Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

סיכום

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

תקציר

זרחון חלבון באתרים ספציפיים קובע את הקונפורמציה שלו ואת האינטראקציה עם מולקולות אחרות. לפיכך, זרחון חלבון משפיע על פונקציות ביולוגיות ומאפיינים של התא. כיום, השיטה הנפוצה ביותר לגילוי אתרי זירחון היא ניתוח כרומטוגרפי נוזלי / ספקטרומטריית מסה (LC / MS), שיטה מהירה ורגישה. עם זאת, זרחני פוספט זולה יחסית משוחררים לעתים קרובות phosphopeptides במהלך שלב פיצול, אשר לעתים קרובות מניב אותות שלילי שווא. במקרים כאלה, מסורתי assay קינאז במבחנה באמצעות מוטנטים מכוונים האתר יהיה מדויק יותר, אבל שיטה זו היא מייגעת זמן רב. לכן, שיטה חלופית באמצעות תחרות פפטיד עשוי להיות יתרון. מוטיב ההכרה הקונצנזוס של 5 'אדנוזין monophosphate המופעל קינאז חלבון (AMPK) הוקם ¹ ו תוקף באמצעות פוזיטיון סריקה פפטיד סריקה התחתAy. לפיכך, אתרי זרחון AMPK עבור מצע הרומן יכול להיות ניבא ואושר על ידי מבחני התחרות פפטיד. בדו"ח זה, אנו מתארים את השלבים המפורטים ונהלים עבור במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ידי המחשה AMPK בתיווך גורם גרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2) זרחון. כדי לאמת את האתר זרחן, ביצענו רציף assay קינאז במבחנה באמצעות מוטציה באתר ספציפי. בסך הכל, assay התחרות פפטיד מספק שיטה למסך אתרי זרחן פוטנציאליים פוטנציאליים כדי לזהות אתרים לאימות על ידי מוטציות האתר זרחן.

מבוא

חלבון זרחן ב שאריות מסוים ממלא תפקיד משמעותי במגוון רחב של תהליכים תאיים. לפיכך, הבנה של רשתות איתות דורשת זיהוי של אתרי זרחן ספציפיים. בנוסף, האתר זרחן קובע את ההשפעה על תפקוד החלבון, כי תחומים בודדים בתוך חלבון יש מבנים שונים פונקציות. פעילות הגורם הגרעיני erythroid 2 הקשורים גורם 2 (Nrf2), גורם נוגד חמצון מפתח, הוא מוסדר דו כיווני באמצעות זרחון באתרים שונים. המחקרים שלנו התמקדו קינאזות כי לזרז את זרחון של Nrf2. תגובת הלחץ של Nrf2 נגד אתגר חמצוני מתרחשת במהירות, בעיקר באמצעות זרחון ב serine 40 ו מתווכת על ידי חלבון קינאז C (PKC) -δ, אשר מפעיל Nrf2 ^{3 , 4} . לעומת זאת, Fyn מזרז את זרחון מעכב של Nrf2 ב tyrosine 5עבור פיקוח הדוק על הפעילות.

השיטה הנפוצה ביותר המשמשת לגלות אתרי זרחון הוא כרומטוגרפיה נוזלית / ספקטרומטריית מסה (LC / MS) ניתוח. מהיר וזמן רגיש זרחון באתר מיפוי נתונים ניתן להפיק בדרך זו; עם זאת, יש כמה מגבלות טכניות, לעתים קרובות יצירת אותות מזויפים שלילי. כיסוי רצף גרוע לעתים קרובות מתרחשת ניתוח LC / MS. כדי לזהות אתרי זרחון, מידע על כיסוי מקסימלי של חומצות אמינו של חלבון נדרש ⁶ . פרוטאוליזה של חלבון של עניין עם מספר פרוטאזות במהלך הצעד העיכול עשוי להיות לעזור בשיפור רצף הכיסוי. מכשול נוסף לזיהוי שאריות זרחון הוא אובדן של חומצה זרחתית כי הוא נצפה לעתים קרובות עבור serine ו threonine-phosphideslated פפטידים ^{6 , 7} . זרחן פוספט moieties הם לעתים קרובותשוחרר מ phosphopeptides במהלך תהליך הפיצול ⁷ . האפשרות השנייה בעת חיפוש אתרי זרחון היא באמצעות שיטת microarray פפטיד. ניתן לבדוק את אתרי היעד kinase באמצעות שבב microarray המכיל שברי פפטיד נגזר חלבון של עניין. עם זאת, בשל הדרישה הציוד לייצור וזיהוי שבב microarray, שיטת microarray פפטיד נחשב זמן רב ויקר.

כדי להתגבר על אתגרים אלה, במבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז יכול לשמש קינאז חלבון עם מוטיבים הכרה ידוע. אם מוטיב ההכרה של קונצנזוס של קינאז הוא הקימה, אתרי זרחון putative של המצע המועמד ניתן לחזות, ואת האותנטיות של האתרים ניתן לאמת. השיטה המשכנעת ביותר עבור הליך זה היא להראות את הביטול של זרחון בחלבון מוטנטי שבו תחזיתD שאריות מוחלפת בחומצת אמינו שאינה phosphorylatable ( כלומר, serine או threonine כדי alanine, tyrosine כדי פנילאלנין). עם זאת, ייצור ובידוד של חלבונים מוטנטים הוא זמן רב. כחלופה בשלב הראשוני של המחקר, assay פפטיד קינאז תחרותי הוא פשוט ונוח. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור assay מבחנה במבחנה פפטיד ו עבור אימות של אתר זרחון.

פרוטוקול

1. בטיחות

זהירות: פרוטוקול זה משתמש [γ- ³² P] -ATP כדי להעריך את הפעילות של AMPK. זרחן -32 הוא איזוטופ רדיואקטיבי, המוביל בעיקר לקרינת בטא. מאז גודל של חלקיק בטא הוא קטן מאוד, זה יכול בקלות לחדור בגדים ועור. חשיפה חיצונית וחיצונית לקרינת ביתא עלולה להזיק לבריאות האדם, לרבות על ידי גרימת כוויות בעור ונזק לרקמות.

1. בצע את כל השלבים המחייבים שימוש [γ- ³² P] -ATP באמצעות הגנה נאותה, כגון אקריליק מיגון.
2. ודא כי כל אנשי מצויד dosimeters אישי אלקטרוניים (EPD) כדי לפקח על מידת החשיפה לקרינה מזיקה במהלך כל ההליכים.
3. טיפול בקרינת קוד פתוח רק לאחר הדרכה מתאימה ואישור רגולטורי.
   הערה: כאן, כל הניסויים נערכו לאחר השלמת האימון על השימוש בקורא פתוח בקוד פתוח ב- National National UnivErsity והאישור של ממשלת קוריאה (nssc.go.kr/nssc/en).
4. השליכו פסולת רדיואקטיבית לפי תקנות מקומיות.
   הערה: להלן הוראות של המכון להגנת הסביבה ובטיחות של האוניברסיטה הלאומית של סיאול. להלן רשימת הרגולטורים בארצות הברית ובמדינות אירופה: ארצות הברית של אמריקה, ארצות הברית רגולטורית הוועדה הגרעינית (http://www.nrc.gov/); בריטניה, בריאות ובטיחות Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); צרפת, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); גרמניה, המשרד הפדרלי לאיכות הסביבה, שימור טבע, בניין בטיחות גרעינית (BMU) (http://www.bmu.de).

2. ויטרו תחרותי קינאז Assay

1. בניית פפטידים תחרותיים
   1. לקבוע את מוטיב הקונצנזוס phosphorylated ידי AMPK.
      הערה: AMPK מזהה מוטיב קונצנזוס, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. ברצף הקונצנזוס, Φ מייצג חומצות אמינו הידרופוביות ( כלומר, valine [V], leucine [L], methionine [M] ו- isoleucine [I]) ו- β מייצג חומצות אמינו בסיסיות ( כלומר, ליזין [K], ארגינין [ R], ו histidine [H]) ¹ .
   2. בחר שאריות סרין או threonine מתוך רצפים היעד על פי מוטיב הקונצנזוס לעיל. השתמש שלושה אתרים משוערים של Nrf2 אנושי (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 הכולל Ser558) ⁸ .
   3. מסחרי לסנתז 10-שאריות פפטידים לחקות את האתרים putative. השג את המוצר מסונתז כמו אבקת lyophilized עם טוהר גדול מ 98% עבור כל פפטיד.
   4. ממיסים את הפפטידים באמצעות חיץ kinase להשיג ריכוז של 71.667 גרם / L. אם פפטיד אינו מסיס במאגר kinase, להמיס אותו DMSO 20%. אם זה נשאר בלתי מסיס, פפטיד מחקה את לשיםניתן להרחיב את האתר האטום להגדלת המסיסות.

2. ב ויטרו מתחרה AMPK Assay קינאז
   1. הכן 5 × חיץ kinase כדלקמן: 100 מ"מ HEPES, pH 7.4; 25 מ"מ MgCl ₂ ; 5 מ"מ EGTA; 5 מ"מ DTT; 125 מ"מ β-glycerophosphate (סרין / threonine phosphatase inhibitor); 5 mM Na ₃ VO ₄ (מעכב tyrosine phosphatase); 0.5% (V / V) Protease מעכב קוקטייל הגדר III, 1 מ"מ ATP קר; ו 500 מיקרומטר AMP.
      הערה: AMP הוא מרכיב חיוני במאגר kinase לבדיקת פעילות AMPK. המאגר ניתן להשתמש כדי למדוד את הפעילות של שני סרין / threonine קינאזות ו טירוזין קינאזות.
   2. להפשיר את החלבון רקומביננטי הבא פפטידים סינתטיים על הקרח: AMPK; Nrf2; ו oligopeptides # 1, # 2, ו # 3.
   3. הכן חיץ התגובה על הקרח: 0.15 מיקרוגרם של AMPK, 0.4 מיקרוגרם של Nrf2 (~ 4 pmol), 0.43 מ"ג של אוליגופפטיד (~ 300 nmol), ו 6 μL של חיץ 5 × קינאז. אDjust נפח הסופי μL 30 עם מים מזוקקים סטריליים (DW).
      הערה: תוספת של [γ- ³² P] -ATP לאחר הכנת המאגר התגובה עשויה להפחית את האות רדיואקטיבי עקב autoposphorylation kinase.
3. הפעלת הריאקאנטים
   הערה: כל התהליכים הבאים חייבים להתבצע תחת הגנה עם מגן אקרילי, מתלה או בלוק, כמו גם ציוד מגן אישי מתאים.
   1. הגדר בלוקים חימום עד 30 מעלות צלזיוס לפני תחילת הניסוי.
   2. הוסף 1 μL של [γ- ³² P] -ATP (1 μCi) כדי צינורות התגובה על הקרח. מערבבים את המאגר התגובה על ידי pipetting מעלה ומטה כמה פעמים.
      הערה: לרדיואקטיביות של ³² P יש אורך חיים קצר של כ 14 ימים ⁹ . התאם את עוצמת הקול על ידי בחינת מחצית החיים ( למשל, לאחר חודש אחד מן הייצור של [γ- ³² P] -ATP, להוסיף 4 μL של [γ- ³² P]-ATP לעשות 1 μCi).
   3. דגירה המדגם בלוק חימום ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות. במהלך שלב זה, להכין 7.5% נתרן dodecyl סולפט-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ג'לים. התאם את אחוז הג'ל בהתאם לגודל של חלבון המטרה.
   4. עצור את התגובה kinase על ידי הוספת 3 μL של 10 × SDS חיץ מדגם (10% (v / v) גליצרול, 20% (w / V) SDS, 15.42% (w / v) dithiothreitol, 90% (v / v) 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), ו 0.02% (w / v) bromophenol כחול). מערבבים את המאגר התגובה על ידי pipetting מעלה ומטה כמה פעמים.
   5. הפעל את דגימות ב SDS-PAGE ג'ל 7.5% ב 70 V במשך 20 דקות ברציפות ב 140 V עבור 1 שעות.
      הערה: הקו הכחול bromophenol בסוף הג'ל מכיל אותות רדיואקטיביים גבוהים במיוחד. מומלץ להסיר את הג'ל מתחת לקו הכחול לפני שתמשיך לשלב הבא כדי להפחית את אותות הרקע.
   6. לאחר SDS-PAGE, הסר בעדינות את הג'ל מן גלגלית. מניחים את הג'ל בכוס לאעבור לשלב הבא.
   7. תקן את הג'ל עם חיץ קיבעון במשך 20 דקות (מתנול 50% ו 10% חומצה אצטית קרח).
   8. בעדינות להזיז את הג'ל על נייר סינון לכסות אותו עם עטיפה שקופה. שים לב כי ג'ל עשוי להיות קרוע בקלות בשלב זה. יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
4. רְאִיָה
   1. לחשוף את הג'ל או מסך זרחן או סרט רנטגן לילה (בדרך כלל כ 16 שעות).
      הערה: ניתן להשתמש בחלון זרחן לאחר החשיפה לאור בהיר במיוחד. כאשר סרט רנטגן משמש, לחשוף את הג'ל על פני יומיים. סרטי רנטגן יש רגישויות נמוכות יותר מאשר מסכי זרחן.
   2. סרוק את המסך זרחן עם imager זרחן. לייצא את התמונה כקובץ TIFF ברזולוציה גבוהה או קובץ מפת סיביות.
   3. לאחר ויזואליזציה, להעביר את הג'ל לכוס או פלסטיק מיכל עבור Coomassie מבריק כחול (CBB) מכתים.
   4. לשטוף את הג'ל עם DW. מחק את DW ו כתם הג 'ל עם מגיב מכתים עבור 1 ח.
   5. מחק את מגיב destain את הג'ל עם DW עבור 1 שעות או לילה. מניחים את הג'ל בין סרטי פלסטיק שקופים (או שווה ערך) לסריקה באמצעות סורק משרדי.

3. ויטרו קינאז Assay באמצעות אתר ספציפי מוטציה

1. אתר מוטגניזה מכוונת של pGEX-Nrf2
   1. מוטגני פריימר עיצוב
      הערה: תכנון primages mutagenic תקין הוא קריטי עבור תוצאה מוצלחת של mutagenesis. להלן מספר שיקולים לעיצוב primers mutagenic. צור פריימר המורכב של 25 עד 45 בסיסים, עם המוטציה הרצויה באמצע הפריימר. פריימר צריך להיות 40-60% תוכן GC ולסיים עם אחד או יותר בסיסים G או C. וודאו כי T _{מ '} של פריימר שווה 78 מעלות צלזיוס או יותר על פי הנוסחה [T _m = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / אורך בסיסים) -% mismatch].
      הערה: לטהר אתפריימר כי טוהר שלה חשוב עבור יעילות המוטציה. ישנם מספר אתרי אינטרנט לעיצוב primers mutagenic.
      1. פתח את תוכנית עיצוב פריימר עבור "עיצוב primers עבור mutagenesis מכוונת האתר" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
      2. הדבקת רצף DNA של Nrf2 אנונימי (גישה למספר NM_006164.4) ובחר בלחצן "טען מתורגם".
      3. בחר את הסרין 558 שאריות מתוך רצף חומצות אמינו מתורגם כדי לשנות אלנין. באמצעות primager mutagenic, תחליף קודון עבור serine מ AGC ל GCC, עבור alanine.
      4. שקול אורך פריימר, T, ותוכן GC.
         הערה: תחל מוטגני הוא סוף סוף מתוכנן כמו 5'-ctactgaaaaaacaactc GCC accttatatctcgaag-3 '.
   2. תגובה עבור סינתזה סטרנד מוטציה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR)
      1. הכן את תערובת התגובה PCR על הקרח: 10 × חיץ התגובה, 50 ng שלPGEX-GST-Nrf2, 125 ng של תחל קדימה, 125 ng של היפוך לאחור, 1 μL של תערובת dNTP (10 מ"מ כל), 2.5 U פולימרז DNA Pfu , ו DW סטרילי ל 50 μL.
      2. הפעל את PCR עבור pGEX-GST-Nrf2 מוטציה גדיל סינתזה עם תוכנית אופניים הבאה: 1 מחזור ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; 18 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ב 55 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות, ב 68 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות; ו 1 מחזור ב 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
         הערה: בהתאם אורך פלסמיד, הפרמטרים רכיבה ניתן לשנות.
      3. מניחים אותו על הקרח במשך 2 דקות כדי לצנן את המגיבים עבור השלב הבא. לחלופין, לאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   3. Dpn I העיכול ואת הבחירה של מוטציה פלסמיד
      1. הוסף 1 μL של Dnn אני הגבלה אנזים (10 U / μL) לכל אחד המגיבים לאחר הקירור. מערבבים ביסודיות בעדינות על ידי pipetting ו צנטריפוגה במשך 1 דקות.
      2. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לעכל הורים pGEX-GST-Nrf2 פעמיים,דנ"א תקוע.
      3. להפשיר בעדינות DH5 α תאים supercompetent על הקרח.
      4. הוסף 50 μL של מגיב ל 150 μL של מראש DH5 α מקורר תאים supercompetent ו דגירה על קרח במשך 30 דקות לפחות.
      5. מעבירים את הצינורות לחימום חימום מחומם מראש ל 42 מעלות צלזיוס ולהשאיר אותם 90 s. מניחים אותם על קרח במשך 2 דקות.
      6. הוסף מראש לחמם מרק lysogeny (LB) לתאי DH5 α השתנה ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם רעד בסל"ד 180.
      7. מורחים את התאים הופכים על LB-ampicillin אגר צלחות דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
         הערה: Ampicillin משמש לבחירה מאז פלסמיד GEX-GST-Nrf2 יש סמן עמיד ampicillin. השתמש אנטיביוטיקה מתאימה, בהתאם סמן ההתנגדות של mutasmized פלסמיד.
      8. בחר מושבה אחת מהצלחת, להעביר אותו 5 מ"ל של LB-ampicillin, ו דגירה לילה זה ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 180 סל"ד.לאימות של רצף mutagenic, להעריך לפחות שלוש מושבות.
      9. חלץ DNA באמצעות ערכת miniprep DNA עבור ניתוח רצף DNA; בצע את הפרוטוקול של היצרן.
      10. אמת את רצפי הדנ"א mutagenic באמצעות רצף DNA אוטומטי Analyzer בהתאם לפרוטוקול של היצרן. השתמש לפחות 200 ng של DNA לבנות עבור אימות רצפים מוטציה.
2. טיהור של רקומביננטי GST-Nrf2 חלבון
   1. ביטוי של חלבון מוטגני GST-Nrf2 פיוז 'ן ב Escherichia coli
      1. להפוך את מוטגני pGEX-GST-Nrf2 פלסמיד לתוך תאים BL21 . לחסן מושבה אחת 25 מ"ל של מרק LB המכיל אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על מסובבים בן לילה.
      2. לחסן את התאים בתרבית 100 מ"ל של מרק LB המכיל ampicillin (100 מיקרוגרם / מ"ל) על יחס דילול 1: 100.
      3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס על סיבובאו עד ספיגה ב 600 ננומטר מגיע סביב 0.4-0.8 (כ 4 שעות).
      4. הוסף 100 μL של 1 M IPTG ל 100 מ"ל של תאים בתרבית להכין ריכוז סופי של 1 mM IPTG.
      5. דגירה התאים על 30 מעלות צלזיוס על מסובבת במשך 6 שעות או לילה לביטוי חלבון.
      6. צנטריפוגה התאים ב XG 5000 במשך 20 דקות ו resuspend כדורי התא עם 1 מ"ל של חיץ תמוגה חיידקי (25 מ"מ HEPES, 5 מ"מ EDTA, 2 מ"מ DTT, 0.1% CHAPS, 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​pepstatin, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​leupeptin, ו 1 מ"מ PMSF) על הקרח.
      7. Lyse תא כדורי באמצעות homogenizer קולי עם 2-s intervals עבור 2 דקות ב 50% של הפלט הכוח המרבי.
      8. צנטריפוגה התאים ב 12,000 × גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant.
   2. טיהור של רקומביננטי GST-Nrf2 חלבון
      1. הכן 200 μL של 50% (V / V) גלוטתיון אגרוס חרוזים לשטוף עם 1 מ"ל PBS (pH 7.3; 140 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 mM Na ₂ HPO ₄ , ו 1.8 mM KH ₂ PO ₄ ). לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 1 דקות. חזור על צעד כביסה שלוש פעמים.
      2. הוסף את lysate התא 200 μL מוכן של 50% (V / V) גלוטתיון אגרוס חרוזים ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס על מסובך סוף סוף עבור 2 שעות.
      3. איסוף חרוזי גלוטתיון agarose בשילוב עם חלבון GST-Nrf2 על ידי צנטריפוגה ב XG 500 למשך 1 דקות. הסר את supernatant באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 31 G.
      4. שטפו את החרוזים עם 1 מ"ל של PBS (pH 7.3), כמו בשלב 1.
      5. הוסף 500 μL של חיץ elution (50 מ"מ טריס HCl ו 10 mM מופחת גלוטתיון, pH 8.0) כדי חרוזי גלוטתיון-אגרוס בשילוב עם GST-Nrf2. דגירה על 4 מעלות צלזיוס על סוף סוף מעל מסובב במשך 30 דקות.
      6. צנטריפוגה ב XG 500 דקות 1 ולאסוף את supernatant.
      7. שוב להוסיף 300 μL של חיץ elution כדי חרוזים חוזרים צעדים 3.2.2.5-3.2.2.6 פעמיים.
   3. אישור של חלבון GST-Nrf2 מטוהרים
      1. הכן 5 μL של המדגם להדמיה של כמות חלבון עם 0.5 מיקרוגרם של BSA חלבון סטנדרטי.
      2. הפעל את דגימות ב SDS-PAGE 7.5% ב 70 V במשך 20 דקות ולאחר מכן ב 140 V במשך 60 דקות.
      3. כתם ג'ל עם 0.1% CBB פתרון מכתים (0.1 גרם CBB R250, 40 מ"ל של מתנול 99%, 10 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, ו 50 מ"ל של H ₂ מזוקקים) במשך 2 שעות ו destain (30 מ"ל של מתנול, 10 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, ו 60 מ"ל של מזוקק H ₂ O) עד להקות מוצגים בבירור.
      4. מניחים את ג'ל destained על נייר סינון לכסות עם מעטפת שקוף. יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות.
      5. לקבוע את כמות חלבון GST-Nrf2 מוטציה עם densitometry עבור assay במבחנה AMPK קינאז.
3. ויטרו AMPK פעילות Assay עם אתר ספציפי מוטציה
   לֹאE: assay במבחנה AMPK קינאז מבוצעת על פי הצעדים 2.2-2.4, באמצעות 0.4 מיקרוגרם של מטוהרים wildtype GST-Nrf2 או מוטציה GST-Nrf2-S558A ללא מעכבי פפטיד. עקוב אחר כל הנחיות בטיחות הקרינה המתוארות בשלב 1.
   1. הכן חיץ התגובה על הקרח עם 0.15 מיקרוגרם של AMPK, 0.4 מיקרוגרם של מוטציה או wildtype GST-Nrf2, ו 6 μL של חיץ 5 kinase. מלא עד 30 μL עם DW סטרילית.
   2. הוסף 1 μL של [γ- ³² P] -ATP (1 μCi / μL) כדי תגובה צינורות על הקרח. מערבבים את המאגר התגובה ידי pipetting מעלה ומטה כמה פעמים צנטריפוגות.
   3. דגירה דגימות בבלוק חימום ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   4. עצור את התגובה kinase ידי הוספת 3 μL של חיץ 10 × SDS מדגם.
   5. הפעל ג'ל SDS-PAGE 7.5% ב 70 V במשך 20 דקות ולאחר מכן ב 140 V עבור 1 שעות.
   6. תקן את הג'ל עם חיץ קיבוע במשך 20 דקות, להעביר אותו על נייר הסינון, וכן לכסות את הג'ל עם שקףעטיפה.
   7. יבש את הג'ל עם מייבש ג'ל ואקום על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן לחשוף אותו לילה או למסך זרחן או סרט רנטגן.
   8. סרוק את המסך זרחן עם imager זרחן ולהזיז את הג 'ל על צינור זכוכית עבור מכתים CBB לאחר ויזואליזציה על פי צעד 2.4.

תוצאות

איור 1 ואיור 2 מדגימים את התוצאות מניסויים חוזרים ונשנים בעיתון שדווח בעבר. שלושה oligopeptides 10-שאריות שונים מחקה את אתרי היעד AMPK putative (# 1, 148-157 המורכב SR153, # 2, 330-339 המורכב SR335, ו # 3, 553-562 המורכבת Ser558) היו מסונתז המשמשים מתחרים ב Assay קינאז מבחנה . זרחון של Nrf2 על ידי AMPK היה מאוד פחתה בנוכחות אוליגופפטיד # 3 ( איור 1

דיון

כדרך פשוטה ונוחה להעריך את האותנטיות של אתרי זרחון חזוי בתיווך AMPK, כאן אנו מתארים assay קינאז במבחנה שניתן להשתמש בהם כדי לגלות אתר זרחן ספציפי באמצעות פפטידים תחרותיים כדי לאמת אותו באמצעות מוטציה אתר ספציפי . הנתונים המייצגים המתקבלים מתוך מבחנה פעילות מבחנה AMPK תחרותי תואם את התוצאות של assay באמצעות חלבון מוטציה האתר מכוונת, המציין כי assay התחרות פפטיד הוא כלי שימושי לקביעת אתר זרחון. שיטה זו שימשה גם במחקר זיהוי אתר ספציפי phosphorylated ידי PKC...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
HEPES	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	15630
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	208337
EGTA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E3889
DTT	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D9779
β-glycerophosphate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	G9422
Na3VO4	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי
	Calbiochem, נוטינגהאם, בריטניה	539134
ATP	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	A2383
AMP	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	A1752
AMPK	Upstate Biotechnology, אגם Placid, NY	14-840
Nrf2 (WT)	Abnova, טאיפיי סיטי, טייוואן	H00004780-P01
[γ-32P]-ATP	PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA	NEG502A
EZblue ריאגנט צביעה	Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO	G1041
Pfu טורבו DNA פולימראז	Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה	600250
dNTP mix	Agilent Technologies , סנטה קלרה, CA	200415-51	הימנע ממחזור הפשרה והקפאה מרובים
DpnI	New England Biolabs, Ipswich, MA	R0176S
LB broth	Duchefa Biochemie BV, הארלם, הולנד	L1704
Ampicillin	Affymetrix , סנטה קלרה, CA	11259
Agarose LE	iNtRON Biotechnology, סונגנאם, דרום קוריאה	32034
HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit	Real Biotech Corporation, טאיפיי, טייוואן	QDF100
Coomassie Brilliant Blue R-250	Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA	161-0400
סרום בקר אלבומין	Bovogen Biologicals, ויקטוריה, אוסטרליה	BSA100
גלוטתיון Sepharose 4B	GE Healthcare, Marlborough, MA	17-0756-01
חומצה אצטית קרחונים	Duksan כימיקלים טהורים, Ansan, דרום קוריאה
מתיל אלכוהול	Daejung כימיקלים & Metals, Siheung, דרום קוריאה	5558-4410
[header]
טייפון FLA 7000	GE Healthcare, Marlborough, MA	28-9558-09
SDS-PAGE Kit	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	1658001FC
משאבת ואקום	Bio-Rad Laboratories, הרקולס, CA	165-178
מייבש ג'ל	Bio-Rad Laboratories, הרקולס, קליפורניה	165-1746
שייקר רוקד	FINEPCR, סיאול, קוריאה	CR300	המכונה נחוצה לשטיפת
מכונת PCR	מעבדות Bio-Rad, הרקולס, CA	T100
חממה/שייקרים	N-BIOTEK, GyeongGi-Do, קוריאה	NB-205L
מיקרוצנטריפוגות	LABOGENE, סיאול, קוריאה	1730R
עמודות כרומטוגרפיה	מעבדות ביו-ראד, הרקולס, קליפורניה	732-1010