף חרוזים שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל של חיץ elution ילידי FLAG (20 מ"מ Bis-טריס pH 7, 20 מ"מ NaCl, 0.02% Nonidet P-40, 1 מ"מ EDTA, 200 מ"מ חומצה ε-aminocaproic). עם לשטוף האחרון, להעביר את החרוזים כדי צינור קר חדש. הסר חוצץ ביסודיות.
10. Resuspend את החרוזים 100 μL של 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​3x פפטיד הדגל חיץ elution הילידים. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם סיבוב עדין.
11. לאסוף את החרוזים עם מגנט ולהעביר את supernatant לצינור חדש קר.
12. חזור על שלבי 1.3.10-1.3.11 פעמים. פינת כל eluates.
13. לרכז את eluate עד 25 μL ביחידה מסננת צנטריפוגלי (10 מולקולרי נומינלי kDa משקל גבול חתוך, PES) על ידי צנטריפוגה ב 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. העברת eluate מרוכז לצינור קר חדש ולהוסיף 50% glyceרול ריכוז סופי של 5%. Eluate המרוכז יכול להישמר על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה במידת הצורך.

2. בלו Native עמוד

1. הכנות
   1. כן 1 ליטר של הצפת האנודה עמוד ילידי 1x, עמוד ילידי 1x קתודה הכחולה כהה הצפת עמוד ילידי 1x תכלת קתודה חוצצת.
   2. הסר את המסרק של ג'ל טרומי 3-12% ילידי עמוד לשטוף את הבארות פעמים עם עמוד 1x ילידי חוצץ קתודה הכחולה כהה. מלאו את בארות עם עמוד 1x ילידי חוצץ קתודה כחול כהה. הגדרת ג'ל במיכל ריצה אך לא להוסיף למאגר קתודה כחול כהה כדי הקתודה (בפנים) קאמרית.
2. בטווח electrophoretic
   1. הכן את המדגם: אל 25 μL המרוכזים eluate להוסיף נפח מתאים של חיץ טעינת מדגם ילידי 4x ושל 0.5% תוסף מדגם G-250 עבור ריכוזים סופיים של 1x ו 0.005% בהתאמה.
   2. טען את מדגם סמני משקל מולקולרי ילידי עזב באר מים ריקים betweeN אותם. טען 10-20 μL של חיץ טעינת יליד מדגם 1x בכל הבארות הריקות.
   3. מלאו הקתודה (בפנים) קאמרית עם 200 מיליליטר של קטודה הכחולה כהה עמוד ילידי 1x הצפה בזהירות כדי לא להפריע את הדגימות. ממלאים את החדר האנודה (בחוץ) עם 550 מ"ל של הצפת האנודה עמוד 1x הילידים.
   4. הפעל את הג'ל על 150 וולט עבור 30 דקות. עצור את הריצה, להסיר את חיץ הקתודה הכחולה הכהה עם טפטפתי סרולוגיות ולהחליף עם הצפת קתודה הכחולה 1x אור. המשך הריצה עבור 60 דקות. הג'ל ניתן להריץ בטמפרטורת החדר או 4 ° C; הטמפרטורה עשויה להיות השפעה על מבנה מורכב חלבון.
3. מכתים ג'ל
   1. פתח את קלטת ג'ל וזורקים אחד מלוחות הקלטת. הג'ל נשאר מחובר צלחת הקלטת האחרת. מעבירים את הג'ל לתוך מגש או כלי קיבול המכילים פתרון מקבע מספיק (מתנול 40%, 2% חומצה אצטית) כדי לכסות את הג'ל דגירה במשך 30 דקות עם רעד עדין.
   2. הסר את solut מקבעיון להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הג'ל. הג'ל ניתן לסרוק לשימוש עתידי.

3. ניתוח ספקטרומטריית מסה

הערה: כל הצעדים הבאים יש לבצע במנדף זרימה למינרית אם ניתן להבטיח ניקיון של הדגימות. כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים עם מים HPLC כיתה. דונו פרוטוקול זה עם מעבדה ספקטרומטריית מסה כי יבצע את הניתוח.

1. הכנות
   1. מניח צלחת 96-היטב בתחתית חרוטים על גבי זו צלחת 96-היטב כדי לאסוף את הפסולת. פירס בתחתית בארות הצלחת 96-היטב בתחתית החרוטים עם מחט 21 G.
   2. לשטוף את הבארות של צלחת 96-היטב פירסינג.
      1. הוספת 200 μL של 50% אצטוניטריל-0.25% חומצה פורמית אל בארות הצלחת פירסינג. דגירת מחסנית הצלחת שייקרה עבור 10 דקות.
      2. צנטריפוגה ב 500 XG במשך 1 דקות, כך הנוזל זורם דרך חורים לתוך צלחת איסוף פסולת. מחק את wנוזל ASTE.
      3. חזור על שלבים 3.1.2.1-3.1.2.2 עוד פעמיים.
      4. מלאו את בארות הצלחת 96-היטב מנוקבת 150 μL של אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ (טריים).
   3. לשטוף את הבארות של צלחת 96-היטב סינון צנטריפוגלי.
      1. מניחים צלחת 96-היטב רגיל תחת צלחת סינון צנטריפוגלי לאסוף את הפסולת. הוספת 200 μL של 50% אצטוניטריל-0.25% חומצה פורמית היטב בכל צלחת סינון צנטריפוגלי.
      2. צנטריפוגה מחסנית צלחת ב 200 XG במשך 1 דקות. מחק את הפסולת.
      3. חזור על שלבים 3.1.3.1-3.1.3.2 עוד פעמיים.
2. כריתת ג'ל וב-ג'ל עיכול
   הערה: אמנם מוציא את הג'ל, לזהות ורשומה של פרוסת ג'ל מיושרת זה של סטנדרטי החלבון. סטנדרטי החלבון יכולים לשמש כדי להעריך משקל מולקולרי המשוער עבור כל פרוסות ג'ל.
   1. מניחים את הג'ל עם צלחת זכוכית על משטח נקי. פורס את השביל מכילing המדגם לתוך 48 פרוסות זהות (1.5 מ"מ x 5 מ"מ). חותך כל פרוסה לתוך 2-3 חתיכות קטנות (למעט חמש הפרוסות האחרונות בחלק העליון של הג'ל) ומקום אחד ברצף פרוס היטב אחד הפירסינג ורחץ צלחת 96-היטב.
   2. להוסיף 50 μL של אצטוניטריל היטב כל אחד. דגירה את הצלחת עם רעד במשך 30-60 דקות. הסר את הנוזל על ידי צנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.2.
   3. הוספת 200 μL של 2 מ"מ TCEP ב 50 אמוניום ביקרבונט מ"מ היטב כל אחד. דגירה את הצלחת עם רעד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הנוזל על ידי צנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.2.
   4. הוספת 200 μL של 4 מ"מ iodoacetamide ב אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ היטב כל אחד. דגירה את הצלחת עם רעד במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. הסר את הנוזל על ידי צנטריפוגה כמו בשלב 3.1.2.2.
   5. הוספת 150 μL של אמוניום ביקרבונט 50 מ"מ בתוספת 50 μL של אצטוניטריל דגירה את הצלחת עם רעד במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על צעד זה כביסהזה הרבה פעמים כנדרש עד שכל הצבע הכחול יוסר חתיכות ג'ל.
   6. מייבשים את חתיכות ג'ל על ידי הוספת 200 μL של אצטוניטריל טהור דגירה עם רועד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות עד חתיכות ג'ל הם לבן אטום. הסר acetonitrile.
   7. הוספת 150 μL של 0.001 מ"ג / מ"ל ​​של טריפסין (כיתה סידור) ב אמוניום ביקרבונט קר 50 מ"מ היטב כל אחד. דגירה את הצלחת עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 h. אחרי 1 h, לבדוק כי חתיכות ג'ל מכוסות נוזלי; אם זה אינו המקרה, להוסיף 50-100 אחרת μL של 50 מ"מ אמוניום ביקרבונט. לאחר 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, להמשיך העיכול בבית 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   8. מניח צלחת בתחתית חרוטים נקיה מתחת לצלחת המכיל ג'ל, הבטחת כיוון נכון של הצלחות. אסוף את הנוזל המכיל פפטידים על ידי צנטריפוגה ב 200 XG במשך 1 דקות.
   9. מניחים את צלחת פפטידים המכילים בתוך המאייד צנטריפוגלי להתאדות הנוזל תוך ביצוע tהוא השלב הבא.
   10. הוספת 150 μL של 50% אצטוניטריל-0.25% חומצה פורמית אל חתיכות ג'ל. דגירה עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   11. אסוף את הנוזל לתוך הצלחת המיובשת חלקית משלב 3.2.9 ידי צנטריפוגה ב 200 XG במשך 1 דקות. המשך מתאדה הצלחת פפטידים המכילה תוך ביצוע השלב הבא.
   12. חזור על שלבי 3.2.10-3.2.11.
   13. הוספת 200 μL של אצטוניטריל טהור היטב בכל הצלחת המכילה חתיכות ג'ל. דגירה עם רועד בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
   14. אסוף את הנוזל בתוך צלחת פפטידים המכילים ידי צנטריפוגה ב 200 XG במשך 1 דקות.
   15. ודא הריכוז הסופי של acetonitrile בכל הבארות הוא מעל 55%. אם יש צורך, להוסיף אצטוניטריל טהור מיותר.
   16. העבר הפתרונות פפטיד לצלחת סינון צנטריפוגלי נשטף. מניח צלחת בתחתית חרוטים נקיה מתחתיו כדי לאסוף את פפטידים. צנטריפוגה מחסנית צלחת ב 200 XG במשך 1 דקות.
   17. Evaporאכלו את הנוזל בצלחת התחתונה חרוטי עד בארות יבשות לחלוטין. הצלחת יכולה להיות מכוסית עם מכסה סיליקון מאוחסן ב -20 ° C בשלב זה.
   18. מחדש להתמוסס פפטידים ב 32 μL של חומצה פורמית 0.5% עם הרעד נמרץ במשך 15 דקות. להוסיף 8 μL של אמוניום ביקרבונט 400 מ"מ ו דגירה עם הרועד נמרץ במשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצלחת ב 200 XG במשך 1 דקות. מכסים במכסה סיליקון ולאחסן את הצלחת ב -20 ° C עד לניתוח ספקטרומטריית מסה.
3. ספקטרומטר מסה
   הערה: לנתח פפטידים על ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה בשיטות תואמות פרוטאומיקה רובה. רכישה תלויה בנתונים היא LC-טנדם הנפוץ ביותר MS הגדרה עבור סוג זה של ניתוח צריך להיות מותאם לצורך זיהוי הפפטיד יעיל, צמצום רצף מיותר ובחירת מועמדים מעל רעש רקע. ספקטרה המונית של סריקה וניתוח המונית השלב הראשון (MS1) ייזקף לסעיף מצב פרופיל. הוא ממליץאד לבחור כפליים ו ובשילוש טעונה יונים מועדף לניתוח המונית השלב השני (MS2). מגוון המוני של m / z 400-1,600 מתאים לזהות פפטידים ביותר בין 8-30 מגוון חומצות אמינו. כאן, פרוטוקול לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה Orbitrap מסופק.
   1. להזריק 20 μL של מדגם לפי ניתוח באמצעות סמפלר האוטומטי של מערכת nanoLC-MS / MS. Desalt ולרכז פפטידים על שלב הפוך טור C18 (100 מיקרומטר id, 2 סנטימטר).
   2. פפטידים נפרדים על עמודת C18 אנליטי (75 מיקרומטר id, 15 סנטימטרים) באמצעות שיפוע ליניארית 30 דקות של 4-28% acetonitrile / 0.1% חומצת פורמית ב 300 NL / min.
   3. לנתח פפטידים בספקטרומטר מסה עם שיטת רכישה תלויה 10 נתונים עליונה עם הפרמטרים הבאים: טווח m / z 380-1,600, ברזולוצית 30,000 ב m / z 400, רוחב בידוד של 2 Th, הדרה דינמית ב ± 10 עמודים לדקה עבור 45 s , יעד שליטה אוטומטית על 1 x 10 ⁶ עבור MS ו- 5000 עבור MS / MS, זמן הזרקת מקסימום 150 ms עבור MS ו100 ms עבור MS / MS.

ניתוח 4. נתונים

1. זיהוי חלבון וכימות באמצעות MaxQuant
   1. השתמש בתוכנת MaxQuant בחופשיות הזמינה לזהות ולכמת חלבונים בכל שבריר ג'ל מהנתונים הגולמיים ספקטרומטריית מסה.
      הערה: MaxQuant עובד על נתונים שהופקו על ידי גישות פרוטאומיקה רובה רכישת נתונים תלויים. נתוני MS מן שברי ג'ל יליד הכחולים צריכים להיות מנותחים יצווה כמו ניסויים נפרדים ולא כמו שברים של ניסוי המשלב את כל פרוסות ג'ל. סמן את תיבת ערך iBAQ לבצע חישובים ורכב. פרוטוקולים מפורטים כימות חיפוש וחלבון נתונים באמצעות MaxQuant מתוארים ^{21, 22.}
2. ניתוח פרופיל חלבון באמצעות פרסאוס
   1. השתמש בתוכנה בחופשיות הזמינה פרסאוס להציג את פרופילי הגירה של החלבונים המזוהים ולהשוות אותם באמצעותניתוח סטטיסטי.
      הערה: תיעוד כללי על אופן השימוש פרסאוס זמינה בכתובת http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. מערך נתונים לדוגמה זמין כנתונים משלימים.
   2. העלה את קובץ proteingroups.txt שהוחזר על ידי ניתוח MaxQuant המכיל את זיהוי החלבון וערכים לכמת לכל שברי ג'ל. אכלס את הערך העוצם לתוך תיבת הראשים (איור 1). מטריצה ​​תופיע המכילה את כל הזדהויות החלבון בשורות, עם שברי ג'ל כמו עמודות.
   3. הסר את הרשומות המתאימות להפוך להיטים, חלבונים מזוהים רק על ידי אתר ו מזהמים פוטנציאליים על ידי בחירת שורות מסננות המבוססות על עמודת קטגורים בתפריט הנפתח בשורות המסננות (איור 2).
   4. לנרמל את עוצמות שבריר של כל חלבון על פני פרופיל נגד עוצמת החלבון הכולל ידי בחירת הפרד בתפריט הנפתח לנרמל, אז סאם (איור 3). זרק חדשAtrix מופיע.
   5. הצג את חלקות פרופיל הגירה של כל החלבונים על ידי בחירת מגרש בפרופיל בתפריט הנפתח ויזואליזציה (איור 4).
   6. שורות בחר בסינון המבוסס על ערכים חוקיים בתפריט הנפתח בשורות המסננות. זן 1 במספר הערכים החוקיים הנדרשים.
   7. בצע אשכולות היררכיים של חלבונים מזוהים בכל שברי ג'ל כחולים ילידים ידי בחירת אשכולות היררכיים בתפריט הנפתח Clustering / PCA. בטל את סימון תיבת עץ עמודות (איור 5). הצבירים הם דמיינו מפה-חום בלשונית Clustering ליד מטריקס (איור 6).
   8. אתר את האשכול המכיל חלבון הפיתיון dendrogram. רכיבים אחרים של האשכול מייצגים חלבוני שיתוף נודד עם הפיתיון ולכן הם חלבוני אינטראקצית פוטנציאל / יחידות משנה של אותו המורכב.

r /> איור 1. צילום מסך של חלון טעינת נתונים פרסאוס. האיור מציג את השלבים לטעינת זיהוי חלבון ונתוני כימות לתוך פרסאוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תמונת מסך של פרסאוס חלון סינון של רשומות המתאימות מזהמים, להפוך להיטים וחלבונים שזוהו על ידי האתר. בחירת שורות סננו לפי עמודת קטגורי פותחת חלון חדש לבחירת סוגי ערכי חלבון כדי להתבטל מן הנתונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/55498fig3.jpg"/>
איור 3. צילום מסך של חלון נורמליזציה פרסאוס. בחירת פרד בתפריט הנורמליזציה פותחת חלון חדש, עם אפשרויות שונות. בחירת סכום מחלק את ערך העוצמה של חלבון בכל שבריר מעוצמת הטוטאלי של אותו חלבון בכל שברים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תמונת מסך איור 4. של פרסאוס מראה חלקות פרופיל הגירה. חלבונים ניתן לבחור במטריצה ​​מתחת הפרופילים כדי להדגיש את הפרופיל המתאים להם. סרגל הכלים ניתן להשתמש כדי לערוך ולייצא את הפרופילים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לשמור-together.within-page = "תמיד">
איור 5. תמונת מסך של חלון אשכולות היררכי פרסאוס. האיור מציג את ההגדרות עבור אשכולות היררכיים של חלבונים באמצעות מנהטן (L1) מרחק מטרי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תמונת מסך איור 6. של פרסאוס מראה dendrogram ו מפת חום חלבון עוצם. זרימת העבודה על הצד הימני של הפנל הראשי מציגה כל צעד התחייב ואת מטריקס שהתקבל, והוא יכול לשמש כדי לבטל את כל צעד. זרימת העבודה גם יכול להסתעף מכל מטריקס ביניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של F זהigure.

3. חישוב והרכב יחסית
   1. בחר את יחידות המשנה של קומפלקס חלבון המבוסס על השיתוף באשכול שלהם עם חלבון הפיתיון לתחום את שיא הפרופיל (ים) שבו הם מופיעים.
   2. השתמש בערכי iBAQ חזרו ידי ניתוח MaxQuant לכל למקטע בכל שבריר בנפרד לנרמל לפי ערך iBAQ פיתיון המקביל כי שבר.
   3. שרטט את iBAQs המנורמל עבור יחידות משנה מורכבות פיתיון וחלבון ברחבי השברים של השיא שנבחר ולהחיל רגרסיה ליניארית. חישוב הסכום היחסי של תת-יחידה מורכבת הפיתיון ידי השוואת מגמות של ערכי iBAQ מנורמל שלהם.
4. הערכת גודל חלבון מורכב
   1. השתמש סטנדרטי חלבון לחשב משקל מולקולרי חזה עבור פרוסות ג'ל יליד הכחולות יישור מהנתיב המדגם. מתוך אלה, ליצור מודל רגרסיה ליניארית על ידי התוויית פרוסה ג'ל ב- x ציר משקולות מולקולריות y הציר.
   השתמש במודל כדי להעריך את טווח המשקל המולקולרי הנצפה של קומפלקס חלבון (es) מבוסס על פרוסת ילידי כחול (ים) שממנו הם זוהו.

תוצאות

זרימת העבודה של פרופיל מתאם חלבון יליד הכחול טיהור הזיקה ידי ספקטרומטריית מסה (ABC-MS) אסטרטגיה מתוארת באיור 7. קומפלקסים חלבונים Native סביב חלבון של עניין מבודדים על ידי טיהור זיקה באמצעות נוגדנים נגד תג אפיטופ (ב FLAG במקרה זה) ו elution תחרותי. המתחמים נפתרים על ידי BN-עמוד, ואת שביל ג'ל כולה הוא נכרת לתוך 48 חלקים, והכינו עבור רובה LC-MS / MS. מידע כמותי MS משמש לצורך יצירת פרופיל ההעברה של כל חלבון מזוהה ברחבי ההפרדה ילידי כחול. חלבונים כי האינטראקציה כדי ליצור פרופילי הגירה דומים מורכבת תצוגה ברורה עם פסגות superimposable. כאשר חלבון של עניין לוקח חלק בלמעלה מ הרכבה אחד, פסגות מרובות הם נצפו פרופיל ההגירה שלה, בהינתן תת-המתחמים נמצאים בתוך כושר ההפרדה של ג'ל הכחול מהקורה. השוואה שיטתית של המיגפרופילים מנה יכולה להיות מושגת על ידי מתאם חלבון פרופיל משתמש אשכולות היררכי. Dendrogram ואת עוצמות השיא עבור כל השברים הם דמיינו במפה-חום, הקלת זיהוי של אינטראקצית חלבונים ששייכים קומפלקסי חלבונים נפרדים (איור 8).

השתמשנו באסטרטגיה זו כדי לנתח את השותפים באינטראקציה של Mta2, למקטע הליבה של הכרומטין NuRD שיפוץ ²⁰ מורכבים. כפי שניתן לראות בתרשים 9, פרופיל ההגירה של Mta2 מוצג שני שיאים של עוצמות מובהקות בין 700 kDa ו 1.2 מד"א, עם שיא המסה התחתון מוצג שפע גבוה. תת-יחידות ליבת NuRD אחרות, כולל Mta1 / 3, Hdac1 / 2 ו Mbd3, הראו דפוס הפרדה זהה, אם כי הפסגות לכמה יחידות המשנה, כלומר Chd4, Gatad2a / b ו- Rbbp4 / 7, היה חלוקת השפע ההפוכה (איור 9 א, B). לעומת זאת, הפרופיל של CDK2ap1, גורם רגולטורים הוא מגייס את מורכבות NuRD יזמי גן Wnt ^23, הציג רק את שיא המסה הגבוה יותר (איור 9 ג), וכך עשיתי Sall4, A מדכא תעתיק כי גם הוכח לאגד ^{20 NuRD, 24, 25.} לפיכך, החלוקה של חלבוני Mta2 הקשורים מטוהר זיקה לפי דף הכחול ילידים הצליחה לפתור שתי צורות שונות של מורכבות NuRD.

גם ABC-MS מאפשרת זיהוי של interactors רומן תוך הקצאה אותם גופי חלבון מסוימים. באמצעות בחינה של אשכולות חלבונים בעוצמות שבריר מיוצג א-מפת חום זיהינו מתאם חזק בין יחידות משנה NuRD ו Wdr5, למקטע רגולטוריות של המתחם methyltransferase MLL ^26, עם Wdr5 מוצגות שתי פסגות הגירה חופפות עם p שני NuRDeaks (איור 8), דבר המצביע על אינטראקציה הרומן בין Wdr5 ו NuRD. אנחנו אישר אינטראקציה זו על ידי שיתוף immunoprecipitation ושיתוף ההגירה כרומטוגרפיה הדרה גודל ^20.

הבחירה של חישוב מרחק מטרי של האשכולות ההיררכיים תשפיע על צורת האשכולות ומכאן המתאמים. אנו ממליצים להתנסות מדדים השונים כדי להשיג את ההתאמה הטובה ביותר עם ידע אינטראקציה קיים של החלבון או מורכבות עניין. באופן כללי השגנו את התוצאות הטובות ביותר עם מטר מרחק מנהטן (L1) ^20. מתאם פירסון או מדדי מרחק האוקלידית גם דווח לזיהוי מתחמים המבוססים על טכניקות חלוקה אלטרנטיבית ^{10, 11, 12.}

קוואןנתוני titative MS המתקבל שהברים הכחולים ילידים יכולים לשמש גם כדי לקבוע את והרכב של קומפלקסי חלבונים. IBAQ ערך (כימות מוחלטת מבוסס בעוצמה) מספק מדד של השפע היחסי של החלבונים שזוהו ^{27, 28.} ערכי iBAQ לחברי מורכב החלבון בכל שהברים בתוך שיא נדידת פרופיל מתנרמלים לזה של חלבון הפיתיון כדי להשיג כמויות יחסיות. IBAQs מנורמל פני שיא פרופיל עבור חבר מורכב חלבון נתון צריך לעקוב מגמה אופקית, ואת ערכי המגמה לשקף את והרכב של חלבוני האינטראקציה ביחס חלבון הפיתיון. לקבלת ייצוג מפורט יותר של חישובים ורכב, לראות ^20.

איור 7: עבודה סכמטי המסכם את ABC-MS יםtrategy. נתון זה שונה מ ^20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8. אשכולות היררכיים של פרופילי הגירת BN-עמוד של interactors Mta2. החלבונים הקשורים Mta2 הצטופפו על סמך מידת הדמיון של פרופילי ההגירה שלהם. רק קבוצת משנה של מפת החום המכילה קומפלקס NuRD מוצג (מצורף באריזת הכחול). התיבה הצהובה מדגישה את הקורלציה החזקה של Wdr5 עם מורכבות NuRD. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מן מרחקי ההגירה של סטנדרטי חלבון לרוץ באותו ג'ל. מחקר זה פורסם במקור ב פרוטאומיקה מולקולרי ותאי ²⁰ האגודה האמריקאית לביוכימיה מו ביולוגית lecular. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9. פרופיל הגירה BN-עמוד של יחידות משנה NuRD וחלבונים הקשורים. א) יחידות משנה Mta2 ו NuRD נוכח דפוס בעוצמה דומה. B) יחידות משנת Mta2 ו NuRD עם הדפוס העוצם ההפוך. ג) Mta2 ו Cdk2ap1, המהווה כיום רק ישות NuRD משקל מולקולרי גבוה. המשקלים המולקולריים המבוארים נאמדו מפרופיל הגירה של סטנדרטי החלבון. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה ²⁰ האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית._blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

נתונים משלימים: נתונים לדוגמה. MaxQuant הנגזרות קובץ proteingroups.txt המכיל הזדהויות חלבון וערכי כימותים מניסוי ABC-MS. מחקר זה פורסם במקור ב מולקולרי ותא פרוטאומיקה ²⁰ האגודה האמריקנית לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

כאן, אנו מתארים את שימוש טיהור זיקה ואחריו ג'ל אלקטרופורזה כחולה מקורית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית כדי לפתור קומפלקסי חלבונים. גישה זו מציעה שיטה לפענח רשימות אינטראקצית חלבון חד ממדיות לתוך אסיפות חלבון פונקציונליות.

אנחנו מדגימים את השיטה מבוססת על שימוש חלבונים-tagged אפיטופ. עם זאת, אם שורת תאי מבטאי חלבון מתויג אינה זמינה, אלטרנטיבה יכולה להיות להשתמש נוגדנים כנגד החלבון של עניין, בתנאים שיש פפטיד זמין להשיג elution התחרותי ילידים. כמות של חומר המוצא וכמות חרוזים ייתכן שיהיה צורך לשנות בהתאם לרמת הביטוי של חלבון המטרה. אנחנו בדרך כלל לבצע פרוטוקול זה עם 2-5 x 10 ⁸ תאים חומר מוצאים, וזה מספיק אפילו בשביל חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה. רכב חיץ תמוגה צריך להיבחר באופן אמפירי כדי להשיגליד כדי להשלים solubilization של פיתיון. זה עשוי להיות מאתגר עבור סוגים מסוימים של חלבונים, ב הכרומטין מסוים או חלבונים בממברנה מחייב. אפשרויות חלופיות כוללות הגדלה כמות מלח, ובלבד מורכב החלבון נחקר הוא יציב מלח גבוה, או באמצעות sonication ו / או טיפול nuclease עבור חלבוני מחייב הכרומטין ^{20, 29.} במקרה של חלבונים בממברנה, מיתוג דטרגנט DDM או digitonin עשוי להיות רצוי ^30. במקרה של ה- DNA מחייבת חלבונים, כדאי לכלול nuclease כגון benzonase במהלך שלב טיהור ^20. הסרה מלאה של חומצות גרעין מבטיחה כי האינטראקציות זוהו להתרחש בין חלבונים ואינם בתיווך DNA.

מרכיב קריטי להביא בחשבון בעת ​​השימוש בגישה זו היא היציבות של המתחם תחת חקירה. ההליך הוא ארוך עשוי להיות כרוך preservinגרם חלבון הלילה מורכב. השגנו הצלחה טובה עם שני מתחמי שיפוץ הכרומטין (ד בודה ומ פרדו, מידע לא מוצג), אבל זה צריך להיבדק. צעד טיהור הזיקה עשוי להתקצר אם נדרש.

טכניקות חלופיות שיאפשרו חלוקה מקורית, כגון כרומטוגרפיה הדרה גודל, כבר בשימוש נרחב במשך 50 שנים לאפיין קומפלקסים חלבונים. אנחנו ואחרים הראו כי ההחלטה של עמוד כחול יליד עדיפה על זו מושגת באמצעות כרומטוגרפיה הדרה גודל ^{20, 31, 32, 33.} יתרון נוסף של עמוד כחול ילידים הוא שזה לא דורש מערכות כרומטוגרפיה, שהם יקרים, אלא משתמש בציוד חלבון electrophoretic כי הוא נפוץ במעבדות. במונחים של הידיים על הזמן, שיטה זו אינה כרוכה בעבודה יותר מ א geLC-MS / MS המסורתיתpproach או חלוקת כרומטוגפיות מחוברת. עם זאת, כפי הטכניקות החלוקות ביותר לעשות, יש לו גבול הרזולוציה שלהם. מתחמים כי הם מאוד הומוגנית או קרובים במסה וצורה עשויים להיות מעבר ברזולוציה שמציעה עמוד ילידי כחול, ומכאן בפרוטוקול כפי שדווח כאן לא יכול להיות מוצלח אוניוורסלי בפתרון מתחמים מובהקים עם יחידות משנה משותפות. בנימה מעודדת, היינו מצליחה להפריד שני מתחמי tetrameric דומים מאוד שיתוף שלוש יחידות משנה (M. פרדו, כתב יד בהכנה).

מאז ספקטרומטריית מסה הפכה רגישה יותר ויותר, אפילו בכמויות זעירות של interactors שאינו ספציפי ומזהמים ניתן בדגימות AP-MS. הגישה המוצגת כאן עשויה לסייע אפלית interactors אמיתי מפני זיהום רקע בתחום טיהור הזיקה ידי התמקדות תשומת הלב על חלבונים עם פסגות הגירה בקנה אחד עם פסגות הגירת פיתיון על משקל מולקולרי גבוה יותר מזה שלחלבוני monomeric.

מספר קבוצות השתמשו בטכניקות חלוקות ואחריו פרופיל מתאם חלבון להתוות קומפלקסי חלבונים בקנה מידה הסלולר ללא צורך בבידוד קודם ^{10, 11, 12, 34.} עם זאת, זה יכול לגרום לכשל לזהות אינטראקציות תת-stoichiometric. השילוב של צעד העשרה באמצעות טיהור זיקה יכול לעזור להתגבר על זה. הגישה המתוארת כאן צריכה להיות שימושית בדרך כלל בשביל לחקור את הטופולוגיה של קומפלקסים חלבוניים לפרום את המתחמים המרובים חלבון נתון לוקח חלק בתוך אותה בהקשר הסלולר. האסטרטגיה היא פשוט מקובל המעבדות כי לא יכול להיות ציוד חלוקת כרומטוגפיות יקר כדי לפתור קומפלקסי חלבונים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חלבון G Dynabeads	Life Technologies	10003D
נוגדן FLAG M2	Sigma-Aldrich	F1804
Tween-20, דרגת חלבון, תמיסה של 10%	Millipore	655206
דימתיל פימלימידאט	סיגמא-אולדריץ'	80490
0.2 M מאגר טריאתנולאמין, pH 8.2	סיגמא-אולדריץ'	T0449
3x FLAG peptide	Sigma-Aldrich	F4799
Vivaspin 5K NMWCO, PES	Sartorius	VS0112
NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel	Life Technologies	BN1001
20x NativePAGE Running Buffer	Life Technologies	BN2001
20x NativePAGE Cathode Additive	Life Technologies	BN2002
4x מאגר טעינת מדגם NativePAGE	Life Technologies	BN2003
NativeMARK	Life Technologies	LC0725
NativePAGE 5% G-250 תוסף לדוגמא	Life Technologies	BN2004
Nunc תחתון חרוטי 96 בארות, פוליפרופילן	Thermo	249944
Multiscreen HTS מערכת סינון 96 בארות	Thermo	MSDVN6550
Nunc 96 בארות טבעי	Thermo	276002
TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride)	Sigma-Aldrich	646547
יודואצטמיד	סיגמא-אולדריץ'	I1149
אצטוניטריל, HPLC כיתה	פישר סיינטיפיק	A/0627/17
טריפסין, דרגת ריצוף	Roche	11418475001
MaxQuant (תוכנה)	N.A.	נ.א.	http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
פרסאוס (תוכנה)	נ.א.	נ.א.	http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus