מאמר שיטה

איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

DOI:

10.3791/55514

⸱

9 באפריל 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University, 2Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר זיהוי מיקרוסקופיה confocal של G הקולטן חלבון בשילוב (GPCR) ההפנמה בתאי יונקים. הוא כולל את התרבות התא הבסיסי, transfection, ואת הליך מיקרוסקופיה confocal מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את לוקליזציה subcellular והפנמה של GPCR פיוז'ן-הביעו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) היא טכניקת הדמיה אופטית להדמיה בעלת ניגודיות גבוהה. זוהי גישה רבת עוצמה להמחשת חלבוני היתוך פלואורסצנטיים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כדי לקבוע את הביטוי, הלוקליזציה והתפקוד שלהם. הלוקליזציה התת-תאית של חלבוני המטרה חשובה לזיהוי, אפיון וניתוחים פונקציונליים. הפנמה היא אחד המנגנונים הדומיננטיים השולטים באיתות קולטן מצומד חלבון G (GPCR) כדי להבטיח את התגובות התאיות המתאימות לגירויים. כאן, אנו מתארים שיטה ניסיונית לאיתור לוקליזציה והפנמה תת-תאית של GPCR בתאי HEK293 במיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, ניסוי זה מספק כמה פרטים על תרבית תאים וטרנספקציה. פרוטוקול זה תואם למגוון סמנים פלואורסצנטיים זמינים באופן נרחב והוא ישים להדמיה של הלוקליזציה התת-תאית של רוב החלבונים, כמו גם להפנמה של GPCR. טכניקה זו אמורה לאפשר לחוקרים לתפעל ביעילות את ביטוי הגנים GPCR בשורות תאים של יונקים ואמורה להקל על מחקרים על לוקליזציה והפנמה תת-תאית של GPCR.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים בעלי מכונות סחר משא להובלת תאי חומרים כגון הליגנדים, מיקרואורגניזמים, מזינים, וחלבונים-אל transmembrane התא לקבלת מידע, אנרגיה, ולמטרות אחרות 1, 2. זה קריטי עבור הומאוסטזיס הסלולר, רקמות פונקציה, והישרדות תא כללית. הביטוי מבוסס תאים של חלבונים היתוך פלורסנט הינה דרך ללמוד את לוקליזציה והפנמה של קולטנים transmembrane, כגון חלבון בשילוב קולטנים G (GPCR), ב מסלולי איתות 3.

הביטוי של חלבוני היתוך מתויגים עם החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מ ויקטוריה Aequorea המדוזה, בשיל....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא הכנה

  1. התאוששות Cell
    1. העברת כליות 293 העובריים האנושיים cryopreserved (HEK293) התאים מטנק חנקן נוזלי כדי באמבט מי C 37 ° ולנער ברציפות 1 - דקה 2.
    2. להוסיף 10 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS), ו 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין) לצלחת התרבות תא 10 ס"מ. בעדינות להוסיף את התאים המופשרים למדיום גידול equilibrated.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג דוגמה של מערכת מיקרוסקופ confocal. איור 2 מציג את הביטוי של pEGFP-N1 בתאי HEK293. אות GFP זוהתה הציטופלסמה לבין הגרעין. איור 3 מראה את לוקליזציה subcellular של GnRHR מן japonica ס בתאי HEK293, עולה בקנה אחד עם התוצאות שלנו שפורסמו בעבר 15. החלבון היתוך עם תג EGFP ב C- הסופית של Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) הופיע ירוק בניסוי זה כאשר תחת CLSM.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את הלוקליזציה והפנמה התת-תאי של חלבון היתוך GPCR לידי ביטוי HEK293 תאים. הטכניקה ניתן להתאים בקלות עבור גנים רבים ושונים סוגי תאים, כגון עבור לוקליזציה הסלולר והפנמה של הקולטן corazonin מן Bombyx מורי בתאים HEK293 ו BmN 16.

היישום המוצלח של assay עצמה זו מסתמך על כמה גורמים מרכזיים. בראש ובראשונה הוא על בריאות טובה של תאים, א.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברי מאמר זה רוצים להודות לפרופ' Jiayan Xie על הסיוע הטכני והשימוש בציוד. עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41406137).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קו תאים HEK293 
DMEM/גלוקוז גבוהHycloneSH30022.01גלוקוז גבוה 4.0 מ"מ L-גלוטמין
סרום בקר עוברי (FBS)PuFei1101-100
פוספט בופר מלח (PBS)GenomGNM10010
פניצילין-סטרפטומיציןGenomGNM15140
0.25% טריפסין ו-0.02% EDTAGenom
Opti-MEM (1x)GIBCO, מאת Life Technologies31985-062מדיה מופחתת בסרום
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668027 Reagent 1
X-tremeGENE HP DNA Transfection ReagentRoche6366236001 Reagent 2
DAPI Staining SolutionBeyotimeC1006
DiIBeyotimeC1036
Antifade הרכבה בינוניתBeyotimeP0126
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)80096618
תרבית תאים 100 מ"מCORNING430167
צלחת 6 בארות ExCell BioCS016-0092
צלחת 12 בארות ExCell BioCS016-0093
כיסוי זכוכיתNEST801007
מיקרוסקופ שקופיותCitoglas10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 IncubatorThermo3111
TCS SP5II סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקליLeica 
GNM252005100001311

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
  2. Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
  3. Kallal, L., Benovic, J. L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GPCRHEK293

מאמרים קשורים