איתור של הפנמת קולטן מצמיד חלבון G-מופעל ליגנד ידי מיקרוסקופי Confocal

סיכום

פרוטוקול זה מתאר זיהוי מיקרוסקופיה confocal של G הקולטן חלבון בשילוב (GPCR) ההפנמה בתאי יונקים. הוא כולל את התרבות התא הבסיסי, transfection, ואת הליך מיקרוסקופיה confocal מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את לוקליזציה subcellular והפנמה של GPCR פיוז'ן-הביעו.

תקציר

מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) היא טכניקת הדמיה אופטית להדמיה בעלת ניגודיות גבוהה. זוהי גישה רבת עוצמה להמחשת חלבוני היתוך פלואורסצנטיים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), כדי לקבוע את הביטוי, הלוקליזציה והתפקוד שלהם. הלוקליזציה התת-תאית של חלבוני המטרה חשובה לזיהוי, אפיון וניתוחים פונקציונליים. הפנמה היא אחד המנגנונים הדומיננטיים השולטים באיתות קולטן מצומד חלבון G (GPCR) כדי להבטיח את התגובות התאיות המתאימות לגירויים. כאן, אנו מתארים שיטה ניסיונית לאיתור לוקליזציה והפנמה תת-תאית של GPCR בתאי HEK293 במיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, ניסוי זה מספק כמה פרטים על תרבית תאים וטרנספקציה. פרוטוקול זה תואם למגוון סמנים פלואורסצנטיים זמינים באופן נרחב והוא ישים להדמיה של הלוקליזציה התת-תאית של רוב החלבונים, כמו גם להפנמה של GPCR. טכניקה זו אמורה לאפשר לחוקרים לתפעל ביעילות את ביטוי הגנים GPCR בשורות תאים של יונקים ואמורה להקל על מחקרים על לוקליזציה והפנמה תת-תאית של GPCR.

מבוא

תאים בעלי מכונות סחר משא להובלת תאי חומרים כגון הליגנדים, מיקרואורגניזמים, מזינים, וחלבונים-אל transmembrane התא לקבלת מידע, אנרגיה, ולמטרות אחרות ^{1, 2.} זה קריטי עבור הומאוסטזיס הסלולר, רקמות פונקציה, והישרדות תא כללית. הביטוי מבוסס תאים של חלבונים היתוך פלורסנט הינה דרך ללמוד את לוקליזציה והפנמה של קולטנים transmembrane, כגון חלבון בשילוב קולטנים G (GPCR), ב מסלולי איתות ^3.

הביטוי של חלבוני היתוך מתויגים עם החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מ ויקטוריה Aequorea המדוזה, בשילוב עם טכניקות גילוי קרינה ישירה, צבר הסכמה רחבה לגבי מיקוד חלבון מחקר ^{4, 5, 6.} detecti GFP המבוססיש על היתרון של מתן אפשרות הדמיה בזמן אמת של תאים חיים, תוך הימנעות חפצים קיבוע ^7. סדרת וקטורי שיבוט תכליתיים נבנתה כדי להקל על הביטוי בשילובי חלבון ה- GFP בתאים שונים ^{8, 9.} וקטור pEGFP-N1 הוא וקטור הפלסמיד בשימוש נרחב ממוסחר קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP), אשר עבר אופטימיזציה מן GFP מהסוג פרא על קרינה בהירה ביטוי גבוה בתאי יונקים. כדי לבחון את אות הניאון של EGFP לידי ביטוי בתאי יונקים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי צריך להתנהל עם עירור ב 488 ננומטר ואת פליטת ב 507 ננומטר, רצוי עם מיקרוסקופיה confocal.

ניטור לוקליזציה subcellular והפנמה בתיווך ליגנד של קולטנים היא טכניקה נפוצה לחקור את האות התמרה והתפקוד של GPCRs ¹⁰ עד>, ^11. ברוב המקרים, הפנמה מובילה הקהיה של GPCRs (ההנחתה של תגובת הגירוי למרות הנוכחות של אגוניסטים) ^{12, 13.} הקולטנים הפנימו ניתן לשלב לתוך הליזוזום והשפילו, או שהם יכולים להיות ממוחזרים חזרה אל פני התא, בהתאם לאופי של קולטנים ואת שורות תאים המשמשים בניסויים.

הקולטנים להורמון משחרר גונדוטרופין (GnRHRs) שייכים למשפחת GPCR ויש לי מבנה החלבון GPCR טיפוסית, עם מסוף אמינו-תאי, מסוף -COOH תאיים, ושבעה transmembrane (TM) תחומים ^14. Transfection של Sj פלסמיד רקומביננטי GnRHR-EGFP (עם הגן GnRHR מן japonica Sepiella) ואת זיהוי מיקרוסקופיה confocal של GnRHR SJ-tagged EGFP (שבאה לידי ביטוי HEK293 תאים) נמסר לשנים הקודמותערמומי, ואת הקרינה GFP הוקמה ככתבת עבור מבחני לוקליזציה חלבון טראנסממברנלי ^15. עכשיו, הפנמת Sj GnRHR, מופעל על ידי הורמון גונדוטרופין-שחרור japonica ס (Sj GnRH), הודגמה נימוסים הזמן- ו תלוי מינון על ידי מיקרוסקופ confocal.

פרוטוקול

1. תא הכנה

1. התאוששות Cell
   1. העברת כליות 293 העובריים האנושיים cryopreserved (HEK293) התאים מטנק חנקן נוזלי כדי באמבט מי C 37 ° ולנער ברציפות 1 - דקה 2.
   2. להוסיף 10 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated (בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS), ו 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין) לצלחת התרבות תא 10 ס"מ. בעדינות להוסיף את התאים המופשרים למדיום גידול equilibrated.
   3. דגירה התאים בתוך חממה CO ₂ במים במעיל C 37 ° עם אווירה humidified המכיל% באוויר 95% ו 5 CO ₂ עבור 2 - h 4.
   4. לאחר 2 - 4 h, לבדוק כי התאים מחוברים. החלף את מדיום הגידול equilibrated ותרבות עבור 24 אחר - 48 h.
      הערה: שינוי המדיום צמיחה equilibrated שימושי משום שהוא מסיר sulfoxide דימתיל (DMSO) ומגן מפני נזק לתאים.
2. <מעבר strong> סלולרי
   1. אחרי 24 - 48 h, כאשר התאים גדלו ל המפגש הקרוב, להשליך את מדיום הגידול equilibrated לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS). מערבולת את המנה בעדינות.
   2. בטל PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (מלוחים, 0.25% טריפסין, ו 0.02% EDTA). כדי לגמרי לעכל את התאים, לערבל את המנה בזהירות לשאוב את הפתרון טריפסין- EDTA. שים את צלחת בחממה CO ₂ במים במעיל C 37 ° עבור 3 דקות.
      הערה: במהלך תקופה זו, להכין שלוש מנות תרבית תאים חדשים 10 ס"מ ומוסיפים 10 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated לכל.
   3. באמצעות מיקרוסקופ אור, לקבוע אם התאים נוקפים מהעומק של המנה. להוסיף 2 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated עד המנה. מערבבים על ידי pipetting ומיד pipet 0.6 מ"ל של ההשעיה תא לכל אחד את הכלים החדשים. לערבב בעדינות על ידי pipetting ולאפשר לתאים כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO _2.

2. זריעת תאים

1. אחרי 24 - 48 h, כאשר התאים passaged גדלו ל המפגש הקרוב, להשליך את מדיום הגידול equilibrated לשטוף את התאים עם 2 מ"ל של PBS. מערבולת את המנה בעדינות.
2. בטל PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA. כדי לגמרי לעכל את התאים, לערבל את המנה בזהירות לשאוב את טריפסין-EDTA. שים את צלחת בחממה CO ₂ במים במעיל C 37 ° עבור 3 דקות.
   הערה: במהלך תקופה זו, להכין צלחת 6-היטב על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated היטב כל אחד.
3. להוסיף 1 מיליליטר של מדיום גידול equilibrated כדי בצלחת, אם, תחת השגחה מיקרוסקופית, לתאים נוקפים מלמטה המנה. מערבבים על ידי pipetting ומיד pipet 0.1 מ"ל של תרחיף תאים (נפח מותאם לפי צפיפות צמיחת תאים) היטב בכל צלחת 6-מוכן היטב (תא-פחות צלחת 6-היטב עם 2 מ"ל של מדיום הגידול equilibrated). לערבב בעדינות על ידי pipetting ולאפשר לתאיםכדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO _2.

3. Transfection התא

1. שיטת Transfection 1, עם ניסוחים ליפוזום
   הערה: אנא ראה טבלה של חומרים עבור transfection מגיב 1.
   1. למחרת, להבטיח כי תאים חייבים להיות 85 - 95% ומחוברות.
   2. להוסיף 3 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (500 ng / μL) ו 100 μL של התקשורת סרום מופחת צינור microcentrifuge סטרילי, ומערבבים בעדינות. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   3. כן 9 μL של מגיב 1 ו 100 μL של תקשורת סרום המופחתת ב צינור אחר microcentrifuge, ומערבבים בעדינות. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. מערבבים את תערובת פלסמיד מדולל עם בדילול מגיב 1 (הנפח הכולל = 215 μL). מערבבים בעדינות דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. לשאוב בינוני מהצלחת תאים בתרבית, ולהוסיף 1.5 מ"ל DMEM טריים ללא FBS.
   6. הוספת 215 μL של DNA-transfשיקוף תערובת מגיב לכל dropwise היטב, ומערבבים בעדינות על ידי מתערבל את הצלחת.
   7. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO ₂ עבור 4 - h 8. החלף עם DMEM טרי עם 10% FBS.
   8. דגירת תאים ב 37 ° C ו 5% CO ₂ עבור 24 אחר - 48 שעות לפני הפעלת ניסויים כלשהם.
2. שיטת Transfection 2, עם ניסוחים ליפוזום
   הערה: אנא ראה טבלה של חומרים עבור transfection מגיב 2.
   1. להוסיף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (500 ng / μL), 4 μL של מגיב 2, ו 100 μL התקשורת סרום מופחת לתוך צינור microcentrifuge סטרילית. מערבבים בעדינות דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. מוסיפים את תערובת transfection לתאים באופן dropwise.
   3. לאחר transfection, דגירה תאים עבור 24 - 48 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2, לפני הפעלת ניסויים כלשהם.

4. תרבית תאים על מכסה מחליק

1. מִחָדָשׁלהזיז את מדיום הגידול מהצלחת 6-גם תרבות.
2. לשטוף monolayer התא עם 1 מ"ל של PBS ללא סידן ומגנזיום.
3. להוסיף 0.5 מ"ל טריפסין- EDTA. מערבולת את המנה בזהירות לשאוב את טריפסין-EDTA. דגירה את צלחת התרבות עבור 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO _2. זמן הדגירה בפועל משתנה עם שורת תאים המשמשים.
   הערה: במהלך תקופה זו, להכין צלחת 12-היטב חדשה ולהוסיף 15 מ"מ קוטר כיסוי סטרילי מחליק היטב כל אחד. מכסה מחליק מצופה ליזין, laminin, או קולגן עשוי לשפר מצורף תא לתאים HEK293 כי לנתק בקלות.
4. כאשר תאים מנותקים, להוסיף מיליליטר 1 מחומם מראש בינוני צמיחה מלא בכל טוב. מערבבים על ידי pipetting ומיד להעביר את המספר הדרוש של תאים הצלחת 12-היטב עם מכסה מחליק. הוסף בינוני צמיחה שלם טרי היטב כל להתאים את הנפח הכולל של 1 מ"ל
5. דגירת התאים במשך 16 - 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2.
   הערה: לאחר 30 -60 דקות, רוב התאים יהיה דבקו תלושי כיסוי סטרילי.

5. איתור מיקרוסקופי Confocal

1. לוקליזציה הסלולר
   1. אחרי 16 - 24 שעות, כאשר התאים גדלו ל המפגש הקרוב על מכסה מחליק סטרילי בצלחת 12-היטב, להוסיף את החללית קרום, DiI, זה טוב, נותן ריכוז סופי של 5 מיקרומטר. אפשר התאים כדי לדגור על 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO _2.
   2. אחרי 30 דקות, להסיר את מדיום הגידול equilibrated לשטוף את התאים פעמיים PBS קר (2 - 8 ° C).
   3. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) זה טוב. בעדינות להתסיס במשך 15 דקות.
      זהירות: Paraformaldehyde רעיל בינוני ידי עור במגע או שאיפה, ויועד קרצינוגן אדם סביר. כימיקלים מקטרים ​​ברדסים, מתחמי איזון פרקו או אמצעים אחרים יש להשתמש במהלך במשקל וטיפול paraformaldehyde.
   4. לשטוף את התאים הקבועים פעמים PBS. להוסיף 200-300 μL של DAPI (4' , 6-diamidino-2-phenylindole) פתרון (0.5 מיקרוגרם / מ"ל) לכל היטב דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. שוטפים את התאים פעמיים עם PBS. מוציאים בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת של הרכבה בינונית (50% v / v גליצרול / מים). הסר בינוני הרכבה עודף השקופיות.
2. הפנמה ניידת
   1. אחרי 16 - 24 שעות, כאשר התאים גדלו ל המפגש הקרוב על מכסה מחליק סטרילי בצלחת 12-היטב, להסיר את מדיום הגידול equilibrated ולהוסיף טרי, מחומם DMEM בינוני (37 מעלות צלזיוס). דגירה התאים עבור 1 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2.
   2. פנקו את התאים עם ריכוזים שונים (0, 10 ^-12, 10 ^-9, ו 10 ^-6 M) של ליגנד עבור 30 דקות ולהתייחס אליהם 10 ליגנד ^-6 M לזמנים שונים (0,10, 30, ו 60 דק ').
   3. פעמיים לשטוף התאים קר PBS (2 - 8 ° C). תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (ב PBS) זה טוב. בעדינות להתסיס במשך 15 דקות.
   4. שוטפים את התאים פעמיים PBS. מוציאים בזהירות את מכסה מחליק מהצלחת הפתיל את PBS עודף. הפוך על שקופיות מיקרוסקופ עמוסה טיפה אחת של הרכבה בינונית (50% v / v גליצרול / מים). הסר בינוני הרכבה עודף השקופיות.
3. מיקרוסקופיה
   1. הפעילו את החומרה של מיקרוסקופ confocal, כולל כוח מנורת כספית, מיקרוסקופ PC, סורק, לייזר. היכנסו לערוץ מערכת ההפעלה, להפעיל את התוכנה, לבדוק את התצורה ובחר לייזר. הפעל את היחידות השונות של מערכת מיקרוסקופיה confocal בצו על פי הוראות.
   2. מניח את השקופיות שהוכנו על במת מיקרוסקופ. מקם את המדגם על העדשה האובייקטיבית שימוש בבקר הבמה. להוסיף טיפה אחת של שמן ארז עלכדי coverslip כאשר נבחרה עדשת טבילת שמן. מניחים את מכסה מחליק על מגלשות מול העדשה.
   3. מצא את התאים של עניין תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   4. החלף לסרוק במצב. בחר את כוח לייזר בטווח הספקטרום של fluorophore פליטה. צלמו את התמונות confocal באיכות גבוהה על ידי עוצמת הלייזר כוונון ופרמטרים נוספים.

תוצאות

איור 1 מציג דוגמה של מערכת מיקרוסקופ confocal. איור 2 מציג את הביטוי של pEGFP-N1 בתאי HEK293. אות GFP זוהתה הציטופלסמה לבין הגרעין. איור 3 מראה את לוקליזציה subcellular של GnRHR מן japonica ס בתאי HEK293, עולה בקנה אחד עם התוצאות שלנו שפורסמו בעבר ^15. החלבון היתוך עם תג EGFP ב C- הסופית של Sj GnRHR (Sj GnRHR-EGFP) הופיע ירוק בניסוי זה כאשר תחת CLSM...

דיון

הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה יעילה ובקלות לפירוש לזהות את הלוקליזציה והפנמה התת-תאי של חלבון היתוך GPCR לידי ביטוי HEK293 תאים. הטכניקה ניתן להתאים בקלות עבור גנים רבים ושונים סוגי תאים, כגון עבור לוקליזציה הסלולר והפנמה של הקולטן corazonin מן Bombyx מורי בתאים HEK293 ו BmN ^16.

היישום המוצלח של assay עצמה זו מסתמך על כמה גורמים מרכזיים. בראש ובראשונה הוא על בריאות טובה של תאים, א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאים HEK293
DMEM/גלוקוז גבוה	Hyclone	SH30022.01	גלוקוז גבוה 4.0 מ"מ L-גלוטמין
סרום בקר עוברי (FBS)	PuFei	1101-100
פוספט בופר מלח (PBS)	Genom	GNM10010
פניצילין-סטרפטומיצין	Genom	GNM15140
0.25% טריפסין ו-0.02% EDTA	Genom
Opti-MEM (1x)	GIBCO, מאת Life Technologies	31985-062	מדיה מופחתת בסרום
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen		11668027 Reagent 1
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent	Roche		6366236001 Reagent 2
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Antifade הרכבה בינונית	Beyotime	P0126
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)	80096618
תרבית תאים 100 מ"מ	CORNING	430167
צלחת 6 בארות	ExCell Bio	CS016-0092
צלחת 12 בארות	ExCell Bio	CS016-0093
כיסוי זכוכית	NEST	801007
מיקרוסקופ שקופיות	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubator	Thermo	3111
TCS SP5II סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica