הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

סיכום

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך sarcoplasmic רשת Ca^{2 +} שמורת ובפונקציה הסרת סידן הדיאסטולי ב cardiomyocytes מאת סידן מערכת הדמיה.

תקציר

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. Sarcoplasmic הלב רשת (SR) משמש Ca^{2 +} מאגר של התכווצות, אילו reuptakes תאיים Ca^{2 +} במהלך הרפיה. SR Ca^{2 +} השמורה זמין עבור פעימות קבוע עבור contractibility לב, הסרת Ca תאיים^{2 +} היא קריטית לתפקוד לב diastolic. בתנאים מסוימים הקשורים pathophysiological, כגון סוכרת, אי ספיקת לב, סיווג לקוי סידן ו- SR Ca^{2 +} בחנות cardiomyocytes עשויים להיות מעורבים ההתקדמות בתפקוד הלב. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להעריך SRCa^{2 +} מילואים והסרה הדיאסטולי Ca^{2 +} . בקצרה, cardiomyocyte יחיד הופרדה enzymatically, Ca^{2 +} זריחה תאיים שמציין Fura-2 הוקלט על-ידי מערכת הדמיה סידן. להעסיק קפאין להשראת SR Ca^{2 +} משחרר לגמרי, אנחנו מראש תוכנית מתג זלוף אוטומטית על-ידי interlinking מערכת גירוי ומערכת זלוף. לאחר מכן, ההתאמה עקומה מעריכית-מונו שימש לניתוח קבועי זמן דעיכה של סידן שנחשולי וקטניות קפאין-induced סידן. בהתאם לכך, את התרומה של SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) ו- Na⁺-Ca^{2 +} מחליף (NCX) להסרת סידן הדיאסטולי הוערך.

מבוא

סידן תאיים ([Ca^{2 +}]_אני) מיחזור ממלאת תפקיד קריטי בתקנה של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי cardiomyocytes¹. כפי שאנו יודעים, הנוצרות על-ידי סידן Ca^{2 +} השחרור יוזם עירור-התכווצות מצמד, אשר תרגם את האות החשמלי התכווצות. ממברנה דפולריזציה הפעלת ה-Ca L-סוג sarcolemmal^{2 +} ערוצי, אשר זירוז Ca^{2 +} לשחרר from SR לתוך הציטופלסמה באמצעות קולטנים ryanodine 2 (RyR2). ארעי מוגברות cytoplasmic Ca^{2 +} יוזם התכווצות של myofibrils. במהלך diastole, cytoplasmic Ca^{2 +} היא reuptaken לתוך SR באמצעות SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) לפחות לא יצא cardiomyocyte דרך Na⁺-Ca^{2 +} מחליף (NCX)². תהליך זה מוביל להתכווצות-הרפיה מיחזור ב cardiomyocyte.

SR הלב היא רשת תאיים קרום העוטף את מכונות כויץ. היא משמשת מאגר^{2 +} Ca עבור התכווצות, זה reabsorbs Ca תאיים^{2 +} במהלך הרפיה. SR Ca^{2 +} השמורה זמין עבור פעימות הוא קבוע עבור contractility לב. בינתיים, הסרת Ca תאיים^{2 +} הוא קריטי עבור diastole הלב. בתנאים מסוימים הקשורים pathophysiological, כגון סוכרת, אי ספיקת לב, Ca^{2 +} סיווג לקוי ו- SR Ca מדוכא^{2 +} חנות cardiomyocytes עשויים להיות מעורבים בתהליך בתפקוד הלב^{2,3 ,4}.

למדידת SR Ca^{2 +} שחרור, Ca דיאסטולי^{2 +} הסרת cardiomyocytes, ישנן שתי גישות בשימוש נרחב: השלמות של הזרם NCX המבוסס על תיקון-קלאמפ^5,6ו- Ca קפאין-induced ^{2 +} דופק בהתבסס על האישורים^{2 +} זריחה הדמיה^7,8,9. הגישה תלויה העובדה כי Ca^{2 +} שוחררה מבית SR במידה רבה נשאבים מחוץ לתאים על-ידי NCX. עם זאת, גישה זו הוא מוגבל על ידי שלה הדרישה של המבצע מיומן וציוד מתקדם. במחקר הנוכחי, אנו מתארים גישה נוחה כדי להעריך SR Ca^{2 +} שמורת Ca^{2 +} הסרת השריר על ידי מדידת קפאין-induced Ca^{2 +} דופק המבוסס על Ca^{2 +} זריחה הדמיה מערכת. בקצרה, Ca תאיים^{2 +} זריחה שציין Fura-2. על ידי interlinking על גירוי מערכת ומערכת זלוף, אנו מציגים תוכנית עבור החלפת את זלוף, צועד המערכת באופן אוטומטי. 10 מ מ קפאין הועסק לזירוז במהירות Ca^{2 +} שחרור מוחלט האב קבועי זמן דעיכה מעריכית (טאו) של סידן שנחשולי וקטניות קפאין-induced סידן, התקבלו עקומה מעריכית-מונו מתאים, אשר משקפים את התרומה של SERCA ו- NCX הדיאסטולי Ca^{2 +} להסרת בהתאם.

פרוטוקול

כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד שימוש מרכז מחקר ניסיוני, סין האקדמיה הסינית למדעי הרפואה, אונ' ג'יאנג.

1-פתרון הכנה

1. להכין את כל הפתרונות כפי שמתואר בטבלה 1.

2. בידוד של שמאל חדרית (LV) Cardiomyocytes

הערה: LV cardiomyocytes מבודדים enzymatically באמצעות מערכת זלוף Langendroff כפי שתואר לעיל ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11}-

1. להגדיר את המערכת זלוף Langendroff. למלא את המערכת זלוף פתרון רגיל Tyrode (NT) השוכן הטמפרטורה 36.5 ° C, לחסל את כל בועות האוויר בצינור.
2. שוקל, עזים ומתנגד חולדה ספראג-Dawley בזריקה בקרום הבטן (ip) של מי כלורין (400 מ"ג/ק"ג). לאשר את מצב הרדמה על ידי הערכת התגובה קמצוץ הזנב או הבוהן לאחר 5 דק
3. פתיחת חלל הבטן תחת הסרעפת עם מספריים כירורגיים להרים את הסרעפת, פתח את התיבה המספריים. להסיר את קרום הלב, מעט להרים את הלב עם מלקחיים מעוקל, לזהות את קשת אבי העורקים ולנתק את הלב על ידי מספריים מהשורש של אבי העורקים.
4. להעביר את הלב תבשיל 60 מ מ, לשטוף אותו עם פתרון NT. להחזיק את העורקים עם מלקחיים לנתח מיקרו שני, הר זה על גבי הצינורית זלוף Langendorff ואת בחוזקה מאתרים ומפסיקים העורקים על גבי הצינורית בעזרת תפרים כירורגי.
   הערה: מפעיל מיומן יכול לסיים את התהליך הזה בתוך 15 ס
5. Perfuse את הלב עם 30 מ ל NT פתרון לשחזור זרימת העורקים הכליליים. לאחר מכן, לעבור את perfusate 30 מ ל Ca ^{2 +}-חינם Tyrode פתרון (10 מ מ טאורין, 1 מ"ג/מ"ל BSA) להפסיק את פעימות הלב. בשלב הבא, לעבור את perfusate Collagenase A פתרון בידוד (0.6 מ"ג/מ"ל) אנזים עיכול.
   הערה: השימוש Collagenase A עבור ניסויים עם עכברים סוכרתיים, או Collagenase II לניסויים ללא סוכרת חולדות.
6. לאחר עיכול למשך 20-25 דקות, לשנות במהירות את הפתרון זלוף אל Ca ^{2 +}-חינם Tyrode פתרון לעצור עוד יותר לעיכול. החזקת את הלב עם מלקחיים, מנותקת זה הצינורית, ולמקם את הלב בקערה 35 מ מ המכיל פתרון KB (ראה טבלה 1).
7. לנתח את הקיר LV עם מלקחיים ומספריים. חתוך את אטריום, החדר הימני ואזור צומת atrioventricular. הרקמה הנותרת היא בעירוי; להעביר את זה לתוך תבשיל 35 מ מ חדש עם פתרון KB. מינצ הרקמה LV לחתיכות קטנות.
8. בעדינות pipette החלקים עם טפי פלסטיק מסוננים, וכן להשעות מחדש בפתרון 10 מ"ל KB.
9. לסנן את התאים עם 150 מיקרומטר צמצם נירוסטה המסנן, העברת שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. צנטריפוגה-g x 150 עבור 30 s ו להשליך תגובת שיקוע. מחדש להשעות השריר בפתרון 10 מ"ל KB, חינם להסתפק 6 דקות, למחוק את תגובת שיקוע, וכן להשעות מחדש בגדר בפתרון 10 מ"ל KB.
   הערה: כל הפעולות בוצעו ב 36 ° C בפתרונות בגז עם 100% O ₂.

3. השבת בעלי חיים לטבע סידן

1. לאחר שקאהן התיישב למשך 20 דקות בתמיסה KB, למחוק את תגובת שיקוע, וכן מחדש להשעות את השריר עם סידן השבת בעלי חיים לטבע פתרון A (0.3 מ מ Ca ^{2 +}, 4.5 מ ל Ca ^{2 +}-פתרון Tyrode חינם, פתרון 1.5 mL NT) עבור 10 דקות
2. חוזר את ההליך הנ עם תמיסת סידן-השבת בעלי חיים לטבע B (0.3 מ מ Ca ^{2 +}, 3 מ ל Ca ^{2 +}-פתרון Tyrode חינם, פתרון 3 מ"ל NT).
3. חוזר את ההליך הנ עם פתרון NT (1.2 מ מ Ca ^{2 +}) לטהר את הזמינות של תאי שריר.. לאחסן את השריר LV מבודד בפתרון זה וללמוד אותם בתוך 4-6 ח'

4. הגדרת למעלה של זלוף מערכת

1. לחבר את הצינור תזרים עם הפתרון NT עבור לשכת זלוף ( איור 1 א').
2. עבור זלוף המחט של myocyte המטרה, לחבר את הטיפ סעפת חבית רב (למשל, עיפרון זלוף, המכונה העפרון מעתה ואילך), קבוע micromanipulator, השסתום מבוקרת זלוף המערכת. להוסיף של NT פתרון והפתרון קפאין 10 מ מ, כל עמודה של העיפרון ( איור 1 א').
3. לפנות את כל בועות אוויר בתוך הצינורות כדי למנוע חסימת אוויר.
4. למנות את מספר טפטוף מהקצה מיקרון של העיפרון 10 s, ולהתאים באופן ידני את וסת זרימה לשמור את מהירות הזרימה מהירות משוערת של 3 ס טפטוף/10

5. מדידות של תאיים Ca ^{2 +} ארעי וקיצור סרקומר ^{7 , 8 , 9}

1. פיפטה 10 µL תא ההשעיה בשקופית, לספור את מספרי הטלפון הנייד על ידי מונה תא מתחת למיקרוסקופ, לחשב את הצפיפות. לדלל נייטרלים ריכוז משוער של 50,000 תאים/mL-
2. הוסף Fura-2 acetoxymethyl (AM) מניות (צבע רגיש של סידן) להשעיה 1 מ"ל של השריר כדי להביא את הריכוז הסופי 2 מיקרומטר להשאיר באפלה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
3. צנטריפוגה-150 גרם 30 s ו להשעות מחדש cardiomyocytes NT פתרון 2 פעמים.
4. התור תוריד את האור ולשמור את התאים בחושך. מקם את השריר בבית הבליעה זלוף למשך 15 דקות. לאחר מכן התחל את זלוף קאמרית (1.5 mL/min) עם פתרון NT. את קצב את השריר 1 הרץ שדה גירוי באמצעות ממריץ (גל משך 4.0 ms, הדופק משרעת 8.0 V) עבור 5 דק
5. בחר את myocyte בצורה טובה (צורת מוט, חדות קצה ונקה לקווקוו קרוס), עווית מגורה יציב (אין התכווצות ספונטנית) תחת 10 x עדשה המטרה מיקרוסקופיים. הבא, שינוי רמת ההגדלה מיקרוסקופיים ל- 40 x, וסובב את כיוון מצלמת CCD לשמור את myocyte במצב אופקי.
6. מסגרת myocyte בודד על-ידי התאמת המתאם מסגור תא. להבטיח כי הרקע הוא ברור.
7. לחשוף את השריר אל האור הנפלטת מנורת קסנון, עם 340 או 380 nm גל עירור מסננים, ואת התמונה של השריר דרך יעד 40 x. לאתר פלורסצנטיות שידור-510 ננומטר. בינתיים, שימו לב עם השינויים באורך סרקומר השריר, להקליט באמצעות המודול רך-קצה בו זמנית.
זריחה
8. רשומה על-ידי מערכת האופטיקה כפול-עירור קרינה פלואורסצנטית. להפעיל את התוכנית הקלטה עבור הסידן מערכת הדמיה, לחץ על " קובץ קובץ/חדש " כדי ליצור קובץ הקלטה חדש, לחץ " התחלה " לחצן הרשומה באופן סינכרוני אורך פלורסצנטיות, סרקומר.

6. הערכה של SR Ca ^{2 +} המילואים ו- Ca דיאסטולי ^{2 +} הסרת פונקציה- ^{7 ,}- ^{8 ,}- ⁹

1. לביוקם " Aux Out " יציאות ב- ממריץ עם " אנלוגי ב " יציאות במערכת בקרה שסתום (למשל, מפקד שסתום, ראה טבלה של חומרים) באמצעות כבל BNC (כדי לסנכרן את האות TTL).
2. מראש תוכנית עבור החלפת השסתומים זלוף באופן אוטומטי כפי שתואר לעיל ^{8 , 9}; השלבים המפורטים עבור פעולה מפורטים להלן.
   1. מראש הפרמטרים בשסתום לשלוט תוכנה לפי טבלה 2, ולחץ " להורדה " כפתור כדי להוריד את הרצף טעון בתוכנית. לחץ " Trigger " כפתור כדי להפעיל את הפונקציה על ההדק.
      הערה: מערכת בקרה שסתום יכולים לבצע את הרצף לאחר קבלת האות TTL.
   2. מוגדרת מראש את ממריץ למצב רצף וקבעו את הפרמטרים לפי טבלה 3-
3. להגדיר את ממריץ-" שלב S1 " לצעוד בעירוי נייטרלים ב 1 הרץ. להתחיל את המחט זלוף במהירות של 1.5 mL/min עם פתרון NT.
   הערה: בגלל המהירות של הנחל המחט הוא מהר יותר קאמרית זלוף, השבירה אור של הנחל המחט שונה השבירה אור של הקאמרית זלוף. ההבדל של השתברות האור מציין את טווח יעיל המחט זלוף, המקיף את myocyte היעד.
4. בחר myocyte יעד תחת התצוגה מיקרוסקופיים צריכת חשמל נמוכה (לפי הרצף של הזרם לזרם במעלה), ודא כי ניתן להגיע על ידי מיקרו קצה העיפרון. לשנות את רמת ההגדלה של מיקרוסקופ 400 x. לסובב את כיוון מצלמת CCD לשמור על myocyte את המיקום האופקי. התאם את הצמצם מלבנית תחת המתאם מסגור תא חלון מתאים הממלאת השריר. ודא כי יש רקע מינימלי; אל תאפשר נייטרלים או שאריות תאים מתים בחלון זה אחרים.
5. לכוונן את המיקום של העיפרון נעוצות את micromanipulator ולאחר בזהירות המקום את הטיפ מיקרו במרחק של הרדיוס של שדה הראייה myocyte המטרה תחת 400 x מיקרוסקופ הגדלה.
6. התאמת טווח זרם המחט בעיקר לכסות את myocyte היעד ולוודא כי myocyte לא יכולה להיות נסחף על-ידי הזרם המחט.
7. לאחר 60 s בסיסי צועד, לגלגל שהסמן ממריץ " צעד D2 ".
   הערה: שאר פרוטוקול תבוצע באופן אוטומטי על ידי אחד האביזרים המקובלים לגירוי מערכת הבקרה שסתום. על סמך ההגדרה לעיל, הפרוטוקול היתה אפשרות לבצע באופן אוטומטי כמו דמות 2A, בסיסי צועד עם פתרון NT עבור 60 1 הרץ s. והשהיה צועד ועיכוב 2 s, לעבור במהירות 10 מ מ זלוף קפאין בשביל 15 s (לשחרר באופן פונקציונלי Ca ^{2 +} אחסון SR), ולאחר מכן לעבור בחזרה לפתרון NT.
8. בסוף ההקלטה, לזהות קרינה פלואורסצנטית את הרקע עבור נייטרלים בודדים. לחץ " הפסקה " כפתור להשהות את קובץ ההקלטה, להזיז את התצוגה מיקרוסקופיים על אזור ריק הסמוך. לחץ " שיא " כפתור כדי לחדש את ההקלטה שניות ולהקליט מספריים 340 ו 380 nm ערכי העוצמה לתיקון רקע.
9. פתח " מבצע/קבוע " בתיבת הדו-שיח ולמלא את הערכים לתוך " רקע " טופס, בהתאמה; התוכנה ניתן לתקן Fura-2 יחס ערכים על-ידי חיסור הרקע.

7. ניתוח נתונים ⁹

1. למדידות של סידן תופעות מעבר, סרקומר קיצור בשלב בסיסי pacing, ממוצעות הפולסים עווית ולאחר מכן לנתח פרמטרים דינמיים, כגון סידן תופעות מעבר, זמן קבוע סידן ארעי דעיכה (טאו-1 הרץ), שימוש בתוכנה באופן אוטומטי.
   הערה: אם התוכנה אינה מתאימה על קטע ריקבון. ובכן, לייצא את האיתור ירידה למדידות עקומה מעריכית-מונו ידני.
2. סידן קפאין-induced פולסים, בחר רק את הדופק עם גל תלול לניתוח של הפונקציה הסרת סידן. לא לכלול תאים עם האות הפרעה, דופק נורמלי, או אלה שהוזרמו מידוויי משם.
3. למדוד את משרעת של הדופק קפאין-induced סידן (Ca-קפאין, אינדקס של SRCa ^{2 +} מילואים).
4. לקבל את קבוע הזמן דעיכה של סידן קפאין-induced הדופק (טאו-קפאין) על-ידי עקומה מעריכית-מונו הולם (משך s 10) ידנית של התוכנה ( איור 2C).

תוצאות

כאן, אנחנו להמחיש streptozotocin (STZ) - induced חולדות סוכרתית (DM) ותואמים גיל-ספראג - Dawley (SD) חולדות לדוגמה. חולדות SD זכר בן שבוע 8 (± 200 20 גרם) קיבל זריקה אחת בקרום הבטן של STZ (70 מ"ג/ק"ג, ip) עבור מיט קבוצה או ציטראט המאגר עבור קבוצת הביקורת. שבוע אחרי STZ מינהל, חולדות עם הסוכר > 16.7 mmol/L נחשבו סוכרתית. לאחר 8 שבועות, השריר LV היו מבודדים enzymatically. לאחר, השבת בעלי חיים, סידן לטבע יש כ 70-80% של השריר אשר נותרו במצב הישרדות. נייטרלים היחיד עם רוד-צורה, לקווקוו ברו...

דיון

סידן פלאקס שוחררו את SR היא Ca^{2 +} המקור העיקרי עבור סיסטולה בלב. במידה מסוימת, את משרעת של SR Ca^{2 +} תוכן של ה-Ca החלקי^{2 +} שוחרר את SR משקפים את SR Ca^{2 +} שמורת זמין עבור התכווצות הלב. מצד שני, השמורה^{2 +} Ca של SR תלויה ביכולת של SR Ca^{2 +} ספיגה חוזרת, Ca^{2 +} דליפה של SR ואיזון שלהם על פני SR במהלך diastole^12,13,14. בניסוי שלנו, יישומים מהיר של 10 מ מ קפאין ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucose	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	אלפא Aesar	011594
MgSO4	אלפא Aesar	3337
L-גלוטמי	אלפא Aesar	A15031
טאורין	אלפא Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
קולגנאז A	Roche	10103586001
קולגנאז סוג II	וורת'ינגטון	LS004177
BSA	רוש	735094
קפאין	סיגמא	C0750
פורה-2 AM	Invitrogen	F1201
מיקרוסקופ	אולימפוס	אולימפוס IX 71
מערכת לנגנדורף	בייג'ינג Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
מיקרומניפולטור	Marchauser	MM33 מקשר
תא זלוף	IonOptix	FHD
שסתום מבוקר מערכת זלוף כבידה	ALA	VC 3-8
תוכנת מפקד שסתומים	ALA	VC 3 1.0.1.2
ווסת זרימה מדויק	Delta Med	3204315
Multi-Barrel סעפת זלוף עיפרון	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
מערכות מדידת פלואורסצנטיות ומימד תאים	IonOptix	Hyperswitch
		IonOptix IonWizard 6.2.59
ממריץ	IonOptix	MyoPacer EP
חולדות Sprague-dawley	בייג'ינג מעבדת נהר ויטל טכנולוגיה טכנולוגיה ושות'.	SCXK 2016-01-007436

תוכנת הקלטה