מאמר שיטה

הרחבת אדיפוגנזה השראה של אבות אדיפוציטים מ רקמות אדיבוס perivascular מבודדים על ידי מיון מגנטי המופעל תא

DOI:

10.3791/55818

⸱

30 ביוני 2017

 ,  ,  , 
1Department of Large Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, Michigan State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מדווחים על שיטה לבידוד של אוכלוסיות תאי אב (APC) של אדיפוציטים (APC) מתוך רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT) תוך שימוש במיון תאים מגנטיים המופעל (MCS). שיטה זו מאפשרת בידוד מוגבר של APC לכל גרם של רקמת השומן בהשוואה לפלואורסצנטי המופעל תא מיון (FACS).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הרחבת רקמת אדיפוס (Perivascular Adipose Tissue) (PVAT), הרגולטור העיקרי של תפקוד כלי הדם באמצעות איתות paracrine, קשורה ישירות להתפתחות יתר לחץ דם במהלך השמנת יתר. היקף היפרטרופיה ו hyperplasia תלוי במיקום dot, מין, ואת סוג של פנויה epipocyte אב (APC) פנוטיפים הנוכחי. טכניקות המשמשות בידוד APC ו preadipocytes ב 10 השנים האחרונות שיפרו באופן דרסטי את הדיוק שבו תאים בודדים ניתן לזהות על בסיס סמנים ספציפיים משטח התא. עם זאת, בידוד של APC ו adipocytes יכול להיות אתגר בשל שבירות של התא, במיוחד אם התא שלם צריך להישמר עבור יישומי תרבות התא.

מגנטי המופעל תא מיון ( MCS) מספק שיטה של ​​בידוד מספר גדול יותר של APC קיימא לכל יחידת משקל של רקמת השומן. APC שנקטפו על ידי MCS יכול לשמש פרוטוקולי חוץ גופית כדי להרחיב פרהDipocytes ולהבדיל אותם לתוך אדיפוציטים באמצעות שימוש בגורם גורם הגדילה המאפשר ניתוח של פוטנציאל פורה אדיפוגני שמרו על ידי התאים. ניסוי זה התמקד בתחנות ה- PVAT של אבי העורקים והמזנטרים, אשר ממלאים תפקידים מרכזיים בהתפתחות מחלות לב וכלי דם במהלך ההתפשטות. פרוטוקולים אלה מתארים שיטות לבודד, להרחיב ולהבדיל אוכלוסייה מוגדרת של APC. זה פרוטוקול MCS מאפשר בידוד לשמש בכל ניסוי שבו מיון התא נדרש עם ציוד מינימלי או הכשרה. טכניקות אלה יכולים לסייע ניסויים נוספים כדי לקבוע את הפונקציונליות של אוכלוסיות תאים ספציפיים בהתבסס על נוכחות של סמנים פני השטח התא.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perivascular רקמת אדיפוס (PVAT), בשל קרבתו לכלי הדם, הוא מרכיב מרכזי paracrine איתות ב תפקוד כלי הדם 1 . הרחבת רקמת השומן תלויה בפנוטיפ של תאי האב-אדפוציטים (APC) , 2 , 3 . בידוד של תאים ברקמות השומן קשה כמו adipocytes העיקרית הם שבירים, ציפה, ואת טווח בגודל. טכניקות בידוד מסוימים יכולים גם לשנות פנוטיפ התא מורפולוגיה על ידי הגדלת סינתזה חלבון דלקתיות וצמצום ביטוי הגן adipogenic 4 , המדגיש את החשיבות של פרוטוקול ששומרת על שלמות התאים.

התרבות של תאים ראשוניים subpopulations ספציפיים preadipocyte נותן גישה רדוקציוניסטית ב vivo צמיחה ושומרת המקבילה איפור גנטי התאית 5 , למרות עובד tiאותי עם תאים אלה מוגבלת בשל הידרדרות עם ההזדקנות, או ההזדקנות 6 . Preadipocytes ממחסני השומן השונים, כולל תת מחסן תת-ימורי ו omental, גם להפגין הבדלים התפשטות 7 , אשר מדגיש את החשיבות של איסוף תאים מאתרים אנטומיים ספציפיים. תאים מבשר מן הלא PVAT מחסן לבן מחסן מאופיינים במחקרים קודמים 7 , 8 , 9 , אבל פחות ידוע על פנוטיפים PVT APC.

הטכניקות המתוארות כאן מאפשרות ניתוח של אוכלוסיות ספציפיות ומוגדרות של APC, עם השפעה מזערית על המורפולוגיה שלהן, על יכולתן ועל פוטנציאלן להתרבות ולהבדיל. מגנטי המופעל תא תאים (MCS) הוא מקובל ליישומים במורד הזרם, כגון תרבות, כמו חרוזים להתמוסס מבלי לשנות את התא. MCS הוא גם חסכוני, ופעם נוגדן נוגדניםריכוזים תוקנו, הצורך מבחני cytometry זרימה היא מינימלית. מחקרים במבחנה עם מבשרי PVAT יכול גם לתת הצצה של הפוטנציאל כי תאים ראשוניים אלה עשויים להיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים המתוארים במאמר זה פעל לפי הנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) של אוניברסיטת מישיגן. כל buffers ו medias צריך להיות מוגן מפני האור.

1. הכנת מאגרים, מדיה, ומכשירים

  1. הכנת קרבס רינגר Bicarbonate-buffered פתרון (KRBB): 135 מ"מ כלוריום נתרן, 5 מ"מ כלוריד אשלגן, 1 מ"מ גופרתי מגנזיום, 0.4 מ"מ אשלגן פוספט dibasic, 5.5 מ"מ גלוקוז, 1% אנטיביוטיקה / antimycotic (10,000 יחידות / מ"ל ​​פניצילין, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B), ו 10 מ"מ HEPES (pH = 7.4). פתרון זה יציב במשך 3 שבועות כאשר שמר סטרילית ב 4 ° C.
  2. הכן Collagenase סוג 1 פתרון: 1 מ"ג / מ"ל ​​ב KRBB עם 4% בסרום אלבומין בסרום (BSA). פתרון זה צריך להישמר על 37 מעלות צלזיוס והוא יציב במשך 4 שעות.
  3. הכן פתרון תמוגה תמוגה תמוגה: 154 מ"מ אמוניום כלוריד, 10 מ"ל אשלגן ביקרבונט, ו 0.1 מ"מ EDTA. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש.
  4. הכנת MCS חסימת חיץ: DMEM / F12 בסיס התקשורת, 10% בסרום שור עוברית (FBS), 5% סרום חמור רגיל, 40 μL / מ"ל ​​F (ab) שבר חמור אנטי עכברוש IgG. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש.
  5. הכן MCS מאגר הצפת: פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, pH = 7.5), 0.5% BSA, ו 2 מ"מ EDTA. שמור על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש. פתרון דה גז על ידי חימום ל 37 מעלות צלזיוס במיכל זכוכית ולאחר מכן החלת ואקום for15 s. השאר שלא נעשה שימוש במאגר סגור.
  6. הכנת חלקיקים כלי דם של סטרומה (SVF): מדידות עורקיות של Dulbecco - DEMECCO: F12, 15% סרום עגל של 15%, אנטיביוטיקה של 1% / אנטיביוטיקה (10,000 יחידות / פניצילין מ"ל, 10,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 25 מיקרוגרם / ML amphotericin B), 44.05 מ"מ סודיום ביקרבונט, 100 מיקרומטר חומצה אסקורבית, ביוטין 33 מיקרומטר, pantothenate מיקרומטר 17, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 20 מ"מ HEPES. שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
  7. הכן APC &# 160: מדיה: מדיה בזאלית עם גורמי גדילה נוספים, כולל גורם גדילה באפידרמיס 10 ng / mL), גורם מעכב לויקמיה (10 ng / mL), גורם גדילה של טסיות (BB) (10 ng / mL) ופקטור גדילה בסיסי של fibroblast 5 ng / mL). שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
  8. הכן APC אינדוקציה מדיה: APC מדיה עם 10% FBS, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין, 0.5 מ"מ 2-isobutyl-1-methylaxanthine (IBMX), 1 מיקרומטר dexamethasone, ו 200 pM T3 (הורמון בלוטת התריס triiodothyronine). שמור סטרילית ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.

2. אדיפוציטים אבות בידוד

  1. להרדים חולדה על פי הנחיות מוסדיות. מניחים את החולדה בשכיבה הגב. אישור עומק הרדמה באמצעות אצבע הבוהן ואת אובדן התגובה רפלקס לגירוי זה כואב.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש 10 שבועות חולדות Sprague Dawley ו 70 מ"ג / ק"ג של pentobarbital נמסר באמצעות הזרקה intraperitoneal.
  2. ביצוע חתך קו אנכי wIth מספריים לאורך עצם החזה באזור החזה ואת האזור העברי. גישה חלל הבטן לחשוף את העורק mesenteric מעולה, כלי ההתנגדות mesenteric קטן (mPVAT) ואת אבי העורקים החזי (aPVAT).
    1. לנתק את כל החיבורים כדי mesentery ו אבי העורקים ולהסיר כלי מן החי. לבודד PVAT באמצעות מיקרוסקופ לנתח צלחת פטרי מלא KRBB כדי להציג כלי לבודד PVAT.
    2. בניסוי זה, לאסוף גונדאל (GON) אדיפוס לייצג מחסן שאינו PVAT דיפו. מקום רפידות שומן מבודדים על קרח KRBB עם 10 מ"מ HEPES (pH = 7.4).
    3. ב מכסה המנוע biosafety, להעביר כ 50 מ"ג של רקמה לצינור 1.7 מ"ל עם 1 מ"ל של קולגנאז סוג אני פתרון ו לטחון עם מספריים רקמות (1 - 3 חתיכות מ"מ).
  3. דגימות תקציר על ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס חממה rotisserie (או חממה עם שייקר מסלולית) עבור 1 ח '. בתוך מכסה המנוע biosafety, ברצף לסנן חומר מתעכל דרך 100 ו - 40 מיקרומטר תאים מסננת לתוך צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה וכתוצאה מכך תסנין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 300 × גרם.
    הערה: כל השלבים בפרוטוקול מכאן קדימה הם להתבצע מכסה המנוע biosafety לשמור תאים סטריליים.
  4. יוצקים את כדוריות supernatant ו resuspend המכילים את התאים SVF ב 1 מ"ל של 1X פתרון כדורית תמוגה תמוגה ולהעביר צינור 1.7 microfuge מ"ל. דגירה תאים 5 דקות ב RT מוגן מפני אור צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
  5. יוצקים supernatant ו resuspend תא גלולה שנותר SVF בסל מדיה. איסוף 20 תת מדגם μL לספור תאים חיים עם פתרון כחול Trypan.
    הערה: מספר תאי SVF שניתן לבודד ישתנה בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של SVF שנקצרו לכל מ"ג של רקמות הם: aPVAT = 5.0 ± 2.0x10 3 , mPVAT = 1.04 ± 0.62x10 4 , GON = 2.4 ± 1.2x10 5 .

3. מגנטי המופעל תא מיון

_content "> הערה: בידוד APC מ SVF מבוסס על CD34 ו PDGFRα פני השטח סמנים על ידי ביצוע כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס.

  1. תאים ספין 5 דקות ב 300 x גרם. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה התא MCS חסימת חיץ ב 1 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ו דגירה במשך 20 דקות.
    הערה: ניתן להפר את התאים המתים של 1 x 10 6 - 2 x 10 8 תאים / מ"ל ​​באופן יעיל.
  2. דגירה תאים עם μL 5 של FITC- מצומדות עכבר anti-CD34 (1 מיקרוגרם / 1 x 10 6 תאים) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תאים ספין 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C.
    1. דגירה עם 4 μL של microbeads נגד FITC ו 96 μL של חיץ MCS (נפח כולל של 100 μL) במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך כדי להפריד CD34 + ו CD34 - תאים.
  3. חבר את המפריד המגנטי למעמד והנח את העמודה MultiSort (MS), עם כנפי העמוד הקדמי, לתוך המפריד. מניחים 5 מ"לצינור תחת עמודה MS ב בעל הצינור העליון.
  4. הכן MS טור על ידי שטיפה עם פתרון הצפת MCS. החל 500 μL של חיץ MCS על גבי העמודה ולתת למאגר לרוץ דרך. מחק קולחים ולשנות צינור איסוף.
  5. טען נוגדנים שכותרתו ההשעיה תא על עמודה MS מוכן. איסוף זרימת דרך המכילה תאים ללא תווית.
  6. שטפו עמודה MS עם 500 μL של מאגר MCS degassed 3x. איסוף תאים ללא תווית העוברים דרך לשלב עם הזרימה דרך השלב הקודם.
  7. הסר MS טור מהמפריד המגנטי והנח אותו על צינור איסוף חדש. פיפטה 1 מ"ל של MCS הצפת על עמודה MS. מיד לשטוף את חלק עם תאים שכותרתו מגנטית על ידי בתקיפות, אבל לאט, החלת הבוכנה שסופק עם הטור כדי לא לאפשר גז עודף לתוך העמודה.
    הערה: מספרי התאים המבודדים ישתנו בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של CD34 + APC מבודדים מאוכלוסיית SVF לכלמ"ג של רקמות הם: aPVAT = 2.6 ± 0.43x10 2 , mPVAT = 9.6 ± 1.4x10 2 , GON = 1.3 ± 0.22x10 3 .
  8. תאים ספין 5 דקות ב 300 × גרם ו 4 ° C. דגירה את החלק CD34 + שנאספו μL 10 של פתרון 1: 200/1 x 10 6 תאים ארנב נגד PDGFRα במשך 30 דקות ב 4 ° C.
    1. צנטריפוגה תאים שוב 5 דקות ב 300 xg ו 4 ° C. דגירה תאים שכותרתו עם 4 μL של microbeads נגד ארנבת IgG ו 96 μL של חיץ MCS על ידי חזרה על שלבים 3.3 עד 3.7 לבודד.
      הערה: מספרי התאים המבודדים ישתנו בהתאם לאתר. מספרים ממוצעים של PDGFRα + APC המבודדים מאוכלוסיית CD34 + לכל מ"ג של רקמות הם: APVAT = 2.4 ± 0.64, mPVAT = 8.4 ± 2.4, GON = 10.4 ± 1.9, המהווה 0.5 - 10% מהאוכלוסייה המבודדת בעבר.

4. תרבות תאים אדיפוגנזה אינדוקציה

  1. התרבות SVFו APC ב 6-טוב רקמות תרבות צלחות התקשורת הבסיסית עם החלפת כל 2 ימים. לאחר 3 מעברים סדרתיים, צלחת שחור 96-טוב רקמות תרבות צלחות ב 1x10 2 תאים / גם מבחני התפשטות, אשר מוערכים ב 8, 24, 48, ו 96 שעות, ב 50,000 תאים / גם צלחות 24 גם או 10,000 תאים / גם 48-טוב רקמות תרבות צלחות עבור מבחני אדיפוגנזה, שהם איכותיים וכמותיים.
  2. השלמת APC התקשורת הבסיסית עבור 48 שעות לאחר confluency ו לפני אינדוקציה עם חלבון מורפוגני העצם 4 (3.3 nmol / L) כפי שצוין 10 עבור בידול. להשרות תאים לאחר 48 שעות של 100% confluency (יום 0) באמצעות APC אינדוקציה מדיה כדי לדגור את התאים.
  3. לאחר 48 שעות, לשנות את התקשורת כדי לשמור על תאים בתקשורת Induction APC ללא יבמ ו dexamethasone, במשך 14 ימים עם שינויים התקשורת כל 48 שעות.
  4. בידוד MCS מאומת על ידי FACS.
    1. קח 50 μL (50,000 תאים) מדגם משנה של הפרדה מגנטיתלעבר התאים ולשטוף עם פתרון FACS.
    2. צנטריפוגות תאים resuspend ב 100 μL של פתרון 1: 1000 של חמור נגד ארנב IgG Dylight 405 לתייג את התאים PDGFRα + . דגירה במשך 30 דקות מוגן מפני האור ב 4 ° C.
    3. לשטוף תאים resuspend μl 200 של פתרון פורמלדהיד 2% עד זמן לניתוח באמצעות 488 ננומטר (FITC) ו 405 ננומטר (Dylight 405) מסננים על cytometer זרימה.
      הערה: הצטברות שומנים על ידי תאים בתרבית מוערך כמותית באמצעות assipogenesis lipophilic adipogenesis בקורא microplate מדידה פלואורסצנטי ושימוש preadipocytes כמו כיולים עבור הצטברות השומנים. הצטברות השומנים נמדדת גם מבחינה איכותית על ידי צביעת צבע השומנים והדמיה שבוצעה על מיקרוסקופ הפוך מצויד במצלמה, מה שהופך את אחוז התאים הכולל לעשות או לא מכילים שומנים. כל צלחת הקורא כי הוא מסוגל למדוד הקרינה עם עירור ב 485 ננומטר פליטה ב 572ננומטר מתאים לניתוח כמו גם כל מיקרוסקופ עם מצלמה המסוגלת לכידת תמונות דיגיטליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יכולת פרוליפרטיבית של preadipocytes ופוטנציאל אדיפוגני של מבשרי השומן הם מאפיינים מתוחזקים במבחנה 11 . התפשטות חוץ גופית של SVF מבודד APC מ aPVAT, mPVAT, ו GON של חולדות זכר הוערך ב 8, 24, 48, ו 96 שעות לאחר ציפוי באמצעות assay DNA כמותי. לא נמצאו הבדלים באתר בשיעור ההרחבה של SVF, בכל נקודת זמן מלבד APC מ- aPVAT, אשר היה פחות התפשטות של 96 שעות בהשוואה לתאי SVF מאותו אתר ( איור 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוקד המרכזי של הניסוי הנוכחי הוא בידוד, הרחבה, אדיפוגני אינדוקציה של APC מן המחסנים PVAT. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של APC מבוסס על זיהוי של תאים להביע את סמנים פני השטח CD34 ו PDGFRα. אלה חלבונים פני השטח זוהו בעבר על APC עם שיעורי התפשטות גבוהה ואת הפוטנציאל להבדיל adipocytes לבן או חום שונים מחסנים 14 , 15 . על ידי בחירת תאים המבוססים על סמנים ספציפיים אלה, הצלחנו לבודד אוכלוסיות APC דומות ממחסני אדיפוס שונים התוא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המעבדות Contreras ו ווטס וד"ר ויליאם רפאל. ניסויים אלה נתמכו על ידי NHLBI F31 HL128035-01 (רקמות העיכול פרוטוקול תקינה), NHLBI 5R01HL117847-02 ו 2P01HL070687-11A1 (בעלי חיים), ו NHLBI 5R01HL117847-02 (בידוד תאים ותרבות).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חיתוך רקמות
חיתוך כליםבעבודת יד עם תרבית סיליקון
צלחת פטריפיירקס7740 זכוכית
סיליקון אלסטומרדאו קורנינגסילגארד 170ערכת
תפר משי קלועהרווארד מכשיר51-7615SP104
סטריאומיקרוסקופ MZ6Leica
10447254 מיקרוסקופ סטריאומאסטר מקור אור סיבים אופטייםפישר סיינטיפיק12562-36
מספריים ואנאסג'ורג 'טימן & Co160-150
מלקחיים רסיסיםג'ורג' טימן & מספריים לרקמות Co160-55
ג'ורג 'טימן & Co105-400
<חזק>תמיסת KRBB
נתרן כלוריסיגמא-אולדריץ'7647-14-5
אשלגן כלוריסיגמא-אולדריץ'7447-40-7
מגנזיום גופרתיסיגמא-אולדריץ'7487-88-9
אשלגן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'7758-114
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'50-99-7
קורנינגאנטיביוטי/אנטימיקוטי30-004-CI
HEPES קורנינג25-060-CI
עיכול >רקמות חזק
קולגנאז סוג 1וורת'ינגטון ביוכימיLS004196
בקר סרום אלבומין (BSA)פישר סיינטיפיק9048-46-8
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםBioLegend4203011X פתרון עבודה
אמבט מיםתרמו-פישר סיינטיפיק2876אמבט טלטול הדדי
ארון בטיחותביולוגית תרמו-פישר סיינטיפיק1385
חממת רוטיסרידייגרEF4894C
100 & מיקרו; מסננת תאים mThermo-Fisher Scientific22-363-549צהוב
40 ומיקרו; m מסננת תאיםתרמו-פישר מדעי22-363-547
המוציטומטרקול-פארמרUX-79001-00
טריפן כחולסיגמא-אולדריץ'93595
<חזק>בידוד תאים
OctoMACS ערכתMiltenyi Biotech130-042-108
(DMEM): F12קורנינג בינוני90-090
סרום בקר עוברי בסיס בינוני (FBS)קורנינג35016CVארה"ב מקורות
סרום חמור רגילAbCamAB7475
Anti-CD34סנטה קרוזSC-7324מצומד FITC
אנטי-PDGFRαThermo-Fisher ScientificPA5-17623
חמור נגד ארנב IgGJackson ImmunoResearch712-007-003
מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) 10XCorning46-013-CM1X פתרון עבודה
EDTAFisher Scientific15575020
<תרבית תאים חזקה>חזקה
CO 2 חממת תאיםתרמו-פישר סיינטיפיק51030285Heracell 160i 
צלחות 6 בארותקורנינג3516
צלחות 48 בארות מטופלותקורנינג3548
צלחות 96 בארות מטופלות TC,קורנינג353376
נתרן ביקרבונטסיגמא-אולדריץ'מטופל TC 144-55-8
סרום עגל עוברי מטופל TC (FCS)קורנינג35011CVארה"ב מקורות
חומצה אסקורביתסיגמא-אולדריץ'50-81-7
ביוטיןסיגמא-אולדריץ'58-85-5
פנטותנטסיגמא-אולדריץ'137-08-6
L-גלוטמיןקורנינג61-030
חלבון מורפוגני עצם 4 (BMP4)Prospec BioCYT-081
גורם גדילה אפידרמיס (EGF)PeproTech400-25
לוקמיה מעכבגורם PeproTech250-02
גורם גדילה שמקורו בטסיות BBProspec BioCYT-740
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)PeproTech450-33
אינסוליןקורנינג25-800-CRתמיסת ITS
IBMXSigma-Aldrich28822-58-4
דקסמתזוןSigma-Aldrich50-02-2
T3 (Triiodothyronine)Sigma-Aldrich6893-023
Cell Analysis
CyQUANT Proliferation AssayThermo-Fisher ScientificC7026
AdipoRed Fluorescence Assay ReagentLonzaPT-7009
שמן אדום O מגיב צבע ליפידיםSigma-AldrichO1391בתמיסה
M1000 קורא מיקרופלייטTecan
Eclipse מיקרוסקופ הפוךNikon
Digital Sight DS-Qil מצלמהNikon
< כחול TC קיר שחור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
  2. Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems. Adipocyte. 3 (4), 236-241 (2014).
  3. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  4. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. J Biol Chem. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  5. Stacey, G. in eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
  6. Swim, H. E., Parker, R. F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. Am J Hyg. 66 (2), 235-243 (1957).
  7. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  8. Roncari, D. A., Lau, D. C., Kindler, S. Exaggerated replication in culture of adipocyte precursors from massively obese persons. Metabolism. 30 (5), 425-427 (1981).
  9. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  10. Fontana, L., Eagon, J. C., Trujillo, M. E., Scherer, P. E., Klein, S. Visceral fat adipokine secretion is associated with systemic inflammation in obese humans. Diabetes. 56 (4), 1010-1013 (2007).
  11. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  12. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  13. Contreras, G. A., Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W. The distribution and adipogenic potential of perivascular adipose tissue adipocyte progenitors is dependent on sexual dimorphism and vessel location. Physiol Rep. 4 (19), (2016).
  14. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metab. 18 (3), 355-367 (2013).
  15. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metab. 15 (4), 480-491 (2012).
  16. Ahrens, M., et al. Expression of human bone morphogenetic proteins-2 or -4 in murine mesenchymal progenitor C3H10T1/2 cells induces differentiation into distinct mesenchymal cell lineages. DNA Cell Biol. 12 (10), 871-880 (1993).
  17. Bowers, R. R., Lane, M. D. A role for bone morphogenetic protein-4 in adipocyte development. Cell Cycle. 6 (4), 385-389 (2007).
  18. Schulz, T. J., Tseng, Y. H. Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 523-531 (2009).
  19. Choi, J. R., et al. In situ normoxia enhances survival and proliferation rate of human adipose tissue-derived stromal cells without increasing the risk of tumourigenesis. PLoS One. 10 (1), 0115034(2015).
  20. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metab. 15 (2), 230-239 (2012).
  21. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  22. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  23. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD34PDGFR Alpha

מאמרים קשורים