מודל הלב הפוכה עבור אוסף transstate Interstitial מן הלב עכברוש מבודד

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאסוף נוזל interstitial לב מבודדים, בלב עכברוש perfused. כדי להפריד פיזית transudate interstitial מ perfossate כלילי ורידי לב, הלב Langendorff perfused הוא הפוך, ואת transudate (נוזל interstitial) נוצר על פני הלב נאסף באמצעות כובע לטקס רכה.

תקציר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה ייחודית המאפשרת אוסף של transudate לב (CT) מן הלב מבודד, מלוחים perfused חולדה. לאחר בידוד ו זלילה מדרדר של הלב על פי טכניקת Langendorff, הלב הוא הפוך למצב הפוך הפוכה מיוצב מכנית על ידי קטטר בלון מוכנס לתוך החדר השמאלי. ואז, כובע לטקס דק - בעבר יצוק כדי להתאים את הגודל הממוצע של הלב חולדה - ממוקם מעל פני השטח epichardial. השקע של כובע לטקס מחובר צינורות סיליקון, עם פתיחת דיסטלי 10 ס"מ מתחת לרמת הבסיס של הלב, יצירת יניקה קלה. CT מיוצר ברציפות על פני השטח אפיקארדיאל נאסף בקבוקונים מקורר כקרח לניתוח נוסף. שיעור היווצרות ה- CT נע בין 17 ל -147 μL / min (n = 14) בשליטה ובליבות לא מקובעות, המייצגות 0.1-1% מהפרפוראטציה הקולית הוורידית. ניתוח פרוטאומי ופרפו גבוהRmance נוזל כרומטוגרפיה (HPLC) גילה כי CT שנאספו מכיל מגוון רחב של חלבונים ו metinerolic purinergic.

מבוא

אי ספיקת לב (HF) היא הגורם המוביל למוות בבני אדם בעולם ¹ . HF מתרחשת לעיתים קרובות עקב דלקת שריר הלב, עלבונות איסכמיים בשריר הלב, ושיפוץ חדרי החדר, מה שמוביל להידרדרות הדרגתית של תפקוד הלב וכלי הדם של המטופלים. למרות ההתקדמות הקרדיולוגית וניתוח לב הורידו באופן משמעותי את תמותה HF, הם רק לשמש "מעכבים" חולף של תהליך מחלה מתקדמת באופן בלתי נמנע, כי יש תחלואה משמעותית. לכן, היעדר הטיפול היעיל הנוכחי מדגיש את הצורך לזהות מטרות מולקולריות חדשות שיכולות למנוע או אפילו להפוך HF. הדבר כולל שינויים במטריצה ​​החוץ-תאית, תגובה חיסונית בלתי מבוקרת של הלב, ואינטראקציות בין תאי לב ולא-לב ² .

חשוב להכיר כי microenvironment כי תאים לב חשופים direcTly צורות התגובה החיסונית והתחדשות של הלב הפגוע. בלב המבודד, המלוח-מלוח, נוצר CT על פני השטח בצורת טיפות קטנות הנגזרות מחלל הנוזלים הבין-ממדי ( כלומר, מיקרו-סביבה), הן בתנאים פיזיולוגיים והן בפאתופיזיולוגיים ^{3 , 4 , 5} . לכן, ניתוח של CT ( כלומר, נוזל interstitial) עשוי לעזור לזהות גורמים המווסתים את חילוף החומרים של הלב ואת תפקוד התכווצות ⁶ או להשפיע על תפקודי התא החיסונית לאחר המעבר אל הלב הפגוע. פוטנציאל זה עשוי להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול ב- HF.

אוסף CT מ לבבות Murine הוא מאתגר מבחינה טכנית. ב Langendorff-perfused לבבות רגילים, את האוסף הבלעדי של CT קשה כי תערובת של CT עם קורונארY ורידי שפכים ורידי באופן בלתי צפוי מדלל כל ריכוז של מטבוליטים / אנזימים ששוחררו מן החלל interstitial. אחת האסטרטגיות האפשריות להתגבר על הגבלה זו היא להוציא את השפכים הוורידים על ידי חשיפת הריאתי ובאותו זמן ליגנציה של הווריד הריאתי. עם זאת, שיטה זו עומדת בפני קשיים הקשורים cannulation ו קשירת של העורק הריאתי ואת הווריד, גרימת דליפה פוטנציאלית של שפכים ורידי לתוך transudate הלב. הרעיון של שימוש במודל לב הפוכה הוצג לראשונה על ידי קבוצת קמרמאייר, שהפכה את הלב המבודד והמבודד למצב הפוך, והניחה כובע לטקס דק על משטח האפיכארדיאל כדי למדוד ללא הרף את ה- CT ללא זיהום של שפכים ורידיים ^{8 , 9} . באמצעות הליך זה, CT הוצגה לספק מדד רגיש מאוד של מטבוליטים שוחרר מהלב ⁹ ,העברה נימית של חומצות שומן ⁸ , וחלקיקים נגיפיים ¹⁰ .

לאחרונה, גורמי פרקרין שיכולים להסדיר את התגובה החיסונית המקומית ולהגדיל את אנגיוגנזה לב ¹¹ היו מעורבים בהשפעות החיוביות של טיפול מבוסס תאי גזע למחלות לב. הניתוח של CT בלב הפוך עשוי לסייע לזהות את הגורמים הפרקריים האישיים הללו באופן כימי. בנוסף, CT עשוי לעזור לזהות את הגורמים המעורבים ההפעלה vivo של תאים חיסוניים בלב.

התיאור המפורט של אוסף ה- CT ממשטח הלב, הניתן כאן, הוא שימושי עבור חוקרים החוקרים את יחסי הגומלין בין תאי החיסון, fibroblasts, תאי האנדותל, ואת cardiomyocytes ביחס לתפקוד הלב הכולל. כפי שצוין לעיל, נוזל interstitial נושאת את המידע לתקשורת תא אל תוך התא, בתוך הלב, WHIch ניתן להעריך בנוחות על ידי אוסף של CT. תיאור טכני מפורט, כולל פרוטוקול וידאו של איך לאסוף CT מן הלב הפוכה, צריך להקל על היישום העתידי של טכניקה ייחודית זו.

פרוטוקול

כל הניסויים אושרו על ידי סוכנות הרגולציה המקומית ( LANUV של Nordrhein-Westfalen, גרמניה) בוצעו על פי הנחיות השימוש בבעלי חיים. בעלי החיים היו מוזנים בדיאטה סטנדרטית של צ'או וקיבלו את מי הברז. כל הציוד והכימיקלים הדרושים לכל שלב של הניסוי זמינים בטבלה של חומרים .

1. הכנת כובע לטקס ו בלון Intraventricular

1. יצירת עובש אלומיניום באמצעות מכונת כרסום התואמת את הגודל הממוצע של הלב חולדה (bodyweight של 300-350 גרם). פולנית תבנית עם נייר superfine (10/0) ​​אמרי.
   הערה: המדדים המפורטים של התבנית מוצגים בתרשים 1A .
2. אנכית לתקן את הצוואר של עובש אלומיניום למכונת כרסום כדי להכין את כובע לטקס.
   הערה: מכונת הטחינה גורמת לעובי להסתובב לאט. לחלופין, מנוע חשמלי יכול לשמש. Li>
3. יוצקים 20 מ"ל של לטקס נוזלי (רכש מסחרית, ראה טבלה של חומרים ) לתוך כוס זכוכית 50 מ"ל.
4. להנמיך את עובש עד הגוף כולו של עובש שקוע הפתרון לטקס.
5. הרם לאט את התבנית (5 ס"מ לדקה) תוך כדי סיבוב.
6. שמור סיבוב עובש במשך 15 דקות נוספות, עד לטקס על פני השטח של עובש הוא solidified.
7. הוסף על 1 גרם של אבקת טלק על פני השטח של עובש (כבר מכוסה על ידי סרט לטקס דק) כדי למנוע נזק בעת ניתוק.
8. בעדינות לנתק עם האצבעות כבר מיובש כובע לטקס משטח עובש; כובע לטקס מוכן כעת לשימוש ( איור 1 ב ).
9. חבר את שקע לטקס ל -15 ס"מ צינורות סיליקון (ID = 0.2 מ"מ), המשמש מאוחר יותר עבור אוסף של CT.
10. ממלאים את הבלון לטקס חדרית עם מים בתקיפות לתקן אותו על צינור מתכת בצורת L מחובר מזרק 1 מ"ל, מלא מים (> איור 1 ג).
    הערה: זה ישמש כדי להבטיח את מיקום זקוף של הלב (ראה להלן).
11. ודא כי הבלון הוא אטום על ידי ביצוע מספר ניפוח / ניפוח בדיקות עם המזרק המצורף 1 מ"ל.
12. חבר את הצינורית, דרך לעצור שלוש פעמים, כדי מתמר הלחץ למדידה העתידית של הלחץ פיתחה intraventricular ( איור 1C ).

2. הכנת קרבס- Henseleit הצפת (KHB) ואת מערכת Langendorff זלוף

1. הגדרת מערכת זלוף Langendorff באמצעות זרימה קבועה (מונע על ידי משאבת הרים) או קבוע הלחץ (שנוצר על ידי לחץ סטטי בעמודה זכוכית) במצב.
   הערה: פרטים על הכנת Langendorff הלב תוארו בעבר ¹² .
2. הכן 2 L של KHB שונה (ב mM: 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1.21 K ₂ HPO ₄ , 2.52 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 24.88 NaHCO ₃ , 8.30 D גלוקוז, ו 2.0 נתרן pyruvate).
   1. לשקול את כל הכימיקלים אבל CaCl ₂ ו לפזר אותם 1.8 L של מים מזוקקים פעמיים בקבוק 2-L.
   2. הבועה המדיום עם carbogen (95% O ₂ /5% CO ₂ ) במשך 5 דקות לפחות עבור איזון (pH: 7.4) תחת ערבוב מגנטי.
   3. הוסף 0.74 גרם של CaCl ₂ .2H ₂ O ולהעלות את נפח הכולל ל 2 עם מים מזוקקים פעמיים.
   4. המשך ערבוב מבעבע בינוני עם פחמן במשך 5 דקות נוספות.
   5. סינון KHB דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לחסל חלקיקים קטנים שעלולים לחסום את microcirculation של הלב.
3. הכנת מערכת זלוף Langendorff.
   1. מניחים את KHB מסונן לתוך אמבט מים מחומם מראש (38 ° C); לשמור מבעבע עם carbogen כדי ליצור לחץ של 100 ס"מ ₂ O InsidE מאגר KHB.
   2. חבר את המאגר לעמודה זכוכית להקים 100 cmH ₂ O לחץ הידרוסטטי עבור זלוף Langendorff עם KHB; להמשיך מבעבע KHB בתוך הטור עם carbogen.
   3. התאם את הטמפרטורה של מערכת ההתחממות, כך הטמפרטורה בבית השקע אבי העורקים הוא 37 מעלות צלזיוס.
   4. ודא כי מערכת צינורות הוא ללא בועה.
   5. לחמצן את KHB עם פחמן במשך 5 דקות נוספות, עד PO ₂ ב KHB מגיע 500-600 מ"מ כספית (נמדדת על ידי מנתח גז בדם).
4. הגדרת מערכת זלוף לרוץ או בלחץ קבוע של 100 cmH ₂ O או בזרימה קבועה של כ 10-20 מ"ל / דקה באמצעות מיתוג ידני. לחלופין, להשתמש בקר משאבת STH להחלפה כדי לעבור באופן מיידי למצב זלוף.

3. בידוד ו cannulation של הלב

הערה: חולדות Wistar זכר עם משקולות של 300-350 גרם שימשו כך גדלים של לבבות תאמו מראש הטלת לטקס. חולדות עברו גם קשירת של העורקים השמאלית יורד (LAD) במשך 50 דקות, ואחריו reperfusion או הופעלו הונאה. פרטים על המתודולוגיה של אינדוקציה של אוטם שריר הלב (MI) דווחו במקום אחר ¹³ . ניסויי הלב הפוכים בחיות האינפריות בוצעו 5 ימים לאחר הניתוח.

1. להרדים חולדות באמצעות מאדה isoflurane (2% V / V) מחובר לחדר בעל חיים מחזיק (20 L).
2. מעבירים את החולדות לטבלת הניתוח (לא טמפרטורה מבוקרת) לאחר הרדמה עמוקה הוא הגיע.
3. הרם את העור ואת השריר ממש מתחת לחזה באמצעות מלקחיים לחתוך סביב השוליים התחתונים של הצלעות עם מספריים כבדים.
4. בעזרת מספריים בסדר, לעשות חתך קטן לתוך הסרעפת, על שולי צלעות. חותכים את הצלעות caudally לעשות דש של הקיר החזה כולו הגחון.
5. בעדינות לתפוס את הלב עם האגודל אNd אינדקס ואצבעות באמצע לאט להרים אותו כלפי מעלה, כך כלי הדם להיות מתוח מעט.
6. הבלו את הלב עד אבי העורקים נחשף במלואו.
7. מניחים את הלב בתוך כוס 100 מ"ל המכיל 50 מ"ל של KHB קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) ולהעביר אותו למנגנון זלוף.
8. מיד לעלות על הלב דרך אבי העורקים על צינורית נוטף בבטחה להדק אותו עם תפר (4-0). הימנע בועות אוויר נכנסים ללב.
9. החל לחץ זלוף קבוע (100 ס"מ ₂ O). לחלופין, קצב זרימה מלא (החל מ 20 מ"ל / דקה) ניתן להחיל.
   הערה: הזמן מפתיחת בית החזה כדי המצורף של הלב צינורית זלוף צריך לקחת בערך 3 דקות בידיו של מפעיל מנוסה.

4. הפוך לב דגם

1. בעדינות לסובב את צינורית אבי העורקים עד הקיר האחורי של הלב הוא בפנים אל פנים .
2. הסר את רקמת החיבור במספרייםכדי לחשוף את הפתיחה של אטריום שמאל, מה שהופך אותו מוכן cannulation intraventricular.
3. הכנס את בלון לטקס deflated מחוברת קטטר נוקשה דרך אטריום שמאל לתוך החדר השמאלי.
4. לנפח את הבלון עד שהוא ממלא את חלל החדר כולו (נפח מנפח מסומן מראש על המזרק).
5. הפוך את הלב עד שהוא הפוך, תומך בו על ידי קטטר בלון תוך תוך ורידי.
6. כפי שמוצג בתרשים 1C , לייצב באופן מכני את הלב הפוכה במצב זקוף באמצעות בלון תוך intraventricular עם קטטר מתכת נוקשה.
7. התאם את המיקום של הלב כדי למנוע פיתול מוגזם של שורש אבי העורקים.
8. התאם את הלחץ diastolic ל 3-5 מ"מ כספית (נמדדת על ידי בלון תוך חדרתי, ראה איור 1C ).
9. צפו על פני השטח של הלב של הלב ולוודא כי טיפות קטנות הטופס.
10. מניחים את כובע לטקס oאל פני השטח של הלב על ידי דחיפה בעדינות אותו כדי לכסות את הלב כולו באמצעות האצבעות.
11. ודא כי מכסה לטקס מכסה את רוב השטח החדר.
12. הסר את בועות אוויר, אם בכלל, בתוך הכובע ואת צינורות על ידי מציצה בעדינות עם מזרק 1 מ"ל.
13. התאם את הפתיחה הדיסטלית של צינור ה- CT לתת עד 10 ס"מ מתחת לרמה האופקית של הלב.
    הערה: הליך זה מבטיח מציצה קלה על ידי לחץ הידרוסטטי שלילי.
14. איסוף טיפות של CT בצינור 1.5 מ"ל צינור להציב בקרח מעורב 1: 1 עם NaCl. איסוף על 0.15-1.5 מ"ל של CT.
    הערה: תערובת הקרח / NaCl מייצבת את הטמפרטורה בצינור האיסוף מתחת לאפס (כ -4 ° C).
    הערה: זמן הדגימה תלוי במטרות הניסוי. קצב הזרימה של CT הוא כ 27 ± 20 μL / min בחיות המופעלות בדם (n = 3) ו 100 ± 47 μL / min עבור בעלי חיים ligated כלילית (n = 11).
15. לשקול ו-להקפיא דגימות CTב חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס למדידות מאוחר יותר.

5. ניתוח של CT

1. השתמש נוזל CT לניתוח של מטבוליטים, בהתאם לשאלה המדעית.
   הערה: הנתונים המוצגים באיור 2 איור 3 נאספו מתוך זלוף לחץ מתמיד (100 ס"מ ₂ O), ועל 0.15-1.5 מ"ל של נוזל CT נאסף בתוך תקופה של 10 דקות. הפעם והנפח היו מספיק עבור proteomic (מינימום: 50 μL, איור 2 ) ¹⁴ ו HPLC (מינימום: 20 μL, איור 3 ) ¹⁵ ניתוח של purines שונים.

תוצאות

מודל הלב הפוכה מאפשר איסוף של transstate interstitial הלב בלב מבודד, רטרו perfused חולדה ( איור 1A- C ). כאשר perfused בלחץ קבוע של 100 cmH ₂ O, שיעור היווצרות נוזל interstitial נע בין 17 ו 147 μL / min, בהיקף של 0.1-1% של שפכים ורידי הלב כליל בלב בודד.

תכולת החלבון של ה- CT, כפי שנמדדה עם a...

דיון

מודל הלב הפוכה מבוסס על טכניקת זלוף הלב המבוצעת היטב של Langendorff ¹² , והיא מבוצעת על ידי הפיכת הלב למצב הפוך ולהחזקה בתנוחה זו באמצעות קטטר נוקשה בתוך חדר הבלון. בדרך זו, transudate interstitial הלב יכול להיות מופרד פיזית מן perfusate כלילי ורידי, נוטף על ידי כוח הכבידה מן הבסיס של הלב ⁹ . CT ניתן לאסוף ברציפות באמצעות כובע לטקס דק וגמיש להציב על פני השטח של הלב כולו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פתרון לטקס	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
תבנית אלומיניום	תוצרת בית		דגם לב הפוך
תנורים אוניברסליים	Memmert	UNB 400	דגם לב הפוך
בלון	לטקס הוגו זקס	גודל 4	דגם לב הפוך
מכונת כרסום	Proxxon	MF70	דגם לב הפוך
נתרן כלוריד	סיגמא SZBD0810V		כימיקלים
נתרן מימן פחמתי	רוט	68852	כימיקלים
אשלגן כלורי	Merck	49361	כימיקלים
מגנזיום סולפט Heptahydrate	Merck	58861	כימיקלים
אשלגן דימימן פוספט	Merck	48731	כימיקלים
D(+)-גלוקוז נטול מים	Merck	83371	כימיקלים
סידן כלוריד דיהידראט	פלוקה	21097	איזון כימיקלים
	VWR	SE 1202	כימיקלים לשקילה כימיקלים
	ממיסים	מים מזוקקים כפולים	מתמר
לחץ רפואי	זהב-לנגנדורף		מכשיר
בדיקה זרימה רפואית	טרנסוני	3PXN	מנגנון לנגנדורף
חימום במחזור אמבטיה	Haake	ב3 ; DC1	מנגנון לנגנדורף
מעבדה וצינורות ואקום	טיגון	R-3603	מנגנון לנגנדורף
מחקר בבעלי חיים מדי זרימה	טרנסוניק	T206	מנגנון לנגנדורף
PowerLab מכשיר רכישת נתונים	תרשים מכשירי AD	7.1	מכשיר לנגנדורף
מעבדה תרשים רכישת נתונים תוכנה	לרכישת AD מכשירים	תרשים 7.1	מנגנון לנגנדורף
משאבה פריסטלטית	גליסון	MINIPULS 3	מנגנון לנגנדורף
עמוד מים	זכוכית תוצרת בית		מנגנון לנגנדורף
מים סוכן מגן	VWR	462-7000	מנגנון לנגנדורף
מסננים חד פעמיים סטריליים (0.2 ומיקרו; m)	Thermo Scientific	595-4520	מנגנון לנגנדורף
מנתחי גזי דם	רדיומטר	ABL90 FLEX PLUS	מנתח גז
70% אתנול	VWR	UN1170	ניקוי  צינורות
100% אתנול	Merck	64-17-5	ניקוי צינורות
Wistar חולדות	Janvier-Animals
מספריים אל חלד	AESCULAP	BC702R	מכשירים כירורגיים
מספריים אל חלד	AESCULAP	BC257R	מכשירים כירורגיים
מלקחיים גדולים	AESCULAP-מכשירים		כירורגיים
8 מ'/מ' מלקחיים אל חלד	FST	11052-10	מכשירים כירורגיים
עדינים במיוחד (10/0) נייר אמרי	3M	051111-11694	דגם לב הפוך