Method Article

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

DOI:

10.3791/55653

⸱

July 11th, 2017

 ,  , 
1DFG Cluster of Excellence 'Cells in Motion', (EXC 1003), Institute of Medical Physics and Biophysics, University of Muenster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פילופודיה הן בליטות תאיות דינמיות, דמויי אצבע, הקשורות בהעברה ובתקשורת תאית. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני האיתות המורכבים העומדים בבסיס החניכה הגופנית, הארכה וייצוב או נסיגה שלאחר מכן, חשוב לקבוע את פעילות החלבון הזמני-הטמפורלי במבנים דינמיים אלה. כדי לנתח את תפקוד החלבון ב filopodia, פיתחנו לאחרונה אלגוריתם חצי אוטומטי מעקב שמתאים לשינויים צורה filopodial, ובכך מאפשר ניתוח מקבילי של הדינמיקה בליטה וריכוז חלבון יחסית לאורך כל אורך filopodial. כאן, אנו מציגים מפורט שלב אחר שלב פרוטוקול עבור טיפול התא אופטימיזציה, רכישת התמונה וניתוח תוכנה. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לשימוש בתכונות אופציונליות במהלך ניתוח תמונות וייצוג נתונים, וכן הנחיות לפתרון בעיות עבור כל השלבים הקריטיים לאורך הדרך. לבסוף, אנו כוללים גם השוואה של דEscribed תוכנת ניתוח תמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodia. יחד, הפרוטוקול המוצג מספק מסגרת לניתוח מדויק של הדינמיקה חלבון ב בליטות filopodial באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שליטה ספציו-טמפורלית של חלבונים רגולטוריים אקטין קשורה דינמיקה פילופודיום 1 , 2 . מעקב ריכוז חלבונים בריכוז מרחבי לאורך כל אורך filopodial דרך הזמן ולכן חיוני כדי לקדם את הבנתנו את המנגנונים ביסוד היזום, הארכה, ייצוב או קריסה של מבנים דינמיים אלה 3 , 4 . שלא כמו ניתוח חלבון cytosol, שבו שינויים רבים צורה התא מתרחשים בקנה מידה גדול יותר, filopodia הם מבנים דינמיים מיקרו אשר כל הזמן אבזם 5 וכופף, ובכך מונע ניתוח באמצעות גישה פשוטה כגון קו סריקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבות התא

  1. תרבות HeLa או תאים COS ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 4.5 גרם / L גלוקוז D, L-alanine-L- גלוטמין dypptide, pyruvate, 10% בסרום שור עוברית, ו 10 יחידות / מ"ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין. תרבות נוירונים בתרבות התקשורת ללא L- גלוטמין, חומצה גלוטמית או חומצה אספרטית, בתוספת 0.5 מ"מ L-alanine-L- גלוטמין dipeptide, נטול תוסף נוירונים חינם ו -10 יחידות / מ"ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין.
  2. לאחר 40% confluency הוא הגיע, transfect תאים עם בונה של בחירה באמצעות מגיב transfection....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות תאים COS transfected עם סמן עבור אקטין נימי (F-tractin 18 , אדום) ואת הפניה cytosolic (ירוק), מצאנו אקטין עשיר filopodial בליטות ( איור 3 א , פאנל העליון). סדרות זמן הראו כי filopodia להרחיב במהירות לחזור ( איור 3 א , לוח באמצע). באמצעות תוכנת ניתוח התמונה, אנו עוקבים אחר filopodia הפרט. השוואה של אורך filopodial נמדד על ידי היד לעומת תוכנת ניתוח התמונה הראה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למעקב דינמיקה הצמיחה filopodial וניתוח של ריכוזי חלבון יחסית מבנים דינמיים אלה באמצעות אלגוריתם קמור האל. באמצעות התוכנה, עד 3 ערוצים ניתן להשוות זוג חכם בריצה אחת, לפיה הריכוזים היחסיים של שני ערוצים ( כלומר חלבונים) נקבע במהלך מחזור הרחבה / השבת ומאוחסן קבצי תמונה ונתונים בתיקיות נפרדות. בנוסף לפעולות שגרתיות, התוכנה מספקת גם מספר פרמטרים שניתן לשנות כדי לייעל את הניתוח עבור הניסוי בהתאמה. תיאור מפורט של שינויים אלה, כמו גם פתרון בעיות ניתן.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים במימון של DFG (EXC-1003 ל- MG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMLife Technologies31966-021
10% סרום בקר עובריBiochrom AGL11-044
ליפופקטמין 2000Life Technologies11668-027
1% פניצילין/סטרפטומיציןBiochrom AG12212
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049
B27Life Technologies17504-044
HEPES (תמיסת מלאי 1M)Life Technologies15630
Citrine-N1Addgene54593
LabtechThermo155411
Glutamax-IThermo35050-061
מכון הלה לייבניץ DSMZACC-57
COS 7לייבניץ מכון DSMZACC-60
3T3 תאיםמכון לייבניץ DSMZACC-59
מיקרוסקופליקוי חמה
אנדורDU888 יחידה אולטרה
קונפוקליתלייצורCSU-X1
פירובטג'יבקו31966-021
ניקון מצלמת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
  2. Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Filopodia TrackingProtein ConcentrationImage Analysis SoftwareProtrusion DynamicsGraphical User InterfaceSpatial Temporal AnalysisProtein LocalizationCell MigrationActin FilamentsRatiometric Protein Analysis

Related Articles