שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Carmen Bolatto; Cristina Parada; Victoria Colmenares

doi:10.3791/55854

מאמר שיטה

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

DOI:

10.3791/55854

⸱

30 בדצמבר 2017

Carmen Bolatto¹ , Cristina Parada¹ , Victoria Colmenares¹

¹Departamento de Histología y Embriología, Facultad de Medicina, Laboratorio de Biología del Desarrollo

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אגף פיתוח melanogaster דרוזופילה הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה ברמת רקמות. תוספות אלה לפתח מתוך קבוצה של תאים בשם אגף דיסקים דמותי נוצר במהלך התפתחות. הזחל הדיסקים דמותי צומחים, להגדיל את מספר התאים ויוצרים מבנים אפיתל monolayered. בתוך התיק הגולמי הדיסקים דמותי באד החוצה ומקפלים לתוך bilayers לאורך קו זה הופך לשולי העתידי של האגף. במהלך תהליך זה, מקורם הורידים primodia האורך וריד תאים הגבי ו הגחון פוטנציאליים של משטחי הכנף. במהלך השלב הגולמי הפסים של וריד תאים של כל שטח תקשורת על מנת ליצור צינורות חזק; במקביל, קרוס-הורידים מתחילים היווצרותם.

עם העזרה של סמנים מולקולריים המתאים, זה אפשרי לזהות את המרכיבים המרכזיים להלחין את האגף במהלך התפתחותו. מסיבה זו, היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים במבנה זה חיוני ללמוד שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח של האגף.

ההליך המתואר כאן מתמקדת על מניפולציה כנפיים הגולמי, מתן הנחיות מפורטות כיצד לנתח את האגף במהלך השלב הגולמי. . הקרע של רקמות הגולמי קשה יותר לביצוע מאשר מקביליהם הזחלים לחלל השלישי. זו הסיבה מדוע גישה זו פותחה, כדי לקבל דוגמאות איכותי מהיר ויעיל. פרטים לגבי אופן immunostain ו הר דגימות אלה כנף, כדי לאפשר את הפריט החזותי של חלבונים או מרכיבי התא, ניתנים בפרוטוקול. עם המומחיות הקטנה אפשרי לאסוף 8-10 כנפיים הגולמי באיכות גבוהה תוך זמן קצר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דרוזופילה כנפיים מפותחים של הדיסקים דמותי כנף. הבראשיתי של הדיסקים האלה כנף הם לשים בצד במהלך התפתחות עובריים כקבוצות קטנות של תאים דמותי 20-30 invaginate של האפיתל מתחלקים. בעוד הזחל הולך וגדל השלב לחלל, מיטוזה מתרחש בתאים דמותי במועדים האופיינית ספציפיים, העלאת המספרים שלה (כ 50000 תאים) ויוצרים את הכנף דיסק¹^,²^,³^, ⁴. כמו התאים להתרבות, הם אופנה אפיתל צינורי, וכתוצאה מכך ספירלה קומפקטי מתקפל עצמית. במהלך להתגלמות, טלסקופים האפיתל דיסק מחוץ לאגף טופס דו שכבתי, הורידים האורך להתחיל בתור לקונות ביניהם, אשר מתרחשת פעמיים במהלך כנף התפתחותית⁵^,⁶.

הסידור של ורידים תמיד יש תבנית זהה; היכולת לזהות בקלות כל שינוי בתוך היווצרות הורידים הופך מוטציות גלוי מאוד (למשל חסרים או מיותרים וורידים, שינוי עמדות וריד, וכו '). מעניין, הווריאציות פנוטיפ בדרך כלל הראיות של מוטציות מוכרות או רומן רכיבים של איתות המסלולים הרלוונטיים לפיתוח כנף. אחד המסלולים זה ממלא תפקיד בקביעת המיקום ושמירה על הווריד וטריטוריות intervein הוא קיפוד (Hh) מסלול⁶^,⁷^,⁸.

בהתחשב בחשיבות של האגף הגולמי כמערכת מודל, חשוב יהיה להשיג דגימות באיכות טובה לעבוד עם. בעבר, מדענים שפרסמו פרוטוקולים לנתח דרוזופילה כנפיים לא העניק מדריך המתאים כדי להשיג דגימות עביד. ללא ההדרכה של חוקר אחד לא יכול בבירור להמחיש את התהליך. בגישות חלופיות אלה ויבתר הגולם לחלק שני, הפרדת האגף מן הרקמה שמסביב, שטפתי שוב ושוב לפנות את הפסולת. סוג זה של הגישה תביעות לעזוב את האגף חינם של מזהם אבל עקב התנסות קודמת התהליך הוא איטי יותר, ויש סיכוי גבוה יותר להתפשר על המבנה של בכנפיים השבריריות⁹.

ההליך המתואר כאן פותחה על ידי הדרישה למצוא שיטה מהירה ויעילה להשיג דגימות כנף הגולמי מתאימים לזהות חלבונים ספציפיים או התמלילים באמצעות פרוטוקולים immunodetection או מבחני (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז. כדי להמחיש זאת, ביטוי של לוקליזציה של Patched (Ptc או הקולטן הקנוני של הנתיב Hh) מזוהה בדגימות כנף הגולמי, מתן פרוטוקול הכולל את הפרטים הרלוונטיים כדי לבצע בהצלחה את השלם נוהל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יום 1

1. איסוף של culturing הגלמים.

להסיר את 0 h לאחר היווצרות puparium (APF) או prepupae באמצעות מברשת רטובה של בקבוקונים בתרבית ומניחים בקבוקונים חדשים כמעט להשלים תקופת פיתוח (ראה 2.1 ו- 2.2).
הערה: צריך להיות מתוחזק אוכלוסיה בריאה של זבובים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים culturing. לאחר שלושה או ארבעה ימים שבהם הביצים מוטלות, ניתן להסיר את המבוגרים בקבוקונים. כדי לאפשר את התפתחות אופטימלית של האנשים. הם נשמרים בטמפרטורה קבועה עד הזחלים לחלל השלישי ליזום להתגלמות. המעבר זחל הגולמי מסומן על ידי היווצרות prepupa נחשב את 0 h APF. Prepupa הוא זחל לבנים משותק הכולל של המלבן, צורה עם בולטות קדמית spiracles עגולה.

יום 2

2. העברה, ניתוח של קיבוע.

להעביר את הגלמים (2 h לפני הזמן פיתוח הוא להשלים) באמצעות מברשת צבע, עד השקופית מיקרוסקופ עם סרט הדבקה דו-צדדי דבקה זה. מקם את הגלמים כדי ליצור שורה עם מעלה הגבי צדדים cephalic מסתיים פונות לאותו הכיוון.
לחזור לשקופית מיקרוסקופ טמפרטורה קבועה ולאפשר הגלמים להשלים את הזמן המתאים התפתחותית (כלומר 24-30 h APF).
הערה: השקופית מיקרוסקופ עם קלטת דו-צדדית יהיה פלטפורמה חלוף ניתוח כדי להסיר את המקרה הגולמי (ראו להלן). זמן לשגות בשקופית מיקרוסקופ (מחוץ המבחנה) עוזר לייבש את התיק הגולמי עושה את. זה בקלות שבירים עם מלקחיים.
הסר את operculum המקרה הגולמי באמצעות מלקחיים.
לפענח את המקרה עם מלקחיים (כפי שמוצג בסרטון) ביצוע קו לאורך הצד של הגולם הסוף סימטרית. זה אפשרי לזהות את הצורה פנימי של הגולם שהופך ניכר רווח מעל הציר של האגף הגולמי ההארה מתאימות. שטח זה משמש מדריך כדי לבצע את הפתיחה ללא פגיעה הגולם.
הסרת חלקים של המקרה, לאסוף אותם ליד הגבול נפתח ולהסתובב איתם לצד הנגדי שבו הקלטת דו-צדדית יחזיק אותם. בסוף הקרע הגלמים יהיה כמעט "עירום", שרק חתיכה קטנה של התיק לסקר את הקצה האחורי.
הערה: מטרת להשאיר כמות קטנה של התיק סימטרית בקצה העליון נועד להבטיח שחרור חלק מהתיק אותן לשקופית עם קלטת דו-צדדית. ההיגיון העומד מאחורי פעולה זו היא כי אם תסיר מדי של התיק אתה מאוד להסתכן בפגיעה הגולם. לעומת זאת אם תסיר מעט מדי, הגולם לא בקלות יבוא חינם של התיק.
לדחוף למטה (עם מלקחיים) השארית של התיק. תנועה זו מעלה בקצה הקדמי של הגולם, ומאפשר גם בראש וגם החזה להישאר בעמדה מועדף לדבוק וכדי להעביר בשלב שלאחר מכן.
קח שקופית חדשה עם סרט הדבקה דו-צדדי, היפוך זה גולם או שורה הגלמים. אנו ממליצים על ביצוע גישה זו על ידי התבוננות תנועות בסיועם stereomicroscope כדי למנוע שבירה של הגלמים.
הקש מעט כדי להפוך את הגלמים לדבוק הקלטת, בעדינות והחלק את השקופית כדי להסיר את הגלמים משאר המקרים. היפוך השקופית למיקרוסקופ: הגלמים יהיה תקוע בצד הגבי ברמה של הראש שלהם / אזור בית החזה.
מכסה כל הגלמים עירום עם 4% paraformaldehyde, לחכות 10 דקות. מניסיוננו, זו מאובדן זמן עם מקבע מסייע לשינוי מרקם של הקוטיקולה הפיכתה המשרד, פחות דביק, קל לטפל.
הערה: כדי לבצע את החילוץ חומצה ריבונוקלאית (RNA), paraformaldehyde תחליף עבור באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עשה עם RNase ללא מים ולהסיר את הכנפיים הגולמי עושה חתך (בעזרת מספריים) ליד נקודת הציר של כל גפה. באמצעות מלקחיים, להעביר את הכנף הגולמי צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של ריאגנט guanidinium thiocyanate ופנול. לאחר איסוף סך של 50-80 כנפיים, לאחסן את הצינור microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד ביצוע ה RNA החילוץ¹⁰^,¹¹.
עושים חתך קטן על האזור ציר של הזרוע או בקרבתה. לאפשר את מקבע להגיע האפיתל כנף. באמצעות פיפטה (p200) מיושרות מקבע מעל הכנף. בעת שטיפה החלף מזוהמים שמלמדות עם חדש. לאחר שטיפה, ממשיך האגף לשבועיים למשך 5 דקות.
הערה: למרות התמרון הזה עוזר לסלק את רוב רקמת מזהמים, כמה hemocytes, טיפות השמן יכול להישאר לכודים בין הרבדים אפיתל הגבי ו הגחון של האגף (ראה איור 1 א').
דמעה עם מלקחיים מגבול לציפורן (כפי שמוצג בסרטון) מרחיבה את החור ועל הפעלת על שחרורו של האפיתל כנף מן הקרום לציפורן. ברגע הרקמה כנף הוא שוחרר, השאירו זה הפתרון paraformaldehyde להשלמת 30 דקות של קיבעון.
להעביר את הכנפיים קבוע אחד נקוו 4 צלחת פלסטיק מלאים PBST (טריטון X-100 0.05%). חנות בן לילה ב 4 º C.

יום 3

3. ראשי נוגדן הדגירה.

Permeabilize הרקמה המקננת הכנפיים הגולמי ב- PBST (טריטון X-100 0.2%) למשך 15 דקות באמצעות פלטפורמה נדנדה כדי להקל על תנועה בינונית נוזלי עדין.
הערה: עד הרכבה הדגימות, השלבים צריכה להתבצע באמצעות פלטפורמה נדנדה.
לחסום את הדגימות באמצעות PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) לשעה.
להשתמש המאגר אותו לדלל נוגדן ראשוני (העכבר אנטי-Ptc, בטחונות) של דגירה הכנפיים הגולמי בן לילה ב 4 º C.

יום 4

4. משני נוגדן הדגירה.

שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)
דגירה עם נוגדנים משניים (למשל, העכבר אנטי מצומדת כדי fluorochrome) מדולל על הריכוז המתאים ב- PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) בטמפרטורת החדר בחושך, כבר שעתיים.
הערה: אם זה מתאים, השתמש 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו/או phalloidin כדי counterstain את הרקמה. הוסף רגשים אלו עם הנוגדן משני לוקח בחשבון את אורך הגל של פליטה של fluorochromes כדי למנוע את החפיפה של אותות.
שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)

5. הרכבה

להכין מדגם שקופית על-ידי הצבת נקודות 4 של לק שקוף על השקופית מיקרוסקופ כאילו היו הקודקודים של ריבוע.

הם יהיו הנקודות שבו ינוח coverslips, המסייע למנוע ריסוק הרקמה.

מקום 30 µL של הרכבה מדיה (גליצרול/טריס-HCl 80 אחוז) במרכז הכיכר של הנקודות עשה עם לק מבלי לגעת באחת הפינות (נקודות). לוקחים פיפטה עם טיפ החתוכה צהוב, לטעון כמה כלי תקשורת הרכבה, ואז מצייר באגפים הגולמי במספר.

העברה כנפיים הגולמי הנקודה של הרכבה מדיה בשקופית מיקרוסקופ. בעזרת טיפ, התפשטה התקשורת הרכבה, להטביע את הכנפיים הגולמי כדי למנוע מהם צף. המורפולוגיה של הרקמה יישמרו אם הכנפיים יישאר שטוח הזכוכית המכסה ממוקם על. לפני הצבת הזכוכית המכסה, הסר את בועות האוויר.

הנמך את coverslip על גבי הדגימות מנסה למנוע את הדור של בועות אוויר. תנועה זו יכול להיעשות בעזרת מלקחיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה עבור קבלת דגימות כנף הגולמי לשמור המורפולוגיה מוכר של האגף. מן ההכנות הללו זה ניתן לקבל ערימות של תמונות יכול להיות מוקרן דו-ממדיים או תלת-ממד, לחקור הפצה ו/או ההעשרה של חלבונים במהלך הבידול של האגף. (ראה ההערה ב- 2.9) פרוטוקול דומה ניתן לאסוף גדול כנף הגולמי המדגם (50-80 מעורבים wings הגולמי) הדרושים כדי לסנתז חומצה deoxyribonucleic משלימים (cDNA), התבנית המשמשת ב- PCR תגובות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה של דיסקציה המתואר בסרטון זה יכול לשמש כדי להכין דוגמאות באיכות גבוהה דרוזופילה כנפיים הגולמי של שלבי ההתפתחות השונים עבור סוגים רבים של טכניקות (למשל, immunofluorescence, cDNA סינתזה כדי מבחני ה-PCR, גופית ווינג פיתוח). במונחים של שיטה זו מעורב המדען השתמשו 24-30 h APF. עם זאת צריך להיות שום מכשול בתוך הפעולות החיוניות דיסקציה של גולם צעיר או מבוגר. שינויים ייתכן שיש לבצע כדי להכיל גולם שלב קטן יותר.

הפרוטוקול יכול להתבצע לנתח גולם אחד או מספר הגלמים באותו זמן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות CSIC על התמיכה הכלכלית שגבה את הפרויקט, מריאנה פינטור Di לסיוע טכני שלה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית; כדי חוסה Báez לאונרדו עבור תיקונים כתב היד שלו; כדי לוצ'יאנו קוראה על מסירותו ליצירתו של הוידאו; כדי Rosano נטליה שהשאלת את הקול שלה עבור הווידאו ואת מרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון למתן את המניות השתמשו במחקר זה. Apa1 נגד monoclonal-Ptc שפותחה על ידי איזבל גררו שהושג מ התפתחותי מחקרים ליפידים הבנק (DSHB) תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, במחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סטריאומיקרוסקופ עם תאורת אור קרירה	Nikon
SMZ1000 פלטפורמת נדנדה	ביומטריה (WT 16)	042-500
שקופיות מיקרוסקופ	StarFrost	8037/1
משקפי כיסוי (24 x 32 מ"מ)	Deltalab	D102432
מלקחיים	FST	11252-00
מספריים	Lawton	63-1400
כלי פלסטיק רב בארות	תרמו	144444
p100 או p200 פיפטה	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1X PBS (Dulbecco)	Gibco	21600-010
4% paraformaldehyde	סיגמא	158127
טריטון X-100	סיגמא	T8787
BSA	ביו בייסיק בע"מ.	9048-46-8
גליצרול	מלינקרודט	5092
טריס	אמרסקו	497
טריזול ריאגנט	אמביון	15596026
DEPC מים מטופלים	MO. BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 עזים נגד עכבר IgG (H+L), 2 מ"ג/מ"ל (דילול עבודה 1/800)	Invitrogen	A11030
מונוקלונלי אנטי-PTC (Apa-1) 54 μ g/mL (דילול עבודה 1/100)	בנק היברידומה למחקרים התפתחותיים (DSHB)		מאת איזבל ג'ררו מ-DSHB בחסות ה-NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.
DAPI, 1 מ"ג/מ"ל (דילול עבודה 1/5000)	Invitrogen	62248
Phalloidin מצומד ל-Alexa 488, 300 U/1.5 מ"ל מתנול (דילול עבודה 1/600)	Invitrogen	A12379
Canton S (מלאי זבוב)	מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה

מדעי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patched

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים