הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט

9.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55558

⸱

28 במרץ 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת מטבוליטים מ סטפילוקוקוס והניתוח הבא שלהם באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ו ספקטרומטריית מסה.

תקציר

במאמץ לסכל חיידקים פתוגנים, מארחים קרובים להגביל את הזמינות של חומרים מזינים באתר של זיהום. הגבלה זו יכולה לשנות את שכיחותם של מטבוליטים מפתח אשר גורם רגולטוריים להגיב, התאמת חילוף חומרים תאיים. בשנים האחרונות, מספר החלבונים ו- RNA צמח כמו רגולטורים חשובים של ביטוי גנים ארסיים. לדוגמה, החלבון Cody מגיב רמות של חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP ו נשמרת נרחב חיידקים G + C גראם חיובי נמוך. כרגולטור עולמי Staphylococcus aureus, Cody שולט הביטוי של עשרות ארסיות וגני מטבולית. אנו משערים כי S. aureus משתמשת cody, בין השאר, כדי לשנות מצב מטבולי שלה בניסיון להסתגל לתנאים מגבילים-מזין נתקלו פוטנציאלי בסביבה המארח. כתב יד זה מתאר שיטה לחילוץ וניתוח מטבוליטים מ S. aureus באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מפרט מוניתtrometry, פרוטוקול אשר פותח על מנת לבחון השערה זו. השיטה גם מדגישה מומלצת שיבטיחו הקפדת שחזור, כגון שמירה על מצב יציב ביולוגי אוורור קבוע ללא שימוש בתרבויות chemostat רציפות. ביחס aureus USA200 ס רגיש ל- methicillin לבודד UAMS-1 זן הורי, מוטצית Cody isogenic הציגה עליות משמעותיות חומצות אמינו הנגזרות aspartate (למשל, תראונין ואיזולויסין) וירידות קודמיהם (למשל, אספרטט ו- O -acetylhomoserine ). ממצאים אלה תואמים היטב עם נתוני תעתיק שהושגו עם ניתוח RNA-seq: גנים במסלולים אלה היו למעלה מוסדרים בין 10 ו 800 של פי מוטצית Cody null. צימוד ניתוחים הגלובליים של transcriptome ואת metabolome יכול לחשוף כמה חיידקים לשנות את חילוף החומרים שלהם כאשר הוא מתמודד עם לחץ סביבתי או תזונתי, המספק תובנה פוטנציאל לתוך להתעמלותשינויים iological הקשורים דלדול מזין חוו במהלך זיהום. תגליות אלה עשויות לסלול את הדרך לפיתוח תרופות נוגדת זיהום ואת הרומן.

מבוא

חיידקים פתוגנים חייבים להתמודד עם אתגרים רבים בתוך הסביבה המארחת. בנוסף התקפה ישירה על ידי תאי מערכת חיסון, המארח גם sequesters מזינים חיוניים להישרדות שכפול חיידקים, יצירת חסינויות תזונתיות 1, 2. כדי לשרוד בסביבה העוינת אלה, חיידקים פתוגנים לפרוס גורמים ארסיים. חלק מגורמים אלה מאפשרים החיידק להתחמק התגובה החיסונית; גורמים אחרים כוללים מופרש אנזימי עיכול, כגון hyaluronidase, thermonuclease, וטריפז, אשר עשוי לאפשר לחיידקים לחדש מזינים חסרים על ידי צריכת מרכיבים שמקורם ברקמה 3, 4, 5. ואכן, חיידקים התפתחו מערכות רגולטוריות שקושרים את המצב הפיזיולוגי של התא לייצור של גורמים בחיידק הגורם 6, 7, עד class = "Xref"> 8, 9, 10.

גוף גדל והולך של ראיות מצביע Cody כרגולטור קריטי המקשר חילוף חומרים ואת ארסיות. למרות גילו לראשונה subtilis Bacillus בתור מדכא של permease dipeptide (DPP) גן 11, קודי הוא ידוע כיום להיות מיוצר על ידי כמעט כל החיידקים G + C נמוך גראם חיובי 12, 13 ו מסדיר עשרות גנים המעורבים פחמן חנקן המטבוליזם 14, 15, 16, 17, 18, 19. במינים פתוגניים, Cody שולט גם הביטוי של כמה גנים הארסיים החשובים 20, 21,. EF "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 קודי מופעל בתור חלבון קושר DNA על ידי שתי כיתות של הליגנדים: חומצות אמינו מסועפות שרשרת (BCAAs; ואיזולויסין, לאוצין, ו- וואלין [ILV]) ו GTP . כאשר מזין אלה נמצאים בשפע, Cody מדחיק (או במקרים מסוימים, מגרה) תעתיק. כמו חומרים מזינים אלו הופכים מוגבלים, פעילות Cody מצטמצמת בהדרגה, ומביא לתגובת תעתיק מדורגת כי חישוב מחדש של מסלולים מבשרים דרך מסלולי מטבוליים שונים הקשורים למטבוליזם מרכזי 28, 29, 30.
כרומטוגרפיה נוזלית טנדם מצמידים ספקטרומטריית מסה (LC-MS) הינה טכניקה שיכולה לזהות במדויק ולכמת מטבוליטים תאיים-מולקולה קטנה 31. כאשר יחד עם transcניתוח riptome (למשל, RNA-seq), עבודה אנליטית זה יכול לספק תובנות לגבי השינויים הפיסיולוגיים המתרחשים בתגובה לעקה סביבתית או תזונתית. כאן, אנו מציגים שיטה להפקת המטבוליט מתאי סטפילוקוקוס וניתוח שלאחר מכן באמצעות LC-MS. גישה זו נעשה שימוש כדי להדגים את ההשפעות pleiotropic של Cody על הפיזיולוגיה aureus S..

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תמיסות בופר

  1. כן פוספט שנאגר מלוח (PBS; pH 7.4) על ידי דילול פתרון מניות של 10x PBS לריכוז סופי של 1X עם ultrapure (מזוקק ללא יונים) מים.
  2. הכן פתרון מרווה ידי שילוב 2 מ"ל של אצטוניטריל, 2 מ"ל של מתנול, 1 מ"ל של ultrapure H 2 O, ו 19 μL (0.1 ריכוז סופי מ"מ) של חומצה פורמית.
  3. כן LC-MS ממס A על ידי הוספת חומצה פורמית ([v / v] 0.2% ריכוז סופי) כדי מי ultrapure.
  4. כן B ממס LC-MS-ידי הוספת חומצה פורמית ([v / v] 0.2% ריכוז סופי) כדי acetonitrile.
    הערה: כל הפתרונות צריכים להיות מוכנים באמצעות ריאגנטים הגבוהה ביותר טוהר זמין (כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים בדרך כלל כיתה). פתרונות יש להכין טרי לפני כל ניסוי ומאוחסן על קרח לפני השימוש.

2. הקמת צמיחת aureus היציבה S.

  1. Streak ס aureuזנים של בעלי עניין עבור בידוד על אגר סויה tryptic (TSA) ממלאי גליצרול קפוא. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 16-24 שעות.
  2. לחסן 4 מ"ל של מרק סויה tryptic (TSB) או אחר בינוני מתאים צינורות הדגירה זכוכית סטרילית עם מושבות אחת של כל זן. דגירה נוטה (~ 70 ° זווית) עם סיבוב ב 60 סיבובים לדקה (סל"ד) בשעה 37 מעלות צלזיוס למשך 16-20 שעות.
    הערה: תרבויות לילה נוטים הדרגתיים חמצן בעת ​​שימוש בשיטות סטנדרטיות, כולל אלה המתוארים בשלב 2.2, אשר משפיעים הפיזיולוגיה הסלולר. לפיכך, אנו מעסיקים אסטרטגית גב דילול מרובה כדי להבטיח מצב יציב ביולוגי (ראה צעדים 2.4-3.2, להלן).
  3. השתמש ספקטרופוטומטר למדידת צפיפות אופטית של תרבויות משלב 2.2 ב 600 ננומטר (OD 600). השתמש בינוני סטרילי כהפניה אופטית (ריק). לדלל תאים אלה כדי OD 600 של 0.05 ב 50 מ"ל של מדיום TSB סטרילי (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס) ב נפרדת, 250 בקבוקונים מ"ל DeLong.
  4. Incuבייט התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם רועד ב 280 סל"ד.
  5. כל 30 דק ', לקחת OD 600 מדידות; כמו הצפיפות האופטית להגדיל, זה עשוי להיות נחוץ כדי לדלל את התרבויות עם TSB, כך שהם יישארו בטווח הספיג ליניארי של ספקטרופוטומטר.
  6. כאשר תרבויות משלב 2.5 להשיג OD 600 של ~ 0.8-1.0, תת אותם לתוך 50 מ"ל של 37 ° C TSB ל OD 600 של 0.01-0.05 וחזור על שלבים 2.4 ו 2.5.

3. הגדרת אוסף דוגמאות

  1. כן מצע הקרח יבש כתוש בתוך כלי מתאים (למשל, צלחת זכוכית, דלי קרח, או מצנן).
  2. כמו הצפיפות האופטית של התרבויות מתקרבת לנקודת הקציר הרצויה, להוסיף 1 מיליליטר של מרווית פתרון בצלחת 35 מ"מ מטופל פטרי טרום מגניב על קרח יבש ≥5 דקות.
    הערה: "נקודת הקציר הרצויה" תשתנה בהתאם מטרות ניסוי. לדוגמא, אם אחד היה לבחון מטרetabolites במהלך צמיחה אירובית, אינדיקטורים מרכזיים של המדינה הזאת כוללים הפרשה תצטט מחדש התבוללות של אצטט במהלך שלב הצמיחה שלאחר מעריכי 32, 33. באופן כללי, בשלב זה צריך להיות בתוך במת צמיחה ספציפית (למשל, שלב מעריכים). הערכים הספציפיים OD 600 הקשורים בשלב זה עשויים להשתנות בין זני חיידקים שונים בתקשורת צמיחה.
  3. מניחים frit מסנן נירוסטה (טרום צונן כדי -20 ° C) בתוך פקק גומי ולמקם אותו על גבי תֶרמוֹס מחובר משאבת ואקום או ואקום הבית.
  4. החל את הוואקום ולמקם קרום אסתר תאית מעורב (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) על גבי.
    הערה: חשוב מאוד להשתמש במסנן בקוטר שווה לזה של frit ולמרכז זה מסנן כראוי כדי להבטיח כי המדגם הוא נמשך דרך המסנן ולא מעבר לקצה. הרטבת הממברנה עם קר כקרח, סטרילי H 2 O עשויה לעזורעם מיצוב הממברנה.

4. לדוגמא קציר

  1. בשעה OD של 600 ~ 0.4-0.5, להשתמש פיפטה סרולוגיות להסיר 13 מ"ל של תרבות מהצפחת כדי להחיל את המדגם כדי המסנן.
  2. לאחר המדגם כולו סוננה, מיד לשטוף את המסנן עם ≥5 מ"ל של PBS קר כקרח לשטוף מטבוליטים הקשורים בינוני.
  3. נתק את הוואקום ולהשתמש פינצטה סטרילית כדי להסיר את המסנן מן frit. הפוך את המסנן (תא בצד למטה) לתוך התמיסה להרוות טרום צוננת.
    הערה: חשוב לבצע את הפעולות הנ"ל במהירות (כלומר, בתוך שניות) וברגע הנוזל הוסר כדי להבטיח את המרווה המהירה של התאים, עצר פעילות מטבולית.
  4. דגירה המסננת בתמיסה להרוות על קרח יבש ≥20 דקות.
  5. בעזרת פינצטה סטרילי, להפוך את המסנן (עד התא בצד) בצלחת פטרי ולהשתמש micropipette כדי לשטוף את התאים מעל tהוא הממברנה לתוך הפתרון להרוות.
  6. Re-השעה את התאים בתמיסה להרוות ולאחר מכן להעביר את השעית תא צינור מיליליטר 2 סטרילי השפעה עמיד המכיל ~ 100 μL של חרוזי סיליקה 0.1 מ"מ. בחנות זו על קרח יבש או -80 מעלות צלזיוס.

5. הפקת המטבוליט

  1. דגימות להפשיר על קרח רטוב לשבש את תאי homogenizer עם ארבע התפרצויות 30 שניות על 6000 סל"ד, עם 2 תקופות צינון דקות על קרח יבש בין מחזורים.
  2. להבהיר את lysates עבור 15 דקות ב microcentrifuge טרום צונן, בקירור במהירות המרבית (כלומר, 18,213 XG ב C ° ≤4).
  3. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge נקי.
  4. שימוש micropipette, להעביר חלק קטן מהמדגם צינור microcentrifuge עבור כימות של התוכן פפטיד שיורית צעד 6; לאחסן את השארית ב -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: היקף מדגם שמורות משתנה, תלוי assay BCA בשימוש בשלב 6.1. זֶההמדגם צריך להיות מאוחסן על קרח רטוב לניתוח מיידי או קפוא ב -80 מעלות צלזיוס.

Assay 6. Bicinchoninic חומצה (BCA)

  1. בצע assay BCA כפי מומלץ על ידי יצרן הערכה, באמצעות דגימות משלב 5.4 כדי לקבוע את ריכוז הפפטיד שיורי עבור כל דגימה.

7. LC-MS

  1. מערבבים 75 μL של ס תמצית aureus עם 75 μL של LC-MS הממס B, מוכן בשלב 1.4.
  2. וורטקס לערבב ספין על 13,000 XG במשך 5 דקות.
  3. מניחים 100 μL של supernatant לתוך כרומטוגרפיה נוזלית (LC) הבקבוקון מכסה אותו. ודא כי אין בועות אוויר לכודות במדגם.
  4. טען את מבחנות LC על autosampler LC-MS ולערוך את רשימת ריצה בתוכנה "עורך Worklist מנותק."
    1. מלא את "שם לדוגמא" (למשל, wild-type-1), "עמדה לדוגמא" (למשל, P1-A1), "שיטה" (למשל, נמליםCID-שלילי שיטה), ו "קובץ נתונים" (למשל, עמודות מסוג פרא-1). לחץ על כפתור "שמור Worklist" כפתור. פתח את תוכנת "Workstation קליטת נתונים ספקטרומטריית מסה" והזן את worklist שנשמר בעבר. לחץ על כפתור "Run Worklist התחל" כדי להתחיל את המדידה LC-MS רציפה.
  5. הפרד את הדגימות על עמודה, לקשר את עמודת זמן הטיסה (TOF) ספקטרומטר, ומשלב ספקטרומטר TOF עם מערכת LC. השתמש שיפוע נייד פאזי כדלקמן: 0-2 דק ', 85% B ממס; 3-5 דק ', 80% B ממס; 6-7 דק ', 75% B ממס; 8-9 דק ', 70% B ממס; 10-11.1 דקות, 50% B ממס; 11.1-14 דקות, 20% B ממס; ו 14.1-24 דקות, 5% B ממס; להסתיים תקופת 10 דקות מחדש איזון ב B 85% ממס בשיעור זרימת -1 0.4 מ"ל min.
  6. באמצעות משאבת isocratic, להשרות פתרון המוני הפניה עם הריצה כדי לאפשר כיול ציר סימולטני המוני.
    הערה: זה צעדמבוסס על במדריך TOF ספקטרומטר סטנדרטי.
    1. השתמש בתערובת של חומצה אצטית D4 ו- hexakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine כפתרון המונית הפניה לביצוע כיול בזמן אמת. השתמש במשאבה isocratic עם קצב הזרימה של דק 2.5 מ"ל -1 עבור עירוי.

8. תיקון אצווה של רוזני יון

  1. ציין בכל אחת מהדוגמאות כדי לשמש דוגמה התייחסות תיקון אצווה (למשל, wild-type, לשכפל 1).
  2. חשב את הסכום של ספירת יון לכל מטבוליטים בתוך מדגם התייחסות. חזור על חישוב זה עבור כל הדגימות.
  3. מחלק את ספירת היון הכוללת של כל דגימה על ידי ספירת היון הכוללת של מדגם ההתייחסות ליצור יחס.
  4. מחלק את ספירת היון לכל המטבוליט בתוך מדגם ידי היחס המדגם / ההפניה להשיג ספירת יון תצווה-מתוקן לכל המטבוליט.

9. פפטיד נורמליזציה

  1. Divide ערכי ספירת יון אצווה תיקן עבור כל דגימה שהושגו בשלב 8 על ידי ריכוז הפפטיד נקבע עם assay BCA בשלב 6 להניב ערך מנורמל עבור כל המטבוליט.
    הערה: ספירת יון תיקן המנורמלת, יצווה-תצווה עבור כל המטבוליט שהושג בשלב 9.1 ניתן להשוות באופן ישיר בין זנים ו נתון ניתוח סטטיסטי (למשל, מאן-ויטני U -test). לחלופין, מטבוליט הידוע להיות ללא שינוי או על ידי הטיפול או רקע גנטי עשויים לשמש מנרמל כדי לזהות שינויים עקב המטבוליט פירוק. הכללת כמות ידועה של L-norvaline או חומצה gluraric במאגר החילוץ יכול לשמש כדי לתקן הפסד במהלך מדגם עיבוד 34.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתחנו בריכות המטבוליט תאיים ב S. aureus במהלך הצמיחה במבחנה במדיום עשיר, מורכב. כהוכחה עקרוני, השווינו פרופילים המטבוליט בין אוסטאומיאליטיס aureus methicillin-רגישים ס לבודד UAMS-1 (wild-type [WT]) וכן זן isogenic חסר הרגולטור תעתיק העולמי Cody (Δ Cody) 26. מצב יציב, תרבויות מעריכים של זני WT והקודים הוקמו במדיום TSB, כמתואר בשלב 2 של הפרוטוקול. התנהגות הצמיחה של wild-ty...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כל מטבוליטים המולקולות קטנות מחוברים זו לזו באמצעות מקורותיה המשותפים שלהם מסלולי מטבוליים מרכזיים. במהלך גידול מעריכי, תאי חיידקיים הם על מצב יציב ביולוגי מטבוליות, מתן תמונת מצב של המצב הפיזיולוגי בתנאים ספציפיים. Cody מפקחת הסתפקות מזין ידי היענות ILV ו GTP. כפי ILV ושחרר ברכות GTP, פעילות Cody מצטמצמת סיכוי בהדרגה, התאמת ביטוי גני היעד שלה להסתגל הגדלת מזין דלדול 30. זן Cody לקוי מתנהג כאילו ILV ו GTP מתרוקנים מהסביבה אלא רק מציג הבדל מאוד מתון יחסית הת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מסלול NIH כדי פרס העצמאות (להעניק GM 099,893) וקרנות ההפעלה הסגל כדי SRB, כמו גם גרנט פרויקט מחקר (להעניק GM 042,219). הממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף הנתונים לפרשנות, או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומר/ציודa
DeLong Culture Flask (250 מ"ל)Belco2510-00250
בקבוק זרוע צד, 500 מ"לPyrex5340
פקק גומי 3 חורים, #7Fisher14-131E
מחזיק מסנן נירוסטה/פריטVWR89428-936
צלחת פטרי, 35 מ"מקורנינג430588לא מטופל בתרבית רקמות
קרום אסטר תאית מעורבת, 0.22 μ m גודל נקבוביותMilliporeGSWP02500
צינורות עמידים בפני פגיעות, 2 מ"לUSA Scientific1420-9600
חרוזי סיליקה, 0.1 מ"מBiospec Products Inc11079101Z
Precellys 24 הומוגנייזרBertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
ערכת בדיקת חלבון Micro BCAפירס (תרמו מדעי)23235
Cogent Diamond hydride סוג C עמודהAgilent70000-15P-2
זמן טיסה מדויק מסה (TOF) LC-MS, משאבת Quat Agilent G6230B
, סדרת 1290AgilentG4204A 
משאבת פח, סדרה 1290AgilentG4220A 
כונן שסתומים, סדרת 1290AgilentG1107A 
משאבה איזוקרטית, סדרת 1290AgilentG1310B 
TCC, סדרת 1290AgilentG1316C 
סמפלר, סדרת 1290AgilentG4226A 
תרמוסטט, סדרת 1290AgilentG1330B 
<חזק>כימי
מרק סויה טריפטיבקטון דיקינסון211825
אגר דיפקו, בקטון מגורעןדיקינסון214530חומר מוצק מכיל 1.5% [w/v] אגר
תמיסת מלח חוצצת פוספט (pH 7.4) 10xAmbionAM9624מדלל טרי עד פי 1 עם מים טהורים במיוחד
אצטוניטרילפישר סיינטיפיקA955-500אופטימה LC-MS
מתנולפישר סיינטיפיקA456-500אופטימה LC-MS;
חומצה פורמיתסיגמא אולדריץ'94318לספקטרומטריית מסה, 98%
<חזק>תוכנה
MassHunterAgilentG3337AA
זן חיידקי חזק><חזק<חזק>מין<חזק>זן<חזק>גנוטיפ
SRB 337סטפילוקוקוס זהובUSA200 MSSA UAMS-1סוג בר
SRB 372סטפילוקוקוס זהובUSA200 MSSA UAMS-1&דלתא; codY::erm
aכימיקלים וחומרים המפורטים הם ספציפיים לשיטה המתוארת ואינם כוללים כימיקלים או אספקה סטנדרטיים למעבדה.
מסדרת 6200 רעילה

מקורות

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767(2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CodY
גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.