מאמר שיטה

ניתוח של המעבר צומת הפער תלוי מירנה עם מיקרוסקופיה 3D-FRAP

DOI:

10.3791/55870

⸱

19 ביוני 2017

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את היישום של התאוששות מימדי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) לניתוח של צומת הפער התלוי תלוי של מירנה. בניגוד לשיטות מיושמות בדרך כלל, 3D-FRAP מאפשר כימות של העברה בין תאית של RNAs קטנים בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ספטיו- temporal.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קטן RNAs antisense, כמו מירנה ו siRNA, לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגיה הסלולר פתולוגיה, יתר על כן, ניתן להשתמש סוכני טיפולית לטיפול במספר מחלות. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות וחדשניות עבור טיפול מירנה / siRNA מבוסס על ידע נרחב של המנגנונים הבסיסיים. נתונים אחרונים מראים כי RNAs קטנים מוחלפים בין התאים בצורה תלויה בצומת הפער, ובכך גורם להשפעות גנטיות של הגן בתא הנמען. טכניקות ביולוגיות מולקולריות וניתוח cytometric זרימה משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את חילופי בין תאיים של מירנה. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים רזולוציה גבוהה טמפורלית, אשר הכרחי כאשר לומדים את הפער השטף פער של מולקולות. לכן, כדי לחקור את ההשפעה של מירנה / siRNA כמו מולקולות איתות בין תאיים, כלים חדשים נדרשים שיאפשר ניתוח של אלה RNAs קטנים ברמה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את apPlication של התאוששות פלואורסצנטי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) מיקרוסקופ כדי להבהיר את צומת הפער תלוי החליפין של מולקולות מירנה בין תאים לבביים. חשוב לציין, זה פשוט ולא פולשני לחיות הדמיה גישה הדמיה מאפשרת הדמיה וכימות של shuttling פער junctional של RNAs קטן שכותרתו fluorescently בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ברזולוציה זמן. הנתונים המתקבלים על ידי 3D-FRAP מאשרים מסלול חדש של רגולציה גנים בין תאיים, כאשר RNA קטנים פועלים כמולקולות איתות בתוך הרשת הבין-תאית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קטנים RNAs noncoding הם שחקנים חשובים בתחום הרגולציה הגן הסלולרי. מולקולות אלה מורכבים 20-25 נוקליאוטידים כי לאגד mRNA מטרה מסוימת, המוביל לחסימה של תרגום או ל mRNA השפלה 1 , 2 . תהליך הרגולציה הגנטית שנעשה על ידי RNA קטנים, כגון מירנה ו siRNA, הוא מנגנון שמרני מאוד שנמצא במינים שונים רבים 3 . בפרט, מולקולות מירנה הם בעלי חשיבות מכרעת למגוון של תהליכים פיזיולוגיים, כולל התפשטות, דיפרנציאציה, התחדשות 4 , 5 . בנוסף, dysregulation הביטוי מירנה מיוחסת להפרעות פתולוגיות רבות. מקביל, miRNAs הוכחו להיות מתאים כמו סמנים ביולוגיים לאבחון כמו סוכני טיפולית עבור טיפול גנטי 6 , 7 .

צמתים הפער (GJs) הם מבנים חלבונים מיוחדים בקרום פלזמה של שני תאים סמוכים המאפשרים חילופי diffusional של מולקולות עם משקל מולקולרי של עד 1 kD. הם הוכחו כחשובים להתפתחות רקמות, דיפרנציאציה, מוות לתאים והפרעות פתולוגיות כגון סרטן או מחלות לב וכלי דם 8 , 9 , 10 . מספר מולקולות תוארו כמי שמסוגלות לחצות את ערוצי ה- GJ, כולל יונים, מטבוליטים ונוקליאוטידים. מעניין, GJs נמצאו גם לספק מסלול לתנועה בין תאיים של RNA קטנים 11 , 12 . לפיכך, miRNAs יכול לפעול לא רק בתוך התא שבו הם מיוצרים, אלא גם בתוך תאים הנמען. זה מדגיש את התפקיד של miRNAs במערכת interducellular transduction האות. יחד עם זאת, הנתונים להפגיןכי פער תקשורת intertellular פער קשורה קשר הדוק לתפקוד מירנה. בגלל ההשפעה המשמעותית של מירנה ו GJs על הומאוסטזיס רקמות, פתולוגיה, ואבחון, הבנה מקיפה של הפונקציה של GJs ואת הדינמיקה הבין תאיים הקשורים מירנה יעזור להבהיר את המנגנונים של מחלות מבוססות מירנה לפתח אסטרטגיות חדשות עבור טיפולים מירנה.

בהתאם להיקף של צימוד genctional הפער, העברת מולקולות מירנה בין התאים יכול להיות תהליך מהיר מאוד. לכן, מתודולוגיה המאפשרת הדמיה וכימות של תנועה בין תאנית מהירה של אלה מולקולות איתות רגולציה נדרשת. בדרך כלל, cytometry זרימה וטכניקות ביולוגיות מולקולריות יושמו כדי להדגים את shuttleling של RNAs קטנים 11 , 12 , 13 , 14 . עם זאת, בניגוד micros FRAPלהעתיק, גישות אלה חסרים ברזולוציה טמפורלית גבוהה, אשר חובה בעת ניתוח החליפין של מירנה באמצעות GJs. יתר על כן, מיקרוסקופ FRAP הוא פולשני פחות ולכן מייצג חזק ורומנטי לחיות הדמיה תא טכניקה כדי להעריך את חילופי GJ תלויי של מולקולות במספר סוגי תאים 15 , 16 , 17 .

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את היישום של 3D-FRAP להעריך מירנה shuttling בין cardiomyocytes. לשם כך, cardiomyocytes היו transfected עם מירנה שכותרתו fluorescently. תא מסומן עם miRNA זה היה photobleached, ואת הפער פער miRNA מחדש של תאים סמוכים נרשמה באופן תלוי זמן. רזולוציה גבוהה של הניסויים FRAP מציע את האפשרות לבצע מחקרים קינטיים להערכה מדויקת של העברה בין תאיים של מירנה ו siRNA בין תאים חיים. מורוVer, כמו RNAs קטן ניתן להחליף באמצעות מנגנונים שונים עם קינטיקה שונה מאוד, מיקרוסקופ FRAP יכול לעזור להבהיר את מידת ההשתתפות של GJs בתהליכים Shuttleling בהתאמה 18 . בנוסף, 3D-FRAP ניתן להשתמש כדי לחקור שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים בחדירות GJ ואת השפעתה על העברת RNA קטן 15 , 19 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השלבים בפרוטוקול זה מעורבים עכברים בילודים בוצעו לפי הנחיות אתיות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי אוניברסיטת רוסטוק.

1. הכנת של תרבות תאים צלחות בינונית לתרבות cardiomyocyte

  1. מעיל צלחת תרבות התא עם ג 'לטין 0.1% ב PBS ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר את הג'לטין ולאפשר לו להתייבש תחת זרימת אוויר סטרילית למינרית.
  2. הכינו בינוני תרבות התא מורכב 50 מ"ל של DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). טרום חם עד 37 מעלות צלזיוס.

2. בידוד של Cardiomyocytes neonatal

  1. להקריב עכברים neonatal (1-2 ימים) על ידי עריפת ראש עם מספריים סטריליים ולפתוח את החזה לאורך החזה. הסר את הלב באמצעות מלקחיים בזמן לחיצה קלה על החזה יחד ולהעביר את הלב לתוך צלחת 24-היטב המכיל HBSS קר כקרח(ללא Ca 2 + ו Mg 2 + ).
  2. הסר רקמות לא לב וכלי גדול באמצעות מלקחיים סטרילית. העברת לבבות לנקות לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל HBSS קר כקרח. השתמש מקסימום של 5 לבבות לכל צינור לעיכול אנזימטי.
  3. מינס את הלבבות עם מספריים קטנים לתוך <0.5 ל 1 מ"מ חתיכות.
  4. לשטוף את לבבות טחון עם HBSS פעמיים על ידי שאיפה / תוספת של HBSS באמצעות פיפטה 1-מ"ל microliter. הסר את HBSS לחלוטין לפני הוספת האנזימים.
  5. לקבלת עיכול אנזימטי של לבבות ילודים, להשתמש בערכה זמינה מסחרית ופעל פרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים ). לנער את הצינור המכיל לבבות טחון כל 5 דקות תוך דוגרים עם אנזימים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות.
  6. זרעים מושעה על תאים שאינם מצופים בתרבות תאים המכיל בינוני תרבות התא עבור 1.5-2 שעות כדי לאפשר את הדבקות של חלק cardiomyocyte שאינם. חזור על שלב זה אם טוהר גבוהשל cardiomyocytes יש צורך. אם תרצה, עוד התרבות את השבר שאינם cardiomyocyte.
    הערה: עבור ההשעיה התא של 15 לבבות, צעד מראש ציפוי יכול להתבצע על 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות התא. בדרך כלל, ~ 5 x 10 5 תאים מתקבלים בלב אחד neonatal.
  7. איסוף supernatant בצינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. Resuspend התאים 1 מ"ל של המדיום תרבות התא.
  8. לספור את התאים עם hemocytometer Neubauer קאמרית, או להשתמש בשיטה המקבילה.
  9. צלחת cardiomyocytes מבודד על 6 צלחות היטב עם צפיפות של 3 x 10 5 תאים / ס"מ ². דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 .
    הערה: לחלופין, תאים יכולים גם להיות transfected בשלב זה. עם זאת, גדל הכדאיות נצפתה כאשר התאים היו מתורבת במשך יום אחד לפני היותו נתון electroporation.

3. transfection עם מירנה fluorescently תווית

  1. מִרֹאשׁ-בינוני תרבות תאים חמים (ראה שלב 1.2) ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או מכשיר מקביל.
  2. הכן פתרון מניות 20 מיקרומטר של מירנה ניאון במים סטרילי ללא RNase.
  3. הכן חיץ electroporation המכיל 90 מ"מ Na 2 HPO 4 , 90 מ"מ NaH 2 PO 4 , 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2 , ו 10 מ"מ נתרן succinate ולהתאים את ה- pH 7.2; חיץ electroporation ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
  4. לנתק את התאים מהצלחת תרבות באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות. להשבית את טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבית תאים.
  5. לספור את התאים עם hemocytometer Neubauer קאמרית, או להשתמש בשיטה המקבילה. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 10 דקות.
  6. Resuspend התאים במאגר electroporation להשיג ריכוז של 4 x 10 5 תאים לכל 100 μL.
  7. מערבבים 100 μL ההשעיה התא עם מירנה ניאון (ריכוז סופי: 0.25 מיקרומטר) בצינור ולטעון את התערובת לתוך קובט electroporation.
    1. אמפירי לקבוע את הכמות המתאימה של מירנה, בהתאם לסוג התא.
  8. בצע electroporation באמצעות מכשיר electroporation (ראה טבלה של חומרים ), באמצעות "G-009" התוכנית.
  9. הוסף 500 μL של מדיום מראש חימם תרבות תאים ולהעביר את ההשעיה התא כולו (4 x 10 5 תאים) לתוך באר של שקופיות קאמרית 4-היטב זכוכית התחתונה. תרבות התאים ליום 1 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 5% CO 2 .
    הערה: עבור ניתוח FRAP, צפיפות התא של ~ 80% הוא אופטימלי. Transfection של מירנה שכותרתו צריכה להתבצע אך ורק באמצעות electroporation. מאז ההפצה הומוגנית של מולקולות מירנה שכותרתו מועיל למדידת FRAP, transfection מגיב מבוסס לא מומלץ.

4. החלת 3D-FRAP מיקרוסקופית (יום 3)

  1. לחמם את החממה מיקרוסקופ ל 37 מעלות; C ו לעבור על מערכת מיקרוסקופ confocal לפחות 2 שעות לפני המדידה FRAP להקים שיווי משקל תרמי כדי להקטין את האפשרות להיסחף. אם אפשר, לשמור על 5% CO 2 אווירה.
  2. הכנס את השקופית קאמרית למחזיק מדגם הבמה.
  3. מצא אשכול של cardiomyocytes transfected באמצעות המטרה שמן 1.4 NA (הגדלה 400X) ו 561 ננומטר אור עירור לייזר על כוח לייזר נמוך, עם טווח זיהוי של 570-680 ננומטר.
    הערה: ההגדרה של הגדרות FRAP, רכישת התמונה, והניתוח נעשו באמצעות תוכנה ספציפית מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים ).
  4. הפעל את "Z-Stack", "Time Series", "Bleaching", ו "אזורים" לחצנים "מנהל ההתקנה".
  5. הגדר את הפרמטרים FRAP.
    1. הגדר את הגדרות רכישת התמונה בתפריט "מצב רכישה" על ידי הגדרת "גודל המסגרת4; כדי 512 x 512, "צעד השורה" ל 1, ואת "זמן סריקה" כדי <1 s.
    2. בתפריט "ערוצים", להתאים את כוח הלייזר, לקזז, ולהשיג הגדרות כדי לקבל הקרינה מקסימלית מ עירור לייזר מינימלי ( למשל, כוח לייזר: 1-5%); להתאים כדי להימנע מרוויה בעוצמה. הגדר את "גודל חריר" עד 2 מיקרומטר.
    3. הבא, בתפריט "אזורים", בחר את "כלי ציור ROI" ולהשתמש הסמן כדי לסמן את התא היעד, תא התייחסות, ואת אזור הרקע. אם נדרש, בחר מספר תאים היעד photobleaching.
    4. התאם את הגדרות photobleaching בתפריט "הלבנה" ( לדוגמה, איטרציות: 9-14, כוח לייזר עבור photobleaching: 100%, מרווח של רכישת התמונה: 60 s, מחזורים: 15). הגדר את ההתחלה של הלבנה לאחר 3 סריקות ראשוניות.
    5. בתפריט "z- מחסנית", להגדיר את הגבולות של z- מחסנית הרכישה, בהתאם לעובי של התאים. התאם את "מספר oF z- שכבות "ל 12 - 15.
    6. הפעל את הניסוי FRAP ולתעד את ההתאוששות הקרינה.
      הערה: מאז ההגדרות של ניסוי FRAP תלויים בסוג התא, צבע ניאון, ואת מערכת המיקרוסקופ, עדיף לבצע ניסויים טייס כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים עבור FRAP. הלבנה צריך להיות מספיק כדי להפחית את עוצמת הקרינה הראשונית על ידי לפחות 50%. בדרך כלל, התאוששות פלואורסצנטי צריך להיות מוקלט כל 30-60 s עד שלב הרמה הוא הגיע.

5. ניתוח נתונים

  1. יצירת תחזיות מקסימום של z- ערימות שנרכשו ולקבל ערכים עוצמת הקרינה של תאים היעד מולבן, תא התייחסות, ואת הרקע. באמצעות תוכנה ספציפית מיקרוסקופ, לחץ על "עיבוד" → "מקסימום עוצמת הקרנה" → בחר קובץ → "החל".
    1. לחלופין, השתמש בכלי ניתוח תמונה מקביל ( לדוגמה, ImageJ).
  2. העתק את נתוני עוצמת הקרינה בכל נקודות הזמן מתא המטרה, הרקע ותא הייחוס לגיליון אלקטרוני.
    1. הפחת את עוצמת הרקע ואת עוצמת התא התייחסות מערכי האינטראקציה של תא המטרה לתקן photobleaching שנגרם במהלך תהליך הרכישה. לבצע רקע ותיקונים התא התייחסות עבור כל נקודת זמן.
    2. לנרמל את הנתונים FRAP מתוקן על עוצמת הקרינה הראשונית לפני הלבנה על ידי חלוקת כל ערך על ידי הקרינה הראשונית.
    3. כדי להשיג עקומות FRAP, להגדיר את הבסיס לעוצמת הקרינה מיד לאחר אקונומיקה על ידי הפחתת מערכי העוצמה של כל נקודת זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים 3D-FRAP מיקרוסקופית כמו טכניקה לא פולשנית ללמוד את הפער junctional הפער של מירנה ניאון בתוך cardiomyocytes בילוד. Cardiomyocytes מבודד חשף דפוס אופייני α actinin מבודד והכיל לוחות גדולים של Cx43 לאורך גבולות התא תא ( איור 1A , ראשי חץ לבנים), אשר אפשרה השטף בין תאיים גבוהה של מולקולות. טוהר cardiomyocytes מבודד הוערך על ידי כימות מיקרוסקופית של תאים α-actinin חיובי. למרות כמה cardiomyocytes שאינם cardio...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNAs הם שחקני מפתח בפיזיולוגיה הסלולרית והוצגו כמולקולות איתות באמצעות שימוש - בין היתר - GJs כנתיב עבור חילופי בין תאיים 11 , 12 , 22 . הפרוטוקול הנוכחי מציג במבחנה לחיות תאים תא הדמיה טכניקה לאפיין את זה Shifting GJ תלויי באמצעות miRNAs ניאון בתוך אשכולות התא.

הפרוטוקול פותח על cardiomyocytes כמו מערכת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך הפדרלי ומחקר גרמניה (FKZ 0312138A ו FKZ 316159), המדינה מקלנבורג-מערב פומרניה עם האיחוד האירופי מבנית קרנות (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ו ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), ואת הלב הגרמני קרן (F / 01/12). בנוסף, RD נתמך על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001), קרן DAMP ו- BMBF (VIP + 00240).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברי NMRI יילודיםצ'ארלס ריבר
ג'לטיןסיגמא אולדריץ'G7041תמיסה 0.1% ב-PBS,
PBSPan BiotechP04-53500
Dulbecco´ s מדיום שונהPan BiotechP04-03550
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו פישר15140122מדעי 100 U/mL, 100µ g/mL
סרום בקר עובריPan BiotechP30-3306
תרבית תאים פלסטיקTPP
ערכת בידוד קרדיומיוציטים ראשוניתThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281כלול בערכת בידוד קרדיומיוציטים ראשונית
Trypan blueThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 שכותרתו microRNA חיקויDharmaconCP-004500-01-05מתמוססים במים נטולי RNAse, תמיסת מלאי 20µ M
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigmaS3139
נתרן פוספט דו-בסיסיCarl RothT877.2
אשלגן כלוריSigmaP9333
מגנזיום כלורידServa28305.01
נתרן סוקסינטCarl Roth3195.1
0.05% תמיסת טריפסין/EDTAMerckL2153
4 בארות זכוכית תחתון מגלשותIBIDI80827עם תמיסת ג'לטין 0.1%
Amaxa Nucleofector IILonzaתוכנית G-009 שימשה לאלקטרופורציה 
LSM 780 ELYRA PS.1 מערכתZeiss
Excel תוכנהמיקרוסופט
&אלפא אקטינין נוגדןAbcamab9465דילול 1:200
Connexin43 נוגדןסנטה קרוזsc-9059דילול 1:200
עז נגד עכבר Alexa 594 נוגדןתרמו פישר מדעיA-11005דילול 1:300
עז אנטי-ארנב Alexa 488 נוגדןThermo Fisher ScientificA-11034דילול 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724 ריכוז סופי 250 ננומטר
Near-IR Alive/Dead Cell StainKit Thermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein אדום-כתוםThermo ScientificC34851
DAPI כתם גרעיניתרמו סיינטיפיקD1306

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884(2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001(2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166(2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282(2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

miRNA3D FRAPConnexin43RNA

מאמרים קשורים