שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

Summary

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

Abstract

הבנה של מערכות ביולוגיות מורכבות דורשת מדידה, ניתוח ואינטגרציה של מערכים מורכבים מרובים של התא החי, הנקבעת בדרך כלל על ידי מדידות תמליליות, פרוטאומיות, מטבוליות וליפידומיות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה פשוטה עבור מיצוי לשחזור של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות aliquot אחד לכל מדגם. שיטת החילוץ מבוססת על אתר מתיל-בוטל אתר: מתנול: מערכת מים לנוזל: מחיצות נוזלי של מטבוליטים הידרופובי וקוטב לשני שלבים בלתי ניתנים לזיהום יחד עם משקעים של חלבונים מקרומולקולות אחרות כמו גלולה מוצק. שיטה זו, אם כן, מספקת שלושה שברים שונים של הרכב מולקולרי ספציפי, אשר תואם באופן מלא עם תפוקה משותפת גבוהה "טכנולוגיות" אומיקס כגון כרומטוגרפיה נוזלית (LC) או כרומטוגרפיה גז (GC) מצמידים ספקטרומטרים המונית. למרות שהשיטה היתה יוזמהΑ שפותחה עבור ניתוח של דגימות רקמות צמח שונות, היא הוכיחה להיות תואם באופן מלא להפקת וניתוח של דגימות ביולוגיות ממערכות מגוונות כמו אצות, חרקים, רקמות יונקים ותרבויות תאים.

Introduction

ביולוגיה של מערכות, אשר צמחה באמצע המאה הקודמת ¹ והתקדם על ידי ניתוח בקנה מידה גדול של נתונים גנומיים transcriptomic נתונים ^{2 , 3} , פיתחה לגישה חדשה חיונית לניתוח של מערכות ביולוגיות מורכבות ^{4 , 5} . המטרה העיקרית של ביולוגיה של מערכות היא לפענח את האינטראקציות של המרכיבים והתלות במערכות הביולוגיות ולגשר על הקשר בין גנוטיפים, מימושם, התמורות המולקולריות והפנוטיפים המתקבלים. לפיכך, שילובם של מערכי נתונים מקיפים, שיוצרו על ידי גישות אנליטיות שונות, כגון גנומיקה, תעתיק, מטבוליומיקה, ליפידומיקה ופרוטומיקה והניתוח החישובי שלהם, הפכו לתנאי מוקדם לתיאור ולהבנה של מערכות ביולוגיות מורכבות.

בס על המגוון הכימי העצום והמורכבות של מרכיבים ביולוגיים בכל מערכת חיים, הייצור של נתונים גדולים ומקיפים של 'אומיקס' מסתמך במידה רבה על איכות שיטת החילוץ המיושמת ⁹ . בנוסף לאיכות שיטת החילוץ, כלכלת השיטה חשובה; זה אומר שזה יהיה רצוי להשיג מידע מולקולרי כמו כמה קלט מדגם קטן ככל האפשר. לעתים קרובות, כמויות מדגם יכולות להיות מגבילות ולכן רצוי מאוד להשתמש בשיטת מיצוי, אשר יכולה להפיק כמו כיתות מולקולריות רבות מתוך מיצוי יחיד של מדגם נתון. משמעות הדבר היא שבמקום להשתמש במספר שיטות מיצוי מיוחדות להפקת מערכים מורכבים שונים מאלוקים מדגמים שונים של אותו מדגם, נעשה שימוש בשיטת מיצוי רציף, אשר מפצלת את המרכיבים המולקולריים של aliquot יחיד לשברים מולקולריים שונים.

_content "> השיטה הנפוצה המשמשת לשיטות חלוקה מפוצלות אלה מבוססת על שיטת הפקת השומנים דו-פאזית מ- Folch et al שפותחה בשנת 1957 ^10. שיטה זו מבוססת על כלורופורם: מחיצות מתנול / מים של מטבוליטים קוטביים והידרופובים שנועדו לנקות ולדגימה de-complex עבור ניתוח ליפידים באיכות גבוהה.עם התפתחות רב של מערכות ביולוגיה אומיקס, שיטת Folch היה עוד, צעד, משופרת על ידי ניצול זה עבור מחיצת המדגם של חלבונים מטבוליטים קוטב ושומנים עבור גז, נוזלים מבוססי כרומטוגרפיה מטבולית וליפידומיה של תרכובות קוטב הידרופובי, בנוסף פרוטאומטי נוזלי מבוססי כרומטוגרפיה ^{11 , 12 , 13 , 14.} למרבה הצער, כל השיטות הללו מסתמכים על שיטת מיצוי המבוססת על כלורופורם, אשר לא רק מוביל לא רצויRmation של גלולה חלבון כמו interfase בין הקוטב לבין השלב בשלב, אבל הוא גם ממס בלתי רצוי מנקודת מבט כימיה ירוקה ^{15 , 16} . עם זאת, מתיל המיל טרט בוטיל אתר (MTBE) מתגבר על שתי הבעיות הנ"ל והוא תחליף מתאים כלורופורם. בהתאם לדרישות אלו, החלטנו להקים שיטת מיצוי המבוססת על מים המבוססת על מתנול: MTBE, אשר ממלאת את כל המפרטים הנ"ל ולכן פועלת כנקודת מוצא אידיאלית לניתוח רב-אומני מקיף.

פרוטוקול זה מנחה את המשתמש צעד אחר צעד באמצעות זרימת עבודה פשוטה, מהירה לשחזור של הכנת המדגם, כולל פתרון בעיות של בעיות שנצפו בדרך כלל. יתר על כן, נביא בקצרה נתונים אנליטיים למופת של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית-עלית (UPLC-MS)Lipidomics אד, metabolomics ו proteomics פרופיל מ דגימת רקמת הצמח. למרות הדוגמאות הנתונות נגזרים מ 50 מ"ג של דגימת רקמה ארבידופסיס thaliana עלה, פרוטוקול זה שימש במשך כמה דגימות ביולוגיות אחרות רקמות, כולל אצות ^{17 , 18} , חרקים ¹⁹ ותאי יונקים, איברים ורקמות ^{20 , 21 , 22} . היקף פרוטוקול החילוץ המוצג הוא לספק תיאור ברור ומפורט של טרום הדגימה טיפול מדגם הליך החילוץ עצמו. למרות שאנו מספקים שלוש דוגמאות קצרות של היישום האנליטי, מידע מפורט על הטיפול טרום ואחרי נתונים אנליטי ניתן לקבל מן הפרסומים הקודמים שלנו ^{16 , 23 , 24 ,} 25 ^{, 26} .

Protocol

זהירות : מתנול (MeOH) ו- methyl tert- bututher אתר (MTBE), המשמשים במהלך החילוץ, הם דליקים, ויכולים להיות, על חשיפה ממושכת ו / או מגע, גירוי בדרכי הנשימה, בעור או בעור. יש לטפל בהם בזהירות רק במכסה המנוע ולהשתמש בהליכי הבטיחות המתאימים במהלך החילוץ (חלוק מעבדה, משקפי מגן, כפפות וכו ' ). חנקן נוזלי וקרח יבש, המשמש במספר שלבים של פרוטוקול זה, עלול לגרום לכוויות קשות על ידי מגע ממושך של העור. נא לטפל בהם בזהירות על ידי כפפות מגן וכוסות. משתמשים יכולים להשתמש בכימיקלים שונים, ריאגנטים או סטנדרטים פנימיים לניתוח המדגם, שחלקם עשויים להיות רעילים. בדוק את גליונות נתוני בטיחות כימיים רלוונטיים עבור כל חומר המשמש.

1. איסוף והפקת דגימות ביולוגיות

1. הכן צינורות קצירת שכותרתו.
   הערה: הנה, קציר דגימות ביולוגיות שכותרתו, 2 מ"ל, עגול התחתונה, בטוח במקוםK צינורות microcentrifuge המכילים שני קוטר 5 מ"מ, כדורי מתכת עבור homogenizer רקמות.
2. הכן דיוואר חנקן נוזלי מלא.
3. קציר המדגם הביולוגי להצמיד להקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. בצע את הצעד הזה מהר ככל האפשר תוך מספר שניות, כדי למנוע שינויים מטבוליים המושרה על ידי פציעה.
   הערה: למטרות הדגמה, השתמש רוזטה עלים 30 בן wild- ripidopsis thaliana (Col-0) גדל על אדמה בתנאי יום ארוך.
4. שמור על דגימות שנקטפו על קרח יבש עבור הפסקות לטווח קצר או לאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס לתקופות ארוכות יותר.

2. גריסה ושיבוש רקמות

1. טרום מגניב מחזיקי צינור של homogenizer רקמות חנקן נוזלי במשך 10 דקות לפחות. אם homogenizer רקמות אינו זמין, השתמש מרגמות נקיים מראש מקורר ועלי.
2. קח את דגימות מן החנקן נוזלי, קרח יבש או -80 ° C מקפיא ומניחים אותם מראש מקוררמחזיק צינורות.
3. במהירות לשים את מחזיקי צינור ב homogenizer רקמות.
4. טוחנים את החומר הביולוגי לאבקה דקה והומוגנית. השתמש 20 הרץ במשך 1 דקות עלים.
   הערה; הומוגניזציה זמן ומהירות עשויים להיות מגוונים בהתאם לרקמה, ודא כי המדגם הוא homogenized לתוך אבקת דק, כי אבקה נשמרת קפואה בכל צעד של homogenization.
5. קח את דגימות ביולוגיות מן מחזיקי צינור ולשמור אותם קפואים עד מיצוי נוסף.

3. שקילה של רקמות

1. השתמש איזון אנליטית עם דיוק מספיק עבור כמויות המדגם הנדרש.
2. הכן מסומן 2 מ"ל התחתונה התחתונה בטוח לנעול microcentrifuge צינור.
3. טרום לקרר את צינורות spatulas בחנקן נוזלי.
4. Aliquot את הכמות הנדרשת של אבקת רקמות לתוך צינור 2 מ"ל בטוח לנעול microcentrifuge.
   זהירות: הימנע כל הפשרה של חומר הצמח על ידי מזעור הזמן שנלקח WEigh את דגימות.
5. החזרת הדגימות aliquoted מיד לאחר שקילה חנקן נוזלי.
6. שיא עבור כל מדגם את המשקל המדויק. השתמש 10-50 מ"ג ± 10% עבור רוב הרקמות הצמח.
7. חנות דגימות aliquoted ב -80 מעלות צלזיוס עד מיצוי נוסף.

4. הגדרת מגיב

1. השתמש תערובת מיצוי של מתיל טרט בוטיל אתר (MTBE) / מתנול (MeOH).
   1. להכנת 100 מ"ל מיצוי החילוץ, להוסיף 75 מ"ל של MTBE ל 25 מ"ל של MeOH לעשות תערובת של MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol).
   2. הוספת סטנדרטים פנימיים עבור ניתוח שלאחר ניתוח בהתאם לצרכים אנליטיים. בדרך כלל, מוסיפים 50 μL של 1,2-diheptadecanoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (1 מ"ג / מ"ל ​​ב כלורופורם) כסטנדרט פנימי לניתוח השומנים מבוססי UPLC-MS, תוך הוספת 50 μL של ¹³ C סורביטול ( 1 מ"ג / מ"ל ​​במים) כסטנדרטים פנימיים לניתוח GC-MS מבוססי העיקרימטבוליטים. סטנדרטים פנימיים של ניתוח מטבוליטים UPLC-MS מבוססי הם 50 μL של קורטיקוסטרון (1 מ"ג / מ"ל ​​ב מתנול) ו 25 μL של אמפיצילין (1 מ"ג / מ"ל ​​ב מתנול).
   3. מעבירים את הממס לבקבוק זכוכית נקי ששטף בתערובת MTBE: MeOH.
   4. אחסן את תערובת החילוץ עד שבוע 1 ב 4 ° C.
      הערה: אין לאחסן את תערובת החילוץ לפרקי זמן ארוכים יותר כדי לשמור על תוצאות לשחזור.
2. כדי לגרום הפרדת פאזה, להשתמש במים (H ₂ O) / מתנול (MeOH).
   1. להכנת 100 מ"ל H ₂ O: MeOH, להוסיף 75 מ"ל של H ₂ O ל 25 מ"ל של MeOH לעשות H ₂ O: MeOH (3: 1, vol / vol).
   2. מעבירים את הממס לבקבוק זכוכית נקי ששטף בתערובת H ₂ O: MeOH. ממס זה יכול להיות מאוחסן במשך מספר שבועות בטמפרטורת החדר.

5. מיצוי דוגמאות

1. טרום מגניב את מיצוי מIxture (MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) עד 20 ° C באמצעות מערכת קירור נוזלי או מקפיא -20 ° C.
2. להוציא את aliquoted דגימות אחד אחד ולהוסיף 1 מ"ל של תערובת מיוצר מראש הצינור על כל צינור מדגם. זהירות: בצע את הצעד הזה במהירות עקב צמיגות נמוכה של MTBE.
3. מערבבים מיד על מערבולת מערבולת עד הרקמה היא homogenized היטב בתוך תערובת מיצוי.
   הערה: צעד זה חשוב מאוד, שכן הוא נדרש כדי לזרז את החלבונים ואת פעיל את הפעילות האנזימטית שלהם.
4. לדגור את כל הדגימות על שייקר מסלולית בסל"ד 100 במשך 45 דקות ב 4 ° C.
5. Sonicate דגימות במשך 15 דקות באמבטיה sonication מקורר קרח.

6. פיצול על ידי הפרדת שלב

1. הוסף 650 μL של H ₂ O: MeOH (3: 1, vol / vol) לכל צינור מדגם.
2. מערבבים היטב על ידי vortexing במשך 1 דקות.
3. צנטריפוגה דגימות במהירות של 20,000 x גרם 5 דקות ב 4 ° C.
   הערה: לאחר שלב זה, ישנם שני שלבים נוזליים בלתי ניתן עם גלולה מוצקה בתחתית הצינור.
   זהירות: ידית את הצינורות בזהירות כדי למנוע ערבוב של שני שלבים נוזליים ולמנוע שיבוש גלולה זירז.

7. Aliquoting של שברים פולאר ו הידרופובי

1. העברת 500 μL של ממס מן העליון, השומנים המכילים שלב, לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge שכותרתו.
   הערה: דגימות השומנים aliquoted ניתן מרוכז ישירות עבור ניתוח מיידי UPLC-MS (שלב 8.1) או מאוחסנים במשך מספר שבועות ב -80 ° C.
2. לאחר μL 500 מוסרים מן המדגם, להסיר את השלב השומנים הנותרים באמצעות פיפטה 200 μL.
3. העברת 400 μL של ממס מן השלב התחתון (קוטב וחצי קוטבולי מטבוליטים) לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge שכותרתו. דגימות הקוטב aliquoted ניתן מרוכז ישירות עבור ניתוח מיידי UPLC-MS (שלב 8.2) או מאוחסניםR כמה שבועות ב -80 ° C.
4. קח aliquot נוסף של 200 μL לבצע ניתוח נוסף, למשל ניתוח כרומטוגרפיה גז מבוסס מטבוליט כפי שתואר ביוקר ¹⁶ .
5. הסר את שארית השלב מימית ידי pipetting את נפח עודף.
6. שטפו את החלבון המתקבל, עמילן, תא קיר גלולה עם מתנול μL 500 על ידי ביסודיות vortexing אותו במשך 1 דקות.
7. צנטריפוגה דגימות במהירות של 10,000 x גרם 5 דקות ב 4 ° C.
8. ביצוע חלבון מיצוי העיכול (שלב 11) או עמילן / קיר התא ניתוח כפי שתואר לעיל ¹⁶ .
   הערה: אם לא נעשה שימוש מיידי, אלה כדורי יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות ב -80 מעלות צלזיוס.

8. ריכוז ואחסון של שברים

1. לאדות את הממס מדגימות שומנים (משלב 7.1) או concentrator ואקום ללא חימום (במשך 1-2 שעות) או עדיף להשתמש ניטרOgen זרימת evaporator כדי למנוע שינויים חמצון של שומנים.
   הערה: דגימות מיובשות יש לנתח מיד. לאחסון, להשאיר דוגמאות בפתרון MTBE, אידיאלי בקבוקוני זכוכית (שלב 7.1).
2. לאדות את הממס מן דגימות מימיות (משלב 7.3 או 7.4) בן לילה concentrator ואקום ללא חימום. הערה: דגימות יבשים ניתן לאחסן במשך מספר שבועות ב -80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.

9. ניתוח של ליפידים באמצעות UPLC-MS ²⁴

1. Re- להשעות את השברים שומנים מיובשים (משלב 8.1) ב 400 μL של אצטוניטריל: 2-propanol (7: 3, Vol / vol).
2. העברת נוזלים מספיק כדי בקבוקונים זכוכית וכובע בחוזקה.
3. שים את בקבוקונים זכוכית autosampler זכוכית מקורר (4 מעלות צלזיוס).
4. להזריק 2 μL לכל מדגם להפריד את השומנים על שלב הפוך (RP) C ₈ טור שנערך ב 60 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת UPLC פועל בקצב זרימה של 400 μL / min.
5. השתמש בניידשלבים המתוארים בטבלה 1 עבור ההפרדה הכרומטוגרפית.
6. רכש את הספקטרום המונית במצב יינון חיובי ושלילי באמצעות מכשיר מתאים MS מכסה את טווח המונים בין 150 ל 1500 m / z.

10. ניתוח של מטבוליטים פולאר חצי קוטבי באמצעות UPLC-MS ²⁵ .

1. Re- להשעות את השלב קוטב (משלב 8.2) ב 200 מתיל μL UPLC כיתה: מים (1: 1, כרך / כרך).
2. העברת נוזלים מספיק כדי בקבוקונים זכוכית וכובע בחוזקה.
3. שים את בקבוקונים זכוכית autosampler זכוכית מקורר (4 מעלות צלזיוס).
4. להזריק 2 μL מדגם זה להפריד את המטבוליטים על עמודה R C ₁₈ שנערך ב 40 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת UPLC פועל בקצב זרימה של 400 μL / min.
5. השתמש בשלבים ניידים הפרדה כרומטוגרפית עם הפרמטרים המופיעים בטבלה 2 .
6. לרכוש סריקה מלאה מסה מלאה במצב יינון חיובי ושלילי לנוIng ספקטרומטר המוני מתאים כיסוי טווח המוני בין 50 ל 1500 מ '/ z.

11. חלבון מיצוי, עיכול וניתוח ¹⁶

1. Re- להשעות את חלבון שטף / עמילן / תא קיר גלולה (משלב 7.8) ב 200 μL של חיץ החילוץ של חלבון בחירה. הערה: אנו משתמשים במאגר אוריאה / תיוריה (5 M אוריאה, 2 mM thiourea, 15 מ"מ DTT, 2% CHAPS ו מעכבי פרוטאז ו phosphatase) ²⁷ .
2. Sonicate דגימות למשך 10 דקות באמבטיה קולית מקורר.
3. דגירה דגימות במשך 30 דקות על שייקר מסלולית (100 סל"ד) בטמפרטורת החדר.
4. צנטריפוגה חלבונים מומס ב 10,000 x גרם במשך 5 דקות.
5. איסוף supernatant חלבון בצינור חדש.
6. לקבוע את ריכוז החלבון מן supernatant שנאספו ²⁸ .
7. Digest 50 מיקרוגרם של חלבון בתמיסה עם פרוטוקול של בחירה. בדרך כלל, להשתמש טריפסין / Lys-C לערבב אקורדיNg אל הוראות ההפעלה.
8. לאחר העיכול, לבצע desalting של הפפטידים לפני ספקטרומטריית מסה באמצעות C ₁₈ שלב הבמה elute מתעכל פפטידים ²⁹ .
9. לרכז את הדגימות עד יובש קרוב concentrator ואקום ללא חימום.
10. Re- להשעות את הדגימות במאגר טעינה המתאים (למשל 5% אצטוניטריל, חומצה פורמית 0.5%) ולנתח את תערובות פפטיד על ידי LC-MS / MS באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה מחובר למערכת ננו LC.
    הערה: הנתונים productomics למופת המוצגים בפרוטוקול זה, השתמשנו שיפוע כמתואר בטבלה 3 .
11. הגדר את ספקטרומטר המסה, באמצעות אסטרטגיה 15 העליון, שבו אחד מלא סריקה (FS) היה ואחריו עד 15 נתונים תלוי MS / MS סריקות, את הפרמטרים הבאים: FS היה בטווח המוני 200-2000 מ '/ z ב החלטה של ​​70,000 עם ערך היעד של 3x10 ⁶ יונים. השג את סריקות MS / MS הנתמכות על-ידי נתונים על-ידי רמות גבוהות יותרדיסוציאציה קולסיאלית (HCD). הגדר את ערכי היעד עבור MS / MS ל 1e ⁵ יונים, עם זמן מילוי יון מקסימלי של 50 אלפיות השנייה, חלון בידוד של 4.0 מ '/ z, אנרגיה התנגשות מנורמל (NCE) של 30% יחס מילוי של 1%. מדוד את MS / MS יונים ברזולוציה 17.500 ואת ההדרה הדינמית נקבע 60 s.

Results

נתונים מקיפים רב Omics נתונים הם יקרים להבנה של מערכות ביולוגיות מורכבות. האסטרטגיה לניסוי ביולוגי מוצלח מתחילה בדרך כלל מעיצוב ניסיוני משמעותי, הגדרת ניסוי וביצועים, ואחריו איסוף מדגם, מיצוי, איסוף נתונים אנליטיים, עיבוד נתונים גולמי, ניתוח נתונים סטטיסטיים, זיהוי מטבוליטים רלוונטיים ופרשנות נתונים ביולוגית כולל מיפוי נתיב ויזואליזציה ( איור 1 ).

בפרוטוקול החילוץ שהובא כאן, אנו מתמקדים במדגם-איסוף, -להטוט צעדים צעדים, אשר מתוארים סקירה מפורט עבודה בתרשים 2 . למטרות הדגמה נבחרה 50 מ"ג של רקמת רקמת ארבידופסיס. חומר זה נקצר, הקרקע וחולץ לפני שהכניסו אותו לשלושהמופת אנליטי UPLC-MS פלטפורמות, מתן נתונים שניתן להשתמש בהם עבור ניתוח ממוקד ובלתי ממוקדת ליפידומית, metabolomic ו proteomic. תרשימים 2 ו -6 כוללים גם תמונות נציג איך, בתנאים סטנדרטיים, ממיס החילוץ צריך להיראות. בנוסף, דוגמאות של דגימות המכילות כמויות מופרזות של מקרומולקולות זירז (חלבונים ועמילן) ודגימות עם homogenization מדגם הולם מוצגים ( איור 3 ). פתרון בעיות אלה שתי בעיות נפוצות ניתנת בקצרה באיור 3 אבל זה גם דנו בפירוט רב יותר בפרסום הקודם שלנו ¹⁶ .

דמויות 4 ו -5 דוגמאות המתאר של שלושה chromatograms אנליטי נגזר השומנים, הקוטב / semI-polar מטבוליטים וניתוח חלבון. ליפידים, אשר נלקחו משלב MTBE העליון ( איור 2 ), נותחו על ידי שלב כרומי (PhR) C ₈ כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. ליפידים ניתן לרכוש באמצעות מצבי יינון MS חיוביים ושליליים ( איור 4 , חלונית העליונה) ^{16 , 24} .

קוטבי ו קוטב חצי משנית מטבוליטים ראשוניים ומשניים נותחו מן הקוטב (מים / מתנול) שלב ( איור 2 ) על ידי שלב הפוך (RP) C ₁₈ UPLC-MS ²⁵ . השיטה המתוארת, תוך שימוש בכרומטוגרפיה הפוכה, תואמת מאוד את ניתוח המטבוליטים הקוטביים למחצה (כלומר מטבוליטים ממטבוליזם משני של הצמח), וניתן לנתח אותם באמצעות מצבי יינון חיוביים ושליליים ב- MS( איור 4 , חלונית תחתונה) ¹⁶ . יותר מטבוליטים הידרופיליים של חלק זה (סוכרים, חומצות אמינו קוטביות וכו '), אשר אינם מראים שימור טוב על החומר בשלב הפוכה, ניתן לנתח על ידי שיטות אנליטיות אחרות כגון GC-MS ¹⁶ או הידרופיליות אינטראקציה כרומטוגרפיה ³⁰ .

החלבונים, אשר נלקחו גלולה מוצק בתחתית צינור החילוץ ( איור 2 ), היו ב-פתרון מתעכל מנותח באמצעות אקדח ירה LC-MS ( איור 5 ), בעוד פרוטוקול להפקת עמילן קיר התא החומר ניתן לקבל פרוטוקול שפורסם בעבר שלנו ¹⁶ .

לסיכום, יותר מ -200 מינים שומנים, 50 מטבוליטים חצי קוטביים המצוין וכמה אלפי proteiNs יכול להיות מזוהה באופן שגרתי מדוגמאות מהסוג המשמש בדוגמה שלנו. בנוסף, השיטה הראתה הישימות רחב באמצעות רקמות שונות, איברים חומר התרבות התא ( איור 6 ).

איור 1: זרימת עבודה כללית עבור בקנה מידה גדול ניתוח לא ממוקד אומיקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2 : הכנת דוגמאות והפקת זרימת עבודה לניתוח ליפידים, מטבוליטים וחלבונים מאלומיניום יחיד של דוגמא ביולוגית.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 : דוגמאות להמחשה של בעיות שנצפו בדרך כלל באמצעות פרוטוקולים לחלוקת פאזה של שני פאזות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4 : Chromatograms נציג של מטבוליטים ליפידים חצי קוטבי מ ארבידופסיס thaliana תמציות עלה. בסיס שיא chromatogramS של ליפידים (חלונית העליונה) ו חצי קוטב מטבוליטים (חלונית תחתונה) ניתח במצב יינון חיובי ¹⁶ . תרשימי העוגה בפינה הימנית העליונה של כל כרומטוגרם מראה את מספר השומנים והמטבוליטים המזוהים לשיעורים כימיים שונים. Chl, chlorophylls; דאג, diacylglyceride; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; FA, חומצת שומן; LysoPC, lysophosphatidylcholine; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylthanolamamine; PG, פוספטידיגליצרול; PI, phosphatidylinositol; נ.ב., phosphatidylserine; SP, sphingolipid; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, triacylglyceride. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5 Trong>: נציג בסיס שיא כרומטוגרמה של פפטידים מ ארבידופסיס thaliana תמציות עלה.
תרשים העוגה מראה בפינה הימנית העליונה מציין את מספר החלבונים שזוהו לתהליכים ביולוגיים שונים ¹⁶ . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 : דוגמאות מיצוי נציג סוגים שונים של רקמות מן Wild-type Arabidopsis thaliana .
כל הדגימות חולצו באמצעות 50 מ"ג משקל טרי מן הרקמות שצוינו."> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

זמן (דקות)	% מאגר למאגר B
0 עד 1 דקות	45% א	מאגר A: 1% 1M NH4 אצטט, חומצה אצטית 0.1% במים UPLC MS כיתה
1 עד 4 דקות	שיפוע לינארי מ 45% עד 25% A	מאגר B: 1% 1M NH4-אצטט, חומצה אצטית של 0.1% באצטוניטריל / איזופרונול 7: 3, (v: v)
4 עד 12 דקות	שיפוע לינארי מ 25% ל A 11% א	קצב זרימה 400 μL / min
12 עד 15 דקות	שיפוע לינארי מ 11% A ל 0% A	נפח הזרקה 2 μL
15 עד 19.5 דקות	שטפו את העמודה 4.5 דקות עם 0% A
19.50 to 19.51 min	חזרה ל 45% א
19.51 עד 24 דקות	לאזן עם 45% A

טבלה 1: הפרמטרים צבע עבור הפרדת RP-UPLC של ליפידים. RP, שלב הפוך. UPLC, כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים.

זמן (דקות)	% מאגר למאגר B
0 עד 1 דקות	99% א	מאגר A: חומצה פורמית 0.1% במים כיתה UPLC
1 עד 11 דקות	שיפוע לינארי מ -99% A עד 60% A	מאגר B: חומצה פורמית של 0.1% ב - ASLC גראטוניטריל UPLC
11 עד 13 דקות	שיפוע לינארי מ 60% עד 30% א	קצב זרימה 4001, L / min
13 עד 15 דקות	שיפוע לינארי מ 30% A עד 1% A	נפח הזרקה 2 μL
15-16 דקות	שטפו את העמודה עבור 1 דקות עם 1% A
16 עד 17 דקות	שיפוע לינארי מ 1% עד 99% A
17 עד 20 דקות	לאזן במשך 3 דקות ב 99% A

טבלה 2: הפרמטרים צבע עבור הפרדת RP-UPLC של מטבוליטים פולאר וקוטב חצי. RP, שלב הפוך. UPLC, כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים.

זמן (דקות)	% מאגר למאגר A
0 עד 5 דקות	שיפוע לינארי בין 0 ל -10%	מאגר A: חומצה פורמית 0.1% במים כיתה UPLC
5 עד 80 דקות	שיפוע לינארי מ 10% ל 40%	מאגר B: 0.1% חומצה פורמית ב 60% UPLC כיתה אצטוניטריל
80 עד 85 דקות	שיפוע ליניארי מ 40% ל 60%	קצב זרימה 300 nL / min
85 עד 86 דקות	שיפוע ליניארי מ -60% ל -95%	נפח הזרקה 5 μL
86 עד 91 דקות	לשטוף עמודה 5 דקות עם 95%
91 דקות 92 דקות	שיפוע ליניארי מ 95% ל 0%
93 עד 110 דקות	לאזן את הטור במשך 17 דקות ב 0%

טבלה 3: הפרמטרים צבע עבור הפרדת ננו LC של פפטידים. LC, כרומטוגרפיה נוזלית.

Discussion

במאמר זה אנו מתארים וממחישים פרוטוקול מיצוי פשוט ויישומי מאוד לניתוח ליפידומי, מטבולומי ופרוטומטי מקיף מדגם עלה בודד של 50 מ"ג. השיטה שימשה בעבר במספר מחקרים, שפורסמו בכתבות מגוונות ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37} והוכיח, בנוסף ישר קדימה שלהזרימת עבודה וישימות גבוהה להיות חזקים לשחזור.

כאן סיפקה יישומים להראות כמה שיטות שגרתיות עבור ההקרנה הראשונית של מדגם ביולוגי מורכב. אלה נתונים בקנה מידה גדול metabolomic ו lipidomic ערכות נתונים יכולים לספק מידע מקיף על השינויים רחב או ספציפי של מטבוליזם של המערכת הביולוגית ניתח, בעוד הנתונים המתקבלים מניתוח של חלבונים, מספק תובנות כמותית (שפע) ואיכותי (שינויים ) שינויים של אנזימים, חלבונים מבניים או גורמי שעתוק (TFs) השולטים בפונקציות הסלולר ובמכונות. בהתאם לכך, לנתוני אומיקס אינטגרטיביים יש פוטנציאל לחשוף מידע ראשוני על שינויים אפשריים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או ביוטיות ו / או אביוטי של מערכת ביולוגית, על ידי הבהרת שינויים מולקולריים של מולקולות מגוונות הקשורים מסלולים מטבוליים ספציפיים או תהליכים תאיים.

כמובן, בטווח הארוך, זה חיוני למדי, עבור ניתוח מוצלח של ביולוגיה מערכות, על מנת למקסם את מספר גופים מולקולריים נותחו ומורשים, המאפשר ניטור של פונקציות ופעילויות סלולריות באופן מלא ככל האפשר. לשם כך, השברים שהתקבלו ניתן ליישם בנוסף שיטות אנליטיות מגוונות, מיקוד תרכובות נוספות או כיתות מתחם ( איור 4 ).

עם זאת, יש לציין כי אסטרטגיית הניתוח הגלובלית של הנתונים המתקבלים יכולה להיות בעקבות שתי אסטרטגיות שונות: מצד אחד, אנו מדגישים את ההבהרה של פונקציות הסלולר על ידי כימות של תרכובות ידועות. מצד שני, רבים של מטבוליטים שנמדדו ושומנים עדיין לא ידוע או ביאורים. אלה, עדיין, ללא שם לב מדידות מורכבות מכילים גם שפע של מידע משמעותי, אשר, ניתן להשתמש בשיטות סטטיסטיות עבור סיווג או אפליה בבין קבוצות או טיפולים ^{20 , 21 , 22} .

עם זאת, אלה compounds ידוע, במיוחד אלה רלוונטיים עבור סיווג קבוצה או לשמש biomarkers צריך להיות מזוהה. תהליך זיהוי זה הוא למרבה הצער די משעמם ולא ניתן להשיג ללא מדידות אנליטיות נוספות או אסטרטגיות ³⁸ . כפי שניתן לראות בתרשים 4 , מספר התרכובות הלא-מסובכות גבוה למדי (למעשה הרוב המכריע). עם זאת, כאמור לעיל, פסגות כרומטוגרפיות אלה יכולות להיות מטופלות במסגרת ניתוח הנתונים, ולכן ניתן להשפיע על הגורמים המשפיעים באופן משמעותי על הישויות ועל מנת לעמוד באסטרטגיות זיהוי נוספות.

לסיכום, אנו יכולים להסיק כי כאן הציג פרוטוקול מספק מספר יתרונות עבור מערכות ביולוגיה ניסיונית כמו גם עבור יישום סטטיסטי קלאסיAtions.

ראשית, מאחר שכל השברים מופקים ממדגם יחיד, השונות בין נתוני הניסוי השונים (ליפידים, מטבוליטים, חלבונים) מופחתת באופן משמעותי, שכן כל קבוצת נתונים נגזרת מאותו אלכוה מדגם. זה בבירור מוביל להשוות מוגברת של התוצאות שהתקבלו.

שנית, השיטה היא מדרגית בקלות עושה את זה ולכן תואם מאוד עם סכומים מדגם קטן עד גדול. אנו משתמשים באופן שגרתי 10-100 מ"ג של דגימות רקמה, אך מחקרים מוצקים ליפידומית בוצעו גם על כ 20 זרעים ארבידופסיס ³¹ . במיוחד תאימות עם כמויות מדגם קטן עושה את השיטה החלה אם כמויות מוגבלות של רקמות ביולוגיות או דגימות זמינים. ובכל זאת, גם אם מספיק חומר מדגם זמין, השיטה המוצגת כאן מציעה את היתרון לנצל דגימות אלה במספר גדול יותר של משכפל ניסיוני במקום uלשיר אותם עבור הליכי מיצוי שונים. זה מאפשר ניתוח נתונים סטטיסטיים טובים יותר מעודן.

שלישית, מאחר שהשיטה מתבססת על חלוקה נוזלית-נוזלית של מולקולות קוטביות ולא קוטביות, היא מספקת, להבדיל משיטות מיצוי פשוטות חד-פאזיות ( למשל, תמציות מתנול) צעד משמעותי דה-מסובך בהליך. זה יעיל מדגם דה מורכבות מוביל טיהור חלקי של שברים בודדים עקב ההפרדה של מולקולות מפריעות כימית אחד מהשני. לפיכך, תהליך החלוקה הכימית לא רק מספק יתרון מעשי עבור aliquoting שיטתי של דגימות חילוץ לתוך כיתות כימיים שונים, אלא גם משפר את המדידות האנליטיות הפרט, שכן הוא מסיר תרכובות מזהמים מן שברים שונים. ברור, אנו יכולים להבחין כי במיוחד את השומנים, אשר מחולקים לשלב אורגני אשר בדרך כלל להשפיע לרעה עלאנליזה כרומטוגרפית של תרכובות קוטביות, תיעלם כמעט לחלוטין משבריר הקוטב. הדבר נכון גם לניתוח של שומנים הידרופובי, אשר יהיה מדולדל של תרכובות הקוטב. מלבד הטיהור של תרכובות קוטביות ולא קוטביות זה מזה, אנו לרוקן ולאסוף חלבונים ומולקולות מקרו אחרות מן המדגם, אשר לא רק מספק חלק נפרד, אשר יכול להיות מנוצל עבור חלבון, עמילן וניתוח קיר התא ¹⁶ , אלא גם מוביל מדגם נקי בתוך שברים בודדים. זה רלוונטי במיוחד, שכן ידוע כי נוכחות של מקרומולקולות גדולות, מוביל נזק או לפחות חיים קצרים יותר של העמודות האנליטיות.

ואחרון חביב, שיטת החילוץ MTBE המתואר, אשר מסתמך על מסוכן פחות וחסכוני יותר החלפת כלורופורם ממס ¹⁵ , כבר הוצגו על ידי מספר מחקרים מהקבוצה שלנו, להיות appl applIcibility עבור דגימות ביולוגיות שונות מן הצמחים ¹⁶ , אצות ^{17 , 18} , זבובים ^19, אלא גם כמה רקמות יונקים, איברים או תאים ^{20 , 21 , 22} .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>ריאגנטים ותקנים
אמפיצילין	סיגמא אולדריץ'	A9393-5G	תקן פנימי למטבוליטים
קורטיקוסטרון	סיגמא אולדריץ'	27840-500MG	תקן פנימי למטבוליטים, HPLC דרגה
13C סורביטול	סיגמא אולדריץ'	605514	תקן פנימי למטבוליטים, ISOTEC®   איזוטופים יציבים
1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (17:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850360P	תקן פנימי לליפידים
מתנול (MeOH)	Biosolve Chemicals	13684102	מים בדרגת ULC-MS
			בדרגת ULC-MS
	Biosolve Chemicals	13890602	בדרגת HPLC
	Promega	V5072	עיכול אנזימטי של חלבונים
<חזק>ציוד
איזון	תאגיד Sartorius	14 557 572
טחנת מערבל טחינת רקמות	Retsch, טחנת מיקסר MM 300	20.746.0001
טיט ועלי	מערבל מערבולת סיגמא אולדריץ'	Z247464-1EA
	מערבולת-ג'יני 2, דגם G560	SI-0236
רכז ואקום	מהירות סריקה מקסי ואק אלפא מאיידים	7.008.500.002
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה נעילה בטוחה	Eppendorf	30120094	משמש להרחבת דגימה
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה	Eppendorf	30120086	משמש לשברים
שייקר	Eppendorf Thermomixer 5436	2050-100-05
Sonicator	USC 300 TH	142-0084
מיקרוצנטריפוגה מקוררת	אפנדורף, דגם 5427R	22620701
מערכת UPLC	מערכת Waters Acquity UPLC (Waters, Machester, UK)
מערכת MS	Exactive, מסוג Orbitrap, MS (Exactive, Thermo-Fisher, ברמן, גרמניה).
עמודת C8 אתיל היברידית מגושרת (RP) בשלב הפוך (BEH) (100 מ"מ ופעמים; 2.1 מ"מ המכיל 1.7 μ חלקיקים בקוטר m)	ווטרס, מאצ'סטר, בריטניה	186002878	ניתוח של ליפידים
RP סיליקה בעלת חוזק גבוה (HSS) עמודת T3 (100 מ"מ ופעמים; 2.1 מ"מ המכיל 1.8 μ חלקיקים בקוטר m)	ווטרס, מאצ'סטר, בריטניה	186003539	ניתוח מטבוליטים
Q ExactivePlus ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה המחובר למערכת EASY-nLC 1000	תרמו-פישר, ברמן, גרמניה		ניתוח פפטידים