מאמר שיטה

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

DOI:

10.3791/55917

⸱

14 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בנייר זה, אנו מתארים שיטה להערכת Willebrand פון אנדותל מקדם שחרור, טסית דם עוקבות של לכידת תחת גזירה נוזלים בתגובה לגירויים דלקתיות באמצעות מערכת קאמרית זרימה במבחנה .

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פקטור Willebrand פון (VWF) הוא multimeric גליקופרוטאין קרישה פקטור זה שמתווכת הדבקות טסיות, צבירת באתרים של נזק אנדותל ונושא זה פקטור VIII במחזור. VWF הוא מסונתז על ידי תאי אנדותל משוחרר גם צורונים לתוך הפלזמה או מאוחסן ב- organelles מיוחדים, שנקרא גופות Weibel-Palade (WPBs), לשחרור לפי דרישה, בתגובה אתגר hemostatic. גירויים procoagulant ו- proinflammatory יכול לגרום במהירות WPB אקסוציטוזה ושחרור VWF. רוב שפורסמו על ידי תאי אנדותל VWF מסחררת ב הפלזמה; עם זאת, שיעור של VWF מעוגנת אל פני השטח של תאי אנדותל. בתנאים של הטיה פיזיולוגית, המעוגנת אנדותל VWF יכול לאגד טסיות, ויוצרים מחרוזת VWF-טסיות עשויים לייצג את nidus של כגון היווצרות. מערכת קאמרית זרימה ניתן להתבונן באופן חזותי את שחרורו של VWF מתאי אנדותל, של טסית דם עוקבות ללכוד באופן זה רלוונטי הפתופיזיולוגיה של היווצרות כגון בתיווך VWF הדירים. באמצעות מתודולוגיה זו, תאי אנדותל בתרבית בתוך תא זרימה, מומרץ לאחר מכן עם secretagogues כדי לגרום WPB אקסוציטוזה. טסיות דם שטף הם perfused ואז מעל אנדותל מופעל. טסיות הדם מופעלים, לאחר מכן לאגד מחרוזות VWF מאורכים בכיוון של זרימת נוזלים. באמצעות שינויים היסטוניים חוץ-תאית כמו גירוי procoagulant, proinflammatory, הבחנו היווצרות מחרוזת VWF-טסיות מוגברת על תאי אנדותל שטופלו היסטון בהשוואה לתאי אנדותל ללא טיפול. פרוטוקול זה מתאר הערכה כמותית, חזותי, בזמן אמת של ההפעלה של אינטראקציות VWF-טסיות במודלים של פקקת, hemostasis.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פקקת היא הסיבה המובילה לתמותה ברחבי העולם1 , יכולים לפתח תגובה todysregulated טסיות ההפעלה של תרומבין דור שני עורקים veinsand. פלזמה רמות של VWF מווסת מפתח של קרישת הדם, לפיה רמות נמוכות (< 50%) התוצאה הפרעת דימום המכונה Willebrand פון המחלה (VWD)2 ורמות גבוהות (> 150%) הם קשורים לסיכון מוגבר של ורידים3 ו פקקת עורקים4 .

VWF הוא גליקופרוטאין multimeric מסונתז על ידי megakaryocytes ותאי אנדותל ומאוחסנים טסיות α-גרגירים, WPBs, בהתאמה. על אתגר hemostatic, VWF יכול להשתחרר מן WPBs אנדותל לקשור טסיות הדם במחזור תאי אנדותל מופעל5 או קולגן חשוף על קיר הספינה6. עיגון של VWF לתאי אנדותל הוכח להיות מתווכת על-ידי בחירת שמלות P7 ואינטגרין αvβ38. שחרור עוקבות של טסיות α-גרגר חנויות יכולה להמשיך להגדיל ריכוזים VWF לשפות אחרות כדי לייצב טסיות-טסיות האינטראקציות עבור טסיות הכנס היווצרות, לגרדום לצורך התפשטות של קרישת הדם בהתאם להירארכיית הקשרים, פיברין התצהיר. פעילות טסיות-איגוד של VWF מוסדר על ידי המבנה multimeric שלה, עם משקל מולקולרי גבוה multimers בעלי פעילות hemostatic גדול9,10. במחזור, VWF גם משמש כנשא עבור השמיני גורם קרישה.

נוזל גזירה היא הרגולטור חיוני של פיזיולוגיה VWF. בהיעדרו של גזירה, VWF קיימת בטופס הכדוריים, הסתרת מחייב תחומים עבור טסיות גליקופרוטאין ליברות אדהזיה11. כאשר קיים מאמץ גזירה, באתר של המחשוף metalloprotease, disintegrin, ו metalloprotease עם מוטיב thrombospondin (ADAMTS13), נחשפת. ADAMTS13 cleaves מחרוזות VWF עירום, מעוצבים טסיות כדי לווסת את גודל multimer, ובכך מקצר את פעילות hemostatic12.

VWF הוא חלבון שלב חריפה, גירויים רבים, לרבות היפוקסיה13, זיהום14ציטוקינים proinflammatory, הוכחו לתווך שחרור תאי אנדותל VWF. דומה לשני סוכני דלקתיות, שינויים היסטוניים חוץ-תאית יש גם הוכח לזירוז במהדורה VWF מערכתית עכברים15,16 והפעלה של טסיות במבחנה17,18, 19. זה הוצגה להיות תלוי סוג של היסטון, כמו הבדלים ליזין ו ארגינין תוכן עשוי להשפיע על תפקוד15. מטרות המחקר שלנו להקים תא זרימה דגם לחקור את ההשפעה של ליזין-עשיר (HK) וללכוד ארגינין-עשיר (HR) היסטון יחוברו, secretagogues על אנדותל VWF שחרור, טסית דם בזמן אמת, פוטנציאל םיעוריא מוקדם דלקת-induced פקקת.

מתודולוגיה קאמרית זו הזרימה recapitulates ויוו אינטראקציות בין קולגן subendothelial, תאי אנדותל, VWF טסיות הדם במערכת במבחנה הוא חזותי, הדירים לכימות. היא מאפשרת ההערכה בזמן אמת של כל ההיבטים של מסלול המסדירה את האינטראקציות VWF-טסיות, כולל הפרשת WPB, הפעלת טסיות VWF proteolysis. מחקרים של VWF בתנאים מבוקרים גזירה שימשו להערכת מוטציות VWD שפוגעים שחרור VWF, תפקוד טסיות מחייב20, פיזיולוגיה WPB21, VWF המחשוף מאת ADAMTS135. אנו משתמשים מתודולוגיה זו כדי לכמת את היווצרות מחרוזת VWF-טסיות כתוצאה גירוי דלקתי: שינויים היסטוניים חוץ-תאית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אלה אושרו על-ידי אוניברסיטת, קנדה מחקר אתיקה הלוח של המלכה.

1. גירוי תאי אנדותל

  1. קולגן-המעיל צלחת תרביות רקמה 6-. טוב.
    1. 24 שעות מראש, המעיל צלחת תרביות רקמה 6-ובכן ב 37 ° C עם 1 מ"ל של קולגן מאגר (50 µg/mL עכברוש הזנב קולגן מסוג 1 עם חומצה אצטית מ' 0.02 נקודות).
    2. לשטוף את בארות פעמיים עם 2 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק).
      הערה: צלחות יכול להיות עטוף בנייר ומאוחסנים שקית פלסטיק אטום ב 4 º C.
  2. זרע תאי אנדותל-צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים לכל טוב ב- 2 מ של הצמיחה בינונית המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS). דגירה התאים במשך 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO2).
    הערה: כאן, תוצר אנדותל תאי דם (BOECs) בין פסוקים 5 -15 היו בשימוש. BOECs הם בודדו אותנו מהמתרחש מתנדבים בריאים עם רצף VWF wildtype באמצעות שיטת שאוזכרו בבכיות. et al. 22 באופן דומה לאחד שתואר קודם לכן על ידי יופיטר23.
  3. להסיר את המדיום לאחר 24 שעות ולשטוף את התאים עם HBSS.
  4. להוסיף 1 מ"ל של בינוני ללא סרום (מדיום הגידול חיוני מינימלית בלי FBS) המכיל phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA; 100 ננומטר), unfractionated היסטון (אההה), ו HK או HR (כל-µg 25/mL) לתאים עבור 2 h ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO2).
    הערה: בריכוז זה של היסטון התבססה על קודמים במבחנה דוחות cytotoxicity על ידי שו. et al. 24 , אברמס ואח. 25 בשימוש µg 50/mL.
  5. לאסוף את המדיום לאחר 2 h ואחסן אותו ב-20 ° C עד הניתוח.

2. VWF כמת על ידי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay (אליסה)

  1. מעיל של microplate עם µL 100 של ציפוי מאגר (10 מ מ dibasic סודיום פוספט ו- 145 מ מ נתרן כלורי, pH 7.2) המכילה 10 µg/mL נגד polyclonal-VWF נוגדן למשך הלילה ב 4 º C.
  2. לשטוף לצלחת שלוש פעמים עם 250 µL שטיפת מאגר (10 מ מ dibasic סודיום פוספט, 500 מ מ נתרן כלוריד ו- 0.1% Tween 20, pH 7.2).
  3. לדלל הדגימות בינוני 1:2 ו- 1:4 עם מאגר לשטוף ולהשתמש פלזמה הפניה רגילה עבור עיקול רגיל, שמתחילים ב- 1:10 דילול.
  4. צלחת µL 100 של דגימות מדולל ותקנים בין לילה ב 4 º C.
  5. רחץ לצלחת שלוש פעמים עם 250 µL שטיפת המאגר.
  6. להוסיף 100 µL של מדולל אנטי-VWF, HRP מצומדת זיהוי נוגדנים (1.1 µg/µL במאגר לשטוף) לצלחת, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.
  7. רוחצים את הצלחת את תקופת דגירה של 10 דקות עם ריאגנט dihydrochloride (OPD) O-Phenylenediamine, לפי הוראות היצרן.
  8. לעצור את התגובה עם 100 µL של 1 מ' H2אז4 וכן לקרוא הצלחת 492 ננומטר.

3. מוצק-שלב היסטון-VWF וזמינותו מחייבת

  1. מעיל של microplate עם שינויים היסטוניים מדולל במאגר 0.5% נתרן deoxycholate 50 מ מ קרבונט (pH 9.6) כדי µg/mL 10 בן לילה ב 4 º C.
  2. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם µL 250 ל- PBS בתוספת 0.1% 20 Tween, המקננת 10 דקות בין שוטף.
  3. לחסום את הצלחת עם µL 200 ל- PBS בתוספת 0.1% Tween 20 ו- 1% שור אלבומין (BSA) לשעה בטמפרטורת החדר.
  4. חזור על שלב 3.2.
  5. באופן סדרתי לדלל פלזמה-derived VWF/הגורם האנושי מורכב מ- 200 של מו מ ל mU 25/mL במאגר מלוחים השמיני (10 מ מ dibasic סודיום פוספט, 500 מ מ נתרן כלורי, 0.1% Tween 20, pH 7.2). להוסיף 100 µL הצלחת. בשביל 2 h בטמפרטורת החדר.
  6. חזור על שלב 3.2.
  7. לזהות את הכריכה של VWF כדי היסטון קיבוע באמצעות µL 100 של פתרון המכיל PBS-0.1% Tween 20 ו- 1:1,000 הארנב נגד polyclonal-VWF נוגדן מצומדת כדי HRP לשעה בטמפרטורת החדר.
  8. חזור על שלב 3.2.
  9. דגירה את הצלחת למשך 30 דקות עם 100 µL של ריאגנט OPD ולהפסיק את התגובה עם 100 µL של 1 מ' H2אז4. למדוד את הצפיפות האופטית-492 ננומטר.

4. זריעת תאי אנדותל על גבי תאי זרימה

  1. לטעון 0.5 מ של מאגר ציפוי קולגן (שמתואר בשלב 2.1) לתוך מזרק 1-mL סכינים סטריליים-lock.
  2. טוויסט בסוף נעל-סכינים סטריליים המזרק אל המאגר של שקופית קאמרית זרימה.
  3. לחצו הבוכנה לאט עד השביל כולו מצופה כל המאגר מלא. חזור על כל ליין, דגירה התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
  4. האחות המאגר קולגן-ציפוי עם פיפטה 200 μL. לטעון עוד מזרק עם 1 מ"ל HBSS ולחץ על הבוכנה לאט כדי לשטוף את כל ליין לשכת זרימה. האחות לשטוף את פיפטה μL 200 בסוף תא זרימה נגדית. חזור על פעמיים.
  5. פיפטה כ 100 µL של6 3 x 10 תאים למ"ל תא אנדותל (BOEC) פתרון צמיחה בינוני עם 10% FBS לנתיב של תא זרימה.
    הערה: הצפיפות זריעה של תאי אנדותל חורגת מקיבולת התא. זאת על מנת להבטיח כיסוי מקסימלי ערוץ; תאים שאינם מחסידי מוסרים בשלב השטיפה עוקבות.
  6. דגירה התא ב 37 ° C עבור ה 24 שינוי המדיום כל h 8-12 באמצעות סכינים סטריליים-lock מזרקים (כמו שלב 4.4). ודא כי ישנם אין בועות גלוי בסמטאות.

5. בידוד טסיות הדם של דם אנושי

  1. ב- cabinet עם מחט 30 G בטיחות ביולוגית, להוסיף 300 µL מאגר דקסטרוז חומצה-ציטראט (ציטראט trisodium 85 מ מ, 111 מ מ D-גלוקוז ו 71 מ מ חומצת לימון, pH 4.5) האגירה אוסף ללא תוסף 3 מ ל דם.
  2. לאסוף דם מלא של מתנדבים בריאים (חינם מ נגד טסיות, לא סטרואידיות תרופות אנטי דלקתיות במשך שבעה ימים) על ידי venipuncture (שלושה צינורות של 3 מ ל כל אחד), בעקבות פרוטוקול דומה לזה שפורסם על ידי ברנרדו ואח26.
  3. למחוק את הרכבת התחתית הראשונה, כמו הרס הרקמה הראשונית המשויך את venipuncture יכול לגרום הפעלה טסיות ספונטנית.
  4. בעדינות היפוך vacutainers את שלוש פעמים כדי לערבב את הדם עם נוגד קרישה.
  5. Centrifuge את vacutainers ב g x 150 למשך 15 דקות ב- 24 מעלות (טמפרטורת החדר).
  6. אט-אט להסיר פלזמה טסיות דם עשיר (supernatant) עם פיפטה בטיחות ביולוגית ארון, בזהירות להעביר אותו צינור חרוטי 15-mL. העברת נפח טסיות דם עשיר האגירה כל צינור חרוטי בודד כדי להימנע הצלב פוטנציאליים-הפעלה.
    הערה: טסיות בידוד יש לבצעו בבטיחות ביולוגי בארון כדי למנוע זיהום חיידקי טסית דם מלאכותי פוטנציאליים ו/או הפעלת אנדותל.
  7. Centrifuge צינורות חרוט על 900 גרם x 10 דקות ב- 24 מעלות (טמפרטורת החדר) הצניפה טסיות הדם.
  8. פיפטה וזורקים את תגובת שיקוע של טסית דם עלוב.
  9. לשטוף את צניפה בזהירות עם 1 מ"ל של מאגר (CGS) ציטראט-גלוקוז-נתרן (13 מ מ סודיום ציטרט, 30 מ מ D-גלוקוז ו 120 מ"מ נתרן כלורי, pH 7.0).
    הערה: טסיות הדם יופיע דמוי אניץ-תצורות המאגר סג ש נוסף, הוא בגדר בעדינות resuspended. בדגימות שזוהמו על ידי הפעלת טסיות, טסיות הדם לא בקלות resuspend והם יופיעו הגושיים.
  10. ברגע מלא resuspended, centrifuge את הדגימות-900 גרם x 10 דקות ב- 24 מעלות (טמפרטורת החדר).
  11. להסיר את המאגר שטיפת הרמטכ ל, resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של המאגר של Tyrode (כלוריד הנתרן 138 מ"מ, 5.5 מ מ D-גלוקוז, 12 מ מ סודיום ביקרבונט, 2.9 מ"מ אשלגן כלורי, 0.36 מ מ dibasic סודיום פוספט, pH 7.4). להבטיח מלאה resuspension של טסיות הדם, אם מצבורים שנצפו, למחוק את הדגימה.
  12. להוסיף 1.5 µL מ- 20 מ מ DiOC6 מניות פתרון (התמוססות 57.25 מ ג ב- 5 מ של מתנול) כל שפופרת חרוט 3 מ"ל של טסיות שטף עבור ריכוז סופי של 1 מיקרומטר.
    הערה: DIOC6 הוא צבע ירוק מיטוכונדריאלי פלורסנט השתמשו בניסוי זה על תווית טסיות.
  13. Aliquot 1 מ"ל של הפתרון טסיות שטף שלושה צינורות microcentrifuge 1.5-mL.
    הערה: טסיות אמצעי האחסון הנדרש עבור ניסוי זה מחושב בהתבסס על הגודל של החדר זרימה, הלחץ ההטיה הרצויה אורך הניסוי (שלב 6.5). ניתן להתאים פרוטוקול זה כמו תנאים לשנות כדי לוודא שיש מספיק נפח זרימת נוזלים.
  14. השתמש שטף טסיות הדם בתוך שעתיים של בידוד.

6. זרימה מכשירי הרכבה

  1. צרף פיסת 70 ס"מ סטרילי סיליקון אבובים (קוטר פנימי של 1.6 מ מ) connecter סכינים סטריליים המרפק זכר בקצה אחד, מתאם נעל זכוכית הנשי בצדו האחר.
  2. םאתמה תא הנשי סכינים סטריליים נעילה מחובר הצנרת כדי מזרק 20 מ
  3. חזור על שלבים 6.1 ו- 6.2 פעמיים כדי להפיק שלושה חיבורים מזרק-צינורות זהים.
  4. השתמש מזרק משאבה כדי ליצור זרימה. קלט את ההגדרות הבאות לתוך למשאבה המזרק: קוטר פנים של קצב מזרק וזרימה.
    הערה: מזרק 20-mL החינמי של קוטר פנים 19.55 מ מ. קצב הזרימה מחושב בהתבסס על ההטיה הרצויה קצב/גזירה ושל ממדי תא זרימה. עבור תא זרימה המשמש במחקר הנוכחי, להשגת רמות דינ/cm 12 (נצפתה ב נמוך ורידי הטיה), נדרש קצב זרימה של µL 9.37/min. בגלל ראיה נוספת הקושרת שינויים היסטוניים פקקת ורידים, נבחרה הטיה ורידית בינונית של רמות דינ/cm 4.452 . זה גם מבוסס על ההנחה כי המאגר יש צמיגות דומה של מים. קצב הזרימה שווה אז ל- 41.7 משוואות µL לדקה המשמש לחישוב שקצב הזרימה עבור מידות קאמרית זרימה שונים ניתן למצוא ב:
    1. הגדר את המשאבה לסגת נוזל באמצעות האפשרות לחצן על המשאבה מזרק.
  5. עומס השלושה מזרקים המחוברים לצנרת על המשאבה מזרק ולאבטח בחוזקה סוגריים מרובעים סביב מזרקים בוכנות.
  6. לצרף של המרפק זכר סכינים סטריליים בשני הקצוות של פיסת 20 ס מ שני צינורות סיליקון סטרילי.
  7. להתחבר אחד המרפק סכינים סטריליים מחט אל תדאגי קהות.
  8. חזור על פעמיים, יצירת שלוש מערכות צריכת זהה עבור שלושה מסלולים לשכת זרימה.
    הערה: צינורות סיליקון ואת Luers ניתן לכבס עם מלבין 10% ואחריו מים מזוקקים לפני שימוש חוזר. לא מומלץ לעשות שימוש חוזר הצ'יימברס זרימה.

7. מיקרוסקופ הגדרות

  1. השתמש במיקרוסקופ דיסק ספינינג המצויד שלב אוטומטית לחלוטין. מבצע תאורה עם סירת לייזר המספק 405, 458, 491, 543, וקווים 633 ננומטר לייזר. ללכוד את כל התמונות עם יעד X 20. להתאים את כל הפרמטרים עם התוכנה ניתוח (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. בחר את ההגדרות ערוץ (מסנן פליטה: 520/35), עם עירור-491 nm, עבור רכישת. הגדר את האלקטרון הכפלת תשלום מצמידים מכשיר הכפלת אלקטרון רווח של 150, עם זמן חשיפה של 200 ms, כדי להשיג את טווח הנתונים דינמי מלא.
    הערה: טסיות מלווים בלוחיות פלורסנט צבע ירוק, DiOC6, עם אורך גל maxima (עירור, 482 ננומטר; פליטה, 504 ננומטר).
  3. התאם את עוצמת הלייזר 491 nm ל-20%.
  4. מארק למרכז של כל שלושת הנתיבים ובחר μm 1 עבור טווח z ו- 0.5 μm עבור גודל צעד. בחר מספר נקודות זמן (קרי, משך) ואת פרק הזמן בין תמונות (קרי, מרווח) כדי ללכוד תמונה כל 10 s; בחר "60 פעם נקודות" לכל שקופית. הגדר המיקרוסקופ לכידת תמונות מתוך שלושה מסלולים ולשמור אותם לתיקיה ייעודית הניסוי.
    הערה: בגלל תא זרימה יש 3 נתיבים, יהיה צורך להחליף בין שלושה תפקידים כדי ללכוד התמונות המיקרוסקופ.

8. VWF-טסיות מחרוזת היווצרות

  1. להסיר את המדיום תרבות מן החדר זרימה (משלב 4) באותה שיטה כמו שלב 4.4.
  2. להוסיף 100 µL של או היסטמין (25 מיקרומטר), ובחום (100 ננומטר), אה, HK או HR (כל-µg 25/mL) מדולל ללא סרום בינוני (כמו שלב 1.4) כדי לעורר את טפט BOEC למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, אמביינט O2/CO2.
    הערה: אמנם לא הכרחי לשחרור VWF, ביצוע לגירוי הזה ב 37 ° C ישפר VWF אקסוציטוזה27.
  3. ודא שאחד השלושה מסלולים נפרדים של התא זרימה להישאר ללא טיפול כפקד ניסיוני של.
  4. להסיר את המדיום באמצעות מזרק 1 מ"ל ולהחליף אותו עם µL 100-200 של PBS לשטוף את secretagogues ממני טפט אנדותל.
  5. הר תא זרימה על גבי דוכן שקופיות באמצעות תפסים כדי לאבטח את החדר במקום.
  6. לצרף במחבר זמינה סכינים סטריליים זכר בקצה של הצנרת 70 ס"מ (מחוברים המזרק) המאגר של תא זרימה. חזור על שני האחרים זרימת קאמרית המסלולים.
  7. התחל את משאבת מזרק כדי להסיר בכביסה PBS. פיפטה נוספים PBS לתוך המאגר קאמרית זרימה נגדית על מנת להבטיח כי המסלולים לא להתייבש.
  8. להתבונן מערכת הזרימה זרימה שווה על פני כל שלושת הנתיבים ולאחר מכן בעצור משאבת מזרק.
  9. בחר אזור כדי ללכוד התמונות בבערך באמצע כל ליין, בערך באותו אזור בין ניסויים.
    הערה: יכול להיות עיוור האדם הפועלים המיקרוסקופ לתנאים ניסיוני. שלב זה מבטיח כי המיקרוסקופ ממוקד לפני טסיות זרימת (עיין עד שלב 7).
  10. לצרף מצמד סכינים סטריליים הנשי מזרק 5 מ ל ולאחר מכן למחבר סכינים סטריליים זכר חינם (שלב 6.8) ויציפו את המחט קהות בצינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל את הפתרון טסיות שטף (שלב 5.13). לאט לאט לצייר את הפתרון טסית דם דרך הצנרת כדי להבטיח אין בועות אוויר בתוך המערכת.
  11. הסר את המזרק מ ל וחבר סכינים סטריליים זכר את המאגר פתוח לשכת זרימה. חזור על שלושה מסלולים.
  12. הפעל מחדש את משאבת מזרק, ללכוד תמונות במהלך הזרימה טסיות תוך שימוש בהגדרות מיקרוסקופ והפרוטוקול משלב 7 10 דקות בחושך.
  13. לאחר 10 דקות, נתק את סכינים סטריליים לאורך צינור צריכת על המאגר קאמרית זרימה ולמלא המאגר PBS כדי לשמור על זרימה מעל טפט אנדותל.

9. VWF-טסיות מחרוזת כמת

הערה: זרימה רצופה של PBS נדרש כדי לשמור על התארכות מחרוזת VWF-טסיות לניתוח תמונה. הפסקת זרימת יביא VWF הופך הכדוריים, יפגום VWF-טסיות מחרוזת כמת. זה חיוני כדי למעלה כל המאגר עם PBS במהלך לכידת התמונה. HBSS יכול להחליף PBS אם התא כיווץ או ניתוק הוא ציין במהלך שלב זה.

  1. החל במסלול הראשון, לכידת תמונות 10 לכל שקופית ללא חפיפה משתמשים בעדשה המטרה X 20 סביב התיכון של השקופית. חזור על הפעולה עבור כל ליין.
    הערה: יש להימנע את האזורים המקיפים את המאגרים בשל הלחץ סוער הטיה.
  2. באמצעות תוכנת עיבוד תמונה, כוונן את הבהירות על-ידי לחיצה על "דמות," "התאם" ו "בהירות/ניגוד." גרור את פס הגלילה עד מודבקת טסיות הדם ניתן לצפות היטב על כימות.
  3. שיא מחרוזת VWF-טסיות כאשר שלושה או יותר טסיות מיושר מובחנות בתמונה. לספור בכל החוטים VWF-טסיות בתמונה. חזור עבור כל 10 תמונות, ממוצע לניסוי.
    הערה: יכול להיות עיוור את האדם שמבצע כימות לתנאים ניסיוני. זה לא הכרחי כתם משותפת עבור VWF, כמו זה אושר על ידי מחקרים עצמאיים8,28,29.
  4. חזור על הניסוי מינימום של שלוש פעמים כדי להעריך את כל secretagogue.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישירות, כדי להעריך את ההשפעה של שינויים היסטוניים על שחרור תאי אנדותל VWF אנחנו חשופים BOECs confluent בינונית ללא סרום המכיל PMA (בקרה חיובית), אה, בית של HK כבר שעתיים. הראינו כי HK המושרה עלייה 2-fold VWF חלבון (VWF:Ag) בהמדיום של תאי אנדותל שטופלו (איור 1). מעניין, כאשר BOECs היו מגורה עם אה ו- HR, שם פחות VWF:Ag זוהה המדיום מאשר במצב ללא טיפול. אנחנו שיערו כי בגלל שינויים היסטוניים באפשרותך לאגוד ישירות ל- VWF30, הם עלולים באופן ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד הרלוונטיות פיזיולוגיים של VWF-טסיות מיתרים נשאר שנוי במחלוקת עקב פירוק מהיר שלהם בנוכחות פרוטאז VWF ביקוע ADAMTS13, הם לשמש מודל לכימות במבחנה של טסיות הגיוס באמצעות VWF לאתר- אשר כגון שעלולים להיווצר רכוש מקומי העלאות היסטון רמות5. יתר על כן, בפתולוגיות חסר פעילות כל כך ADAMTS13 כמו קדחת היווצרות קרישי דם (טרומבוציטופניה) - או ב- microenvironments דלקתיות - איפה ADAMTS13 פעילות עכבות-VWF-טסיות מחרוזות יכול להיות שנצפו ויוו32 ו אולי לתרום טסיות דם ext...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אליסון Michels הוא הנמען של פרדריק בנטינג ו צ'ארלס הטוב ביותר בקנדה לתואר שני את המלגה מ קנדי מוסדות של הבריאות מחקר (CIHR). לורה ל' Swystun הוא הנמען מלגת CIHR. דוד Lillicrap הוא מקבל כיסא מחקר קנדה ב Hemostasis מולקולרית. מחקר זה מומן בחלקו על ידי CIHR הפעלה גרנט (פ'-97849).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
היסטונים לא מופרדים של עגל-תימוס (UH)וורת'ינגטון ביוכימיהHLYמשוחזר במצע מופחת סרום (5 מ"ג/מ"ל)
היסטונים עשירים בליזין עגל-תימוס (HK)סיגמא-אולדריץ'H5505משוחזר במצע מופחת סרום (5 מ"ג/מ"ל)
היסטונים עשירים בארגינין עגל-תימוס (HR)Sigma-AldrichH4830משוחזר במצע מופחת סרום (5 מ"ג/מ"ל)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP8139משוחזר ב-DMSO (20 מ"מ)
היסטמיןסיגמא-אולדריץ'H7125-1Gמשוחזר במים (50 מ"ג/מ"ל)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)InvitrogenD273משוחזר במתנול (20 מ"מ)ארנב
אנטי-VWF ציפוי נוגדןDAKOA0082עבור VWF ELISA
נוגדן לזיהוי ארנב נגד VWF, HRP מצומדDAKOP0026עבור VWF ELISA ובדיקת קשירה של היסטון-VWF
Nunc MaxiSorp שטוח תחתון 96 בארות מיקרו-פלטותeBioscience44-2404-21לבדיקת קשירת היסטון-VWF
Immulon 4 HBX מיקרוטיטר תחתון שטוח 96 בארות צלחותThermo Scientific3855עבור VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN/Aקומפלקס גורם פון ווילברנד אנושי שמקורו בפלזמה / פקטור VIII
התייחסות נורמלית פלזמהדיוק ביולוגיקהCCNRP-05עבור VWF ELISA עקומה סטנדרטית
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) ריאגנטSigma-AldrichP8287מוצר שווה ערך זמין דרך ThermoFisher Scientific (מספר קטלוגי: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162לתרבית וראשונית זריעה של
תמיסת המלח המאוזנת של BOEC Hank (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
קולגן זנב עכברוש סוג 1קורנינג354236
Gibco Opti-MEM I מדיה מופחתת סרוםThermoFisher Scientific31985070לגירוי תאי אנדותל
METAMORPH מיקרוסקופיה אוטומציה וניתוח תמונה תוכנהמולקולרייםN/A
צינורות איסוף דם BD Vacutainer, ללא תוסףBD Biosciences366703
µ-Slide III 0.1 (תאי זרימה)Ibidiמוצר זה הופסק. אנו מציעים להשתמש ב-µ-Slide VI 0.1 (#80661) או 0.4 (# 80601) ולחשב מחדש את קצב הזרימה ונפח הטסיות הדרושים לשמירה על מתח גזירה של 4.45 דין/סמ"ר
צינורות סיליקון 1.6 מ"מ ID: 5 מ', מעוקרIbidi10842
Luer Lock Connector נקבה: פוליפרופילן טבעי, מעוקרIbidi10825
Elbow Luer Connector זכר: פוליפרופילן לבן, מעוקרIbidi10802
מחט קהה 18GBiosciences305180
מזרקים 20 מ"לBD Biosciences302830
משאבת מזרקEra Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum WaveFX- 4X1 מיקרוסקופ דיסק מסתובבQuorum TechnologiesN/A
מכשירים BD New תוכנה לעיבוד תמונה ImageJ N/A

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473(2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384(2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VWFVWF

מאמרים קשורים