Method Article

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

DOI:

10.3791/55575

⸱

April 27th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, 2Inflammation Research Center, VIB, 3Center for Medical Genetics, Ghent University Hospital, 4Cancer Research Institute Ghent (CRIG), 5Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine and Health Sciences, Ghent University, 6Helmholtz Center for Infection Research, 7Mammalian Functional Genetics Laboratory, Division of Blood Cancers, Australian Centre for Blood Diseases, Department of Clinical Haematology, Monash University and Alfred Health Alfred Centre

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנדסת גנים עוברים עכברים או תאי גזע עובריים (mESCs) מאפשרת לחקר הפונקציה של חלבון נתון. חלבונים הם סוסי העבודה של התא ולעתים קרובות כוללים תחומים פונקציונליים מרובים, אשר יכול להיות מושפע שינויים posttranslational. הדלדול של החלבון השלם עכברים מותנה או מכונן נוק-אאוט (KO) אינו לוקח בחשבון זה גיוון תקנה פונקציונלי. קו המסקלין במודל עכברי נגזר, שבו אתר עגינה עבור חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה FLPe (RMCE) הוכנס בתוך הלוקוס ROSA26 (R26), דווחו בעבר. כאן, אנו מדווחים על גישת מבנה-תפקוד המאפשרת דיסקציה מולקולרי של הפונקציות השונות של חלבון multidomain. לשם כך, העכברים RMCE תואם חייב להיות חצה עם עכברים KO ואז mESCs RMCE תואם KO חייב להיות מבודד. הבא, פנל של מבני הצלה משוערים יכול להיות מוחדר לוקוס R26 באמצעות RMCE targeting. CDNAs הצלת המועמד ניתן להוסיף בקלות בין אתרי RMCE של וקטור המיקוד באמצעות שיבוט רקומבינציה. הבא, mESCs KO הם transfected עם וקטור מיקוד בשילוב עם פלסמיד ביטוי recombinase FLPe. RMCE reactivates גן neomycin-התנגדות פחות האמרגן של אתרי עגינת ROSA26 ומאפשר את הבחירה של אירוע הנכון למיקוד. בדרך זו, התייעלות מיקוד גבוה קרובה 100% מתקבלות, המאפשרת החדרה של מבני הצלה משוערים מרובים באופן תפוקה למחצה גבוה. לבסוף, מספר רב של מבני הצלת מונחת R26 יכול להיבדק על יכולת להציל את הפנוטיפ כי נצפה mESCs הורית KO. אנו מציגים מחקר הוכחה של עקרון מבנה-תפקוד ב קטנין P120 (p120ctn) mESCs KO באמצעות בידול endoderm ב גופים embryoid (EBS) כמו את ההודעה פנוטיפי. גישה זו מאפשרת זיהוי של תחומים חשובים, מסלולים במורד משוערים, ונקודת מחלה רלוונטיתמוטציות העומדים בבסיס פנוטיפים KO עבור חלבון נתון.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכה היא כי הגנום יונק מכיל כ 20,000 גנים המקודדים לחלבונים. שחבור אלטרנטיבי ושינויי posttranslational להגביר עוד יותר את רפרטואר החלבון. יש חלבוני מבנה מודולרי 1 ולעתים קרובות מכילים תחומי אינטראקציה מרובים, המאפשרים הגיוס שלהם לתוך מתחמי חלבון שונים השתתפותם תהליכים תאיים רבים 2. דוגמה אחת היא חלבון רב תפקודי הנקרא p120ctn. p120ctn מקודד על ידי הגן Ctnnd1 ו מורכב מתחום חוזרים ארמדיל מרכזי גדול ולצידו ידי N-מסוף אזור הטרמינל-C. התחום ארמדיל של p120ctn נקשר לתחום juxtamembrane השמור ביותר של cadherins הקלסית, אשר מעורבים תאי תאי הידבקות, אבל זה גם נקשר מדכא תעתיק Kaiso. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים על עכברים נערכו בהתאם לתקנות בעלי חיים מוסדיות, לאומיות, ואירופאיות.

1. בידוד של mESCs KO RMCE תואם

  1. גזע בעכברים KO הטרוזיגוטיים עם עכברים RMCE תואמת, כגון ROSALUC עכברים 10 או ROSA26-iPSC עכברים 21. שני עכברי RMCE תואם יוחזקו על רקע מעורב 129 / C57BL6 / שוויצרי.
    הערה: חצייה עם עכברי KO הטרוזיגוטיים מומלץ להתגבר הקטלניות עובריות בעכברי KO הומוזיגוטיים.
  2. השתמשו PCR כדי לבחור עכברים....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההליך לבודד RMCE תואם קווי KO המסקלין מתואר באיור 2. שני דרגסטור רצופים נדרשים להשיג blastocysts KO-תואם RMCE. ראשית, עכברים KO הטרוזיגוטיים נחצים עם עכברים RMCE תואם להשיג תואם-RMCE, עכברים KO הטרוזיגוטיים. עכברים אלה משמשים לאחר מכן עבור הזדווגויות מתוזמן עם עכברים KO הטרוזיגוטיים אחרים כדי להשיג 3.5-DPC, RMCE תואם, blastocysts KO הומוזיגוטיים. הסיכוי של קבלה לעובר כזה הוא אחד מתוך שמונה, כפי שחוזה חוקי התורשה של מנדל. לכן, פרוטו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת הבידוד המסקלין שלנו הוא ידידותי למשתמש ואינו דורש מיומנויות מתקדמות או ציוד, כגון מיקרו-של blastocysts. לפיכך, הטכנולוגיה הזו נגישה חלק גדול מהקהילה המדעית. כל מי שיש לו ניסיון תרבית תאים בסיסי יכול להפיץ בצמחי ICM ולהקים קווי mESCs. עם זאת, שטיפה וטיפול של blastocysts דורש קצת תרגול. פיפטה בפה משמש להעברת blastocysts והוא מורכב micropipette, לבעל micropipette, צינורות, וכן שופר aspirator 28. Micropipettes מחוייטת ידי ניתן חימום החלק הטוב ביותר של פיפט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החוקרים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Jinke D'Hont, פרדריק ואן Rockeghem, נטלי Farla, קלי Lemeire, ו Riet דה Rycke לקבלת תמיכה טכנית מעולה שלהם. אנו מודים גם Eef Parthoens, Evelien ואן Hamme, ואמנדה גונסאלביס ממתקן Core bioimaging של מרכז המחקר דלקת לסיוע המומחה שלהם. אנו מודים לחברי קבוצת המחקר שלנו לדיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי מדיניות המדע הבלגית (פולני אטרקציה הבינאוניברסיטאי Belspo - פרס IAP VII-07 DevRepair; https://devrepair.be), על ידי הקרן הרפואית המלכה אליזבת, בלגיה (GSKE 2008-2010; http: // www .fmre-gske.be), ועל ידי פעולות מחקר מתואמת (GOA 01G01908) של גנט האוניברסיטה, בלגיה (http://www.ugent.be/en/ghentuniv). SG הוא עמית פוסט של ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
עכברי ROSALUCהמיוצרים בביתזרע קפוא זמין על פי בקשה
עכברי R26-iPSCהמיוצרים בביתזרע קפוא זמין על פי בקשה
בדיקת כליFine Science Tools10160-13כדי לבדוק אם יש פקקי הזדווגות
M2 בינוניSigma-AldrichM7167להכין אליקוטים ולאחסן ב-20 מעלות; C
מלקחיים עדינים (Dumont #5 מלקחיים סטנדרטיים לסטודנטים)Fine ScienceTools 11251-10תרסיס עם 70% EtOH לפני השימוש (אין לבצע חיטוי)
23 גרם מחטיםFine-ject8697
1 מ"ל מזרקיםרכים6680
60 מ"מ בדרגת חיידקים (לשטיפה) GosselinBB60-01
פיפטה פהתוצרת הביתראה דיון
פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs, TgN (DR4)1 זן ג'ה)ATTCSCRC-1045
TgN (DR4)1 עכברי ג'המעבדת ג'קסון3208
מיטומיצין C Sigma-AldrichM0503
תמיסת מלח פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיוםעכברי Gibco14190-094
Tg(DR4)1Jae/JJAX3208המכילים ארבעה גנים הניתנים לבחירת תרופות ו-DR4 MEFS מעניקים עמידות לניאו-מיצין, פורומיצין, היגרומיצין ו-6-תיוגונין
0.1% ג'לטיןסיגמא-אולדריץ'G1393ממיסים 0.5 גרם במים מזוקקים של 500 מ"ל, אוטוקלאב ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
טריפסין (0.25%) גיבקו25200-056
2 μ M פלוריפוטיןקיימן כימיקל10009557
אוסף pRMCE-DV1BCCM/LMBP LMBP 08870זמין לציבור מקולקציית BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be) 
pRMCE-DV1BCCM/LMBPLMBP 08195זמין לציבור באוסף BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be) 
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA Addgene20733
הלם חום מוכשר DH5 & אלפא; חיידקים תוצרת הבית
Gateway pDONR221 וקטורThermo Fisher12536-017מכיל גן עמידות לקנמיצין
BP קלונאז II mixThermo Fisher11789-020
LR קלונאז II תערובתThermo Fisher11791-020 
מרק לוריא (LB) 
אמפיצילין 
Applied Biosystems 3730XL DNA AnalyzerThermo Fisher3730XL
G418Thermo Fisher11811-023
Lipofectamine 2000 מגיב טרנספקציהThermo Fisher11668027
Lipofectamine LTX מגיב טרנספקציהThermo Fisher15338100
מגיבטרנספקציה אפקטןQiagen301425
GATEWAY pENTR 1A וקטורתרמו פישרA10462וקטורי תואם רקומבינציה מונוקלונלי
אנטי-p120ctn נוגדןBD Transduction Laboratories610134
עכבר חד שבטי נוגדן נגד אקדריןBD Transduction Laboratories610181
<חזק>ציוד כללי
חיתוך סטרילייםמספריים עדינים ומלקחיים לניתוח הרחם
פיפטות סטריליות: 5 מ"ל, 10 מ"ל ו-25 מ"ל
צינורות
צלחות תרבית 96 בארות תחתית בצורת V ותחתית שטוחה) 
כלי תרבות: 24 בארות, 12 בארות ו-6 בארות
פיפטות רב-ערוציות (לפיפטה 30, 50, 100 ו-200 μ L) 
מאגרים רב-ערוציים סטריליים
גישה לזרימת
גישה לחממה ב-37 מעלות; C עם 5% CO2
גישה למיקרוסקופ
גישה לצנטריפוגה
גישה למיקרוסקופ סטריאו עם אור מועבר 
<מדיה>תרבותית חזקה
<חזקה>MEF בינונימאוחסן ב-4 מעלות; C; חם 30 דקות ב-37 מעלות; C לפני השימוש
ב-Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM)Gibco41965-062
10% סרום בקר עוברי (FBS)סיגמא-אולדריץ'F-7524
L-גלוטמין (2 מ"מ)Gibco25030-024 
נתרן פירובט  (0.4 מ"מ)ג'יבקו11360-039 
פניצילין (100 יח'/מ"ל)גיבקו15140-122 
סטרפטומיצין (100 ומיקרו; גרם/מ"ל)גיבקו15140-122 
mESC מבוסס SR בינונימאוחסן ב-4 מעלות; C; חם 30 דקות ב-37 מעלות; C לפני השימוש
DMEM/F12Gibco31330-038מעורבב ביחס של 1:1
15% החלפת סרום נוק-אאוט (SR)Gibco10828– 028
L-גלוטמין (2 מ"מ)Gibco25030-024 
0.1 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות גיבקו11140-050
פניצילין (100 יח'/מ"ל)גיבקו15140-122 
סטרפטומיצין (100 ומיקרו; גרם/מ"ל)גיבקו15140-122 
&בטא;-מרקפטואתנול (0.1 מ"מ) סיגמא-אולדריץ'מ 3148 
2,000 U/mL עכבר רקומביננטי LIF (מתקן שירות חלבון IRC/VIB)
<מדיום mESC מבוסס חזק>FBS (בדומה למדיום mESC מבוסס SR)מאוחסן ב-4° C; חם 30 דקות ב-37 מעלות; C לפני השימוש
נוקאאוט DMEMGibco10829-018 
15% FBSHycloneSH30070.03E
Differention Mediumמאוחסן ב-4° C; חם 30 דקות ב-37 מעלות; C לפני השימוש
במדיום של Iscove's Modified Dulbecco (IMDM)Gibco21980-032 
15% FBSHycloneSH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) נוזלי   גיבקו11279-023 
2 מ"מ L-גלוטמיןגיבקו25030-024 
0.4 מ"מ 1-תיוגליצרולסיגמא-אולדריץ'M-6145
50 μ גרם/מ"ל חומצה אסקורביתסיגמא-אולדריץ'A-4544 
פניצילין (100 יח'/מ"ל)גיבקו15140-122 
סטרפטומיצין (100 ומיקרו; גרם/מ"ל)גיבקו15140-122 
2i
1 μ מעכב M Erk PD0325901 Axon MedchemAxon 1408
3 μ מעכב M Gsk3 CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
עכברי אוסף שהוסר ב-cre-cemb  עכבר כלי צנטריפוגה חרוטיים של 15 מ"ל ו-50 מ"לאוויר למינריתהפוךעל ספסל

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gul, I. S., Hulpiau, P., Saeys, Y., van Roy, F. Metazoan evolution of the armadillo repeat superfamily. Cell Mol Life Sci. , (2016).
  2. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  3. Pieters, T., van Hengel, J., van Roy, F.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombination mediated Cassette ExchangeMouse Embryonic Stem CellsRosa26 Locus TargetingRescue Construct InsertionFLPe Recombinase ExpressionNeomycin Resistance SelectionEndoderm Differentiation Assayp120 Catenin KnockoutEmbryoid Body FormationGenetic Rescue Screening

Related Articles