אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
במאמר זה
סיכום
תקציר
הקביעה של תהליך קיפול חלבונים מרצף חומצות אמיניות שלהם למבנה תלת-ממד מקורי שלהם היא בעיה חשוב בביולוגיה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הפעלת מתיחה והרפיה של מולקולות חלבון יחיד, אשר נותן עדות ישירה של התגלגלות, refolding מאפיינים ספציפיים. מבוסס AFM מולקולה בודדת כוח-ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS) מספק אמצעים למדוד באופן עקבי הייצורים החיים אנרגיה גבוהה בחלבונים אשר אינן אפשריות במדידות (ביוכימית) בצובר מסורתי. למרות מספר רב של מאמרים פורסמו כדי להציג את העקרונות של AFM-SMFS, זה לא קל לערוך ניסויים SMFS בשל העדר פרוטוקול ומגובה מלאה. במחקר זה, אנו להמחיש בקצרה את העקרונות של AFM, פירוט בהרחבה את הפרוטוקולים, נהלים, ניתוח נתונים כקו מנחה כדי להשיג תוצאות טובות מן הניסויים SMFS. נדגים נציג SMFS תוצאות מדידות התגלגלות מכני חלבון יחיד, אנו מספקים פתרון בעיות אסטרטגיות עבור כמה נפוץ נתקל בבעיות.
מבוא
ההתקדמות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת (SMFS) על ידי AFM אפשרו במחרוזות מכני, אפיון מדויק של מולקולות חלבון יחיד. אפיון זה הפיק הרומן תובנות על חלבון מכניקה1,2, קיפול3, אינטראקציות חלבון-ליגנד4, אינטראקציות חלבון-חלבון5, החלבון ומתוכננים מבוססי חלבונים חומרים6,7,8. SMFS שימושית במיוחד עבור לימוד חלבון התגלגלות, כמו מתיחה על ידי AFM מאפשרת את הקשר הכימי והפיזי בתוך מולקולת חלבון להרחיב בהדרגה על פי שלהם נוקשות, אשר נותן לעלות באורך מתאר גדל ללא הר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חלבון הכנה
- שכפול ה-DNA.
- לסנתז רצף ה-DNA של עניין, לדוגמה, רצף ה-DNA של10ג ני10, או לבודד באמצעות PCR של האורגניזם המארח באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית סטנדרטי11. לאגף את הגן עניין באתרים מגבלת במהלך סינתזה או על-ידי הצבת אתרים בסוף 5'-תחל PCR כדי שיתאימו: מודול pEMI91 פלסמיד (Addgene #74888)12.
- בנפרד לעכל את פלסמיד pEMI9112 והן את רצף ה-DNA של עניין עם זוג באתרים מגבלת כך הרצף של עניין יותקף על ידי טנדם ש-i91 חוזר (ראה איור 1). בצע את הפרוטוקול הסטנדרטי עבור האתרים ההגבלה.
- לטהר א....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות נציג של פרוטוקול זה מוצגים באיור2. שני לוחות הצג נציג חיל-סיומת עקומות של חלבונים. העליון מציג תוצאות polyprotein I91, בעוד החלק התחתון מציג את החלבון I91 איגוף חלבון-של-עניין, מולקולת10ג ני. הקלטות אלו הראו את כוחם אופייני של I91 (200 pN) מתאר תוספת אורך (28 ננומטר) אשר מציין יישור וכיול של AFM היה מוצלח. עקומות אלה הרחבת כוח ניתן לנתח אז תולעת רשתות (קו מקווקו) אשר עוזרים לקבוע את האורך תלוי-כוח של המולקולה, לקבוע את המספר של שאריות פרש. ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שלב קריטי בפרוטוקול הוא השימוש polyprotein, שמתואר בשלב 1.1.2, אשר משמש פקד חיובי כדי "טביעות אצבע" אירועים מולקולה בודדת. באופן כללי, יש חייב להיות התגלגלות אירועים של החלבונים polyprotein (עבור I91, המשמעות היא כוח התגלגלות כ-200 pN, מתאר אורך קבועה של 28 ננומטר) למסקנה חד משמעית כי החלבון עניין כבר פרש. לדוגמה, כאשר החלבון עניין משני צדדיה שלושה תחומים I91 מכל צדדיו, אז חייב להיות לפחות ארבעה אירועים I91 להסיק כי הוא בהחלט אירוע יחיד מולקולה. אם לא פקד חיובית דרך של polyprotein, או אמצעים אחרים, אז כל הנתונים הם עלולי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מענקים MCB-1244297 MCB-1517245 כדי PEM.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דיסקי דגימה של AFM, קוטר 15 מ"מ | טד פלה, בע"מ. | 16218 | משמש כבסיס למצע זכוכית |
| כיסויי זכוכית עגולים, קוטר 15 מ"מ מס' 1 עבה | טד פלה, בע"מ. | 26024 | משמשים כמצע זכוכית ובסיס לציפוי זהב |
| טבליות דבק | טד פלה, בע"מ. | 16079 | הדבק על דיסקי דגימת AFM כדי לספק פנים דביקות לחיבור כיסויי זכוכית |
| STD מכלול ראש Multimode | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM |
| ראש מחזיק בדיקה מזכוכית | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | לסריקה נוזלית עם MultiMode AFM. |
| Microlever AFM חוקרת את | Bruker Nano Inc. | שלוחת סיליקון ניטריד MLCT עם קצות סיליקון ניטריד, אידיאלי למצבי הדמיית מגע | |
| בדיקות AFM עם קצות מצופים | Au Bruker Nano Inc. | OBL-10 | שלוחים למשיכת חלבונים עם כוח נפרש נמוך |
| כרטיס רכישת נתונים רב-תכליתי (DAQ), 16 סיביות, 1 MS/s (רב ערוצי), 1.25 MS/s (ערוץ אחד), 32 כניסות אנלוגיות | National Instruments | PCI-6259 | רכישת נתונים עבור אותות מראש AFM ומפעילי Piezo |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | מפעיל Piezo לשליטה במיקום המצע וביצוע מדידות משיכה |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator לשליטה במיקום המצע וסריקה על משטח המצע |
מקורות
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. Th....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
