שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
במהלך אנדוציטוזה, מאוחה הסינפטיות מאוחזרות על קצות עצבים היקפיים, המאפשרות שלפוחית מיחזור, ובכך את התחזוקה של ההעברה הסינאפסית במהלך ירי עצב חוזרות. אנדוציטוזה לקוי בתנאים פתולוגיים מוביל ירידות סינפטית כוח, המוח מתפקד. כאן, אנו מתארים שיטות למדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית על הסינפסה בהיפוקמפוס יונקים בתרבות עצביים. אנחנו בפיקוח שלפוחית סינפטית חלבון אנדוציטוזה פיוזינג חלבון ממברנה vesicular סינפטית, כולל synaptophysin ו VAMP2/synaptobrevin, בצד lumenal vesicular, עם pHluorin, רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק זה מגביר שלה עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמו ה-pH מעלה. במהלך אקסוציטוזה, מגביר לומן vesicular pH, ואילו במהלך אנדוציטוזה vesicular לומן pH הוא acidified מחדש. לפיכך, גידול של עוצמת קרינה פלואורסצנטית pHluorin מציין היתוך, ואילו ירידה מציין אנדוציטוזה של החלבון שלפוחית סינפטית עם תוויות ברורות. בנוסף לשימוש בשיטת הדמיה pHluorin להקליט אנדוציטוזה, אנחנו בפיקוח אנדוציטוזה ממברנה vesicular על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מדידות של ספיגת peroxidase (HRP) חזרת שלפוחית. בסופו של דבר, אנחנו פיקוח היווצרות של חוצפה רפידה מסוף בורות בזמנים שונים לאחר דפולריזציה הנוצרות על-ידי אשלגן גבוה. מסלול הזמן של ספיגת HRP בור היווצרות קרום מציין את מהלך הזמן של אנדוציטוזה.
מבוא
נוירוטרנסמיטרים מאוחסנים הסינפטיות, שפורסמו על ידי אקסוציטוזה. קרום שלפוחית סינפטית של חלבון לאחר מכן על ידי אנדוציטוזה הינם בשימוש חוזר לסיבוב הבא של אקסוציטוזה. אנדוציטוזה של הסינפטיות חשוב לשמירה על שלפוחית סינפטית בריכות ומסירה שלפוחית הבולטות של קרום פלזמה. PHluorin רגיש pH חלבון פלואורסצנטי ירוק, אשר הוא מתרצה בנסיבות חומצי, dequenched ב pH ניטראלי, שימש כדי למדוד זמן אנדוציטוזה קורסים לחיות תאים1,2,3. החלבון pHluorin מחובר בדרך כלל לצד lumenal של חלבונים שלפוחית סינפטית, כגון synaptophysin או VAMP2/synaptobrevin. במצב מנוחה, pHluorin הוא מתרצה ב- 5.5 pH לומן של הסינפטי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול הבאים מתאר את שיטות הדמיה pHluorin ופעולות EM בשימוש נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית. pHluorin צגים שלפוחית סינפטית חלבון ספיגת בתאים חיים ו- EM מזהה ספיגת של שלפוחית סינפטית, השינויים ultrastructural.
טיפול בבעלי חיים, הליך עקב הנחיות NIH, אושרו על ידי NIH חיה טיפול ועל שימוש הוועדה.
1-pHluorin הדמיה
- נוירון בהיפוקמפוס תרבות
- הכן ההיפוקמפוס מאגר (HB) על ידי שילוב של 4 מ"מ NaHCO 3 ו 5 מ מ HEPES ולהתאים את ה-pH 7.3 עם 5 M NaOH. להפוך את המדיום התרבות על ידי ערבוב neurobasal בינוני, 2% B27, 0.5 מ מגלוטמין ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. בנוסף, להכין תערובת של המאג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בשיטת המוביל השומנים, SpH בא לידי נוירונים בהיפוקמפוס, המאפשרות הזיהוי עם העיתון ons (איור 1 א'). גירוי חשמלי של התאים הנגרמת אקסוציטוזה, וגידול מקביל בעוצמתם זריחה. העלייה ברמת קרינה פלואורסצנטית (ΔF) נעצר על ידי סיום הגירוי (איור 1b). ידי קרינה פלואורסצנטית מוגברת בעקבות ירידה איטית, עקב אנדוציטוזה. במקרה של VAMP2-pHluorin, VAMP2 מפזרת לאורך הפעולה באקסון של בוטון לאחר גירוי4. הנתונים הגולמיים להשת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן נדגים שתי שיטות לניטור אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית. בשיטה הראשונה, אנחנו במעקב pHluorin התמזגו עם חלבון שלפוחית סינפטית בנוירונים transfected, לאחר מכן חשמלית מגורה. שנית, השתמשנו EM הדמיה של ספיגת HRP כפי שנגזרות אשלגן כלורי. השתמשנו גירויים שונים משתי סיבות. ראשית, יישום אשלגן גבוה גורם דפולריזציה של נוירונים כל בתרבות. זה מקל על הבדיקה EM, בהתחשב בכך המתודולוגיה שלנו אם לא יכול היה להבחין בין נוירונים שאינם מגורה ולא מאולצת. שנית, אולטרה מבניים שינויים מורפולוגיים נצפו בצורה מהימנה יותר לאחר גירוי חזק, כגון גירוי א.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים ד ר יונג-לינג ז'ו על מתן לבנות synaptophysin-pHluorin2x, ד ר ג'יימס דגלס רוטמן על מתן VAMP2-phluorin. אנו מודים ד ר סוזן נג ו וירג'יניה קרוקר NINDS מיקרוסקופ אלקטרונים מתקן על תמיכה טכנית ועזרה שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ תוכנית מחקר מגזר בארה ב, מענק של KRIBB המחקר יוזמת התוכנית (קוריאנית ביו מדען תכנית העמיתים), המכון הקוריאני לחקר של Bioscience, ביוטכנולוגיה/ביולוגיה, הרפובליקה של קוריאה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Lipofectamine LTX עם Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | טרנספקציה של DNA פלסמיד כולל סינפטופיזין או מדיום נוירו-בסיסי VAMP2-pHluorin |
| Thermo Fisher | 21103-049 | מדיום גידול לנוירון, לחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש | |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | שיפוע להתמיינות עצבית |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | שיפוע לתרבית עצבית |
| מצופה פולי-D-ליזין | Neuvitro | GG-25-pdl | מצע לצמיחה עצבית והדמיה של pHluorin |
| Trypsin XI מלבלב בקר | Sigma | T1005 | Neuronal תרבית לעכל רקמות היפוקמפוס |
| Deoxyribonuclease I מלבלב בקר | Sigma | D5025 | תרבית עצבית מעכבת תרבית צמיגה מתלה תאים |
| צמיגים ממריץ דופק | A-M | דגם 2100 | החל גירוי חשמלי |
| אמבטיה מחוררת עם גירוי שדה | Warner Instruments | RC-21BRFS | החל |
| יחידת | בידוד גירוי גירוי חשמליWarner Instruments | SIU102 | לגירוי חשמלי |
| Dow corning | 111 | pHluorin איטום הדמיה עם כיסוי ותא הדמיה, הימנע מדליפה מהתא | |
| AP5 | Tocris | 3693 | שיפוע למי מלח רגילים, אנטגוניסט קולטן NMDA סלקטיבי, מעכב פעילות פוסט-סינפטית שיש לה פוטנציאל לפעילות חוזרת |
| CNQX | Tocris | 190 | שיפוע למי מלח רגילים, אנטגוניסט קולטן AMPA/kainate תחרותי, מעכב פעילות פוסט-סינפטית שיש לה פוטנציאל לפעילות חוזרת |
| תאורה | Nikon | C-HGFI | מקור אור מתכת הליד למצלמת pHluorin |
| EMCCD | Andor | iXon3 | הדמיית pHluorin, זיהוי עוצמת פלואורסצנטיות pHluorin |
| מיקרוסקופיה הפוכה | Nikon | Ti-E | הדמיה עבור תאים סינפטופיזינים או VAMP2 pHluorin שעברו טרנספטציה |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements תוכנת מחקר מתקדמת | לרכישת וניתוח הדמיה |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | תוכנה לניתוח הדמיה והצגת נתונים |
| תא הדמיה | Warner Instruments | RC21B | הדמיית pHluorin, החלת גירוי שדה על תאים חיים |
| מיקרוסקופ אלקטרונים פולי-ליזין | Sigma | P4832 | מצע לצמיחה עצבית, למרוח על צלחת מרובת בארות למשך שעה בטמפרטורת החדר ואז לשטוף במים מעוקרים 3 פעמים |
| חזרת פרוקסידאז (HRP) | Sigma | P6782 | מיקרוסקופ אלקטרונים, תיוג שלפוחיות סינפטיות אנדוציטוזיות על ידי זירוז DAB בנוכחות מי חמצן, הריכוז הסופי הוא 5 מ"ג/מ"ל במי מלח רגילים, טרי לפני השימוש |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | מיקרוסקופ אלקטרונים, מאגר לקיבוע ושטיפה, הריכוז הסופי הוא 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | מיקרוסקופ אלקטרונים, תיוג שלפוחיות סינפטיות אנדוציטוזיות, מצע ל-HRP, הריכוז הסופי הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ב-DDW ומסונן, טרי לפני השימוש |
| תמיסת מי חמצן | Sigma | H1009 | מיקרוסקופ אלקטרונים, תיוג שלפוחיות סינפטיות אנדוציטוזיות על ידי השראת תגובת HRP-DAB, הריכוז הסופי הוא 0.3% ב-DDW, לעשות טרי לפני השימוש |
| ב-glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | מיקרוסקופ אלקטרונים, מקבעים, הריכוז הסופי הוא 4% במאגר Na-cacodylate, לעשות טרי לפני השימוש, לנער היטב לפני השימוש ב-TEM |
| JEOL | 200CX | מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של שלפוחיות אנדוציטוזיות ושינויים אולטרה-מבניים | |
| מצלמה דיגיטלית CCD AMT | XR-100 | מיקרוסקופ אלקטרונים, לכידת תמונות | |
| מיקרו-מערכות עופרת ציטראט | Leica | 16707235 | מיקרוסקופ אלקטרונים, צביעת רשת |
מקורות
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calc....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
