מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

קוטר קטן התנגדות העורקים, דק פרופריה אלסטית פנימית (אישור IEL) מפריד בין אנדותל (EC) ותאי שריר חלק (SMC). התאים יכולים פרויקט דרך חורים אלסטי מטריצה זו ולעשות חיבורים ישירים cytoplasmic via gap junction ערוצים^1,2. מבנה ייחודי זה נקרא צומת myoendothelial (MEJ). MEJ הוא מלון קטן (כ 0.5 מיקרומטר x 0.5 מיקרומטר, בהתאם המיטה כלי הדם), הקרנה הסלולר מורכב ברובו של תאי אנדותל, אבל עשוי לנבוע שריר חלק גם^3,4. מספר חוקרים הוכיחו את המורכבות העצומה של רשתות שמתרחשים באופן סלקטיבי MEJ, טיוח זה הוא מקום חשוב במיוחד להקלה על מערכת אזעקה דו-כיוונית בין אנדותל שריר חלק^{5 איתות ,6,7,8,9,10}.

עם זאת, הקרע מכניסטית של איתות המסלולים-MEJ קשה בעורק ללא פגע. מכיוון MEJ תחזית הסלולר, אין אפשרות כרגע לבודד של ויוו MEJ מהקיר כלי הדם. מסיבה זו, פותח מודל VCCC¹ . חשוב לציין, VCCC משכפל מורפולוגיה אנדותל פיזיולוגיים¹¹ וקיטוב של איתות בין הפסגה MEJ חלקים לתא¹². זה היה מודל ייחודי זה, פוריה התגלית המוגלובין אלפא הוא בתא אנדותל, מקוטב עד MEJ... זאת בניגוד כמקובל בתרבית תאי אנדותל המבטאים לא אלפא המוגלובין¹³. עבור חוקרים המעוניינים אנדותל microvascular, ייתכן מתאים יותר להשתמש תאי אנדותל יש כבר תרבותי ב VCCC, במיוחד אם הכוונה היא לנתח איתות המסלולים המתרחשת קוטר קטן התנגדות העורקים.

באמצעות הוספה פלסטיק חסון המכיל מסנן עם נקבוביות בקוטר קטן (0.4 מיקרומטר בקוטר) תרבות משותפת לשני סוגי תאים נפרדים מונעת את התאים נודדים בין שכבות. התוצאה היא במרחק 10 מיקרומטר בין התאים, אשר באופן משמעותי יותר מאשר בתוך vivo, אבל עדיין משכפל רבים ויוו המאפיינים של MEJs, כולל חלבון לוקליזציה ושליח השני איתות^{1 , 14}. בנוסף, VCCC מאפשרת מיקוד של התא איתות באמצעות התוספת של אגוניסט אנטגוניסט ל תא הסלולר ספציפי או ייחודיים לסוג. לדוגמה, טעינה ל- EC עם BAPTA-בבוקר עד chelate סידן, מגרה את SMC עם phenylephrine¹⁴. בניגוד תיאורים אחרים של תרבות שיתוף מודלים^{15,16,17,18,19,20,21}, זה מספק הוראות על בידוד שברים נפרדים עבור ה-mRNA, חלבון, כולל השבר MEJ נפרדות בתוך הנקבוביות מסנן. התוספת של טכניקה זו VCCC מאפשר חקירה ספציפיות של שינויים ב- mRNA לוקליזציה או שעתוק²², חלבון זרחון^12,23, חלבון פעילות¹². מאמר זה יתאר ציפוי של הנציבות האירופית על גבי המסנן ואת SMC בתחתית, למרות שפעולה זו אפשרית על תרבות של סוגי תאים שני הייצורים החיים שונים^11,18,24.

1. ציפוי תאים עבור VCCC

1. תרבות גדול 225 ס מ ² בקבוקונים של EC ו- SMC בתנאים סטריליים ב 37 מעלות צלזיוס, עד 70-90% confluent. תבטיח EC יותר מאשר SMC שימוש; אם משתמש ראשי EC אנושי ו- SMC, בדרך כלל 3 מבחנות גדולות של EC ל 1 בקבוק גדול של SMC.
   1. להשתמש בתאים ראשי-מעברים נמוך והם אינם משתמשים מעבר פסקה 10. בחירת המדיה תרבות המבוססת על התאים להיות שותף בתרבית. עבור ראשי האדם עורקים EC, להשתמש במדיה הבזליים EC EBM-2 עם גורמי גדילה EGM2 MV. עבור ראשי SMC כלילית אנושי, להשתמש במדיה הבזליים SmBM SMC עם גורמי גדילה SmGM-2. לפני השימוש עם תאים בתרבית, להוסיף גורמי גדילה למדיה.
2. הבנייה של 1 יום VCCC: לרסס צלחות פטרי גדולה (150 מ"מ) ומכסים עם חומר חיטוי (למשל, Cavicide), לנגב עם מגבת נייר או מגבונים ללא מוך. ואז לרסס את צלחות פטרי עם 70% אתנול (EtOH), למקם אותם בשכונה מהאוויר היבש.
3. פתח את הצלחת של הוספת מסנן (ראה את הטבלה של חומרים) תחת תנאים סטריליים ולאחר מעיל SMC בצד (בצד התחתון של מסנן) תותב עם fibronectin פתרון. שמירה על הוספה בצלחת 6-ובכן שסופקו, pipet הפתרון fibronectin דרך הצד חריצים בתחתית הלוח, לוודא כי בתחתית חצי של המסנן זה מכוסה (לא יותר מ- 1 מ"ל).
4. לאחר 30 דקות של טיפול עם פתרון fibronectin בטמפרטורת החדר בשכונה התרבות תאים, קח מוסיף מהצלחת, ואקום כל פתרון עודף, ועל ' היפוך ', הצבת לתוך החלק התחתון מחצית הפטרי נקי. להפריש. להיות בטוח שלא להפריע את הקרום הוספה של מסנן כאשר suctioning פתרון עודף; זה יכול להימנע על ידי הטיית הלוח ובעדינות שואב אבק הפתרון מקצה תותב.
5. הבקבוק Trypsinize 225 ס מ ² של SMC עם 3 מ"ל של פתרון X טריפסין-EDTA 2 ומחוממת מראש, וברגע התאים יש כבד ירד לצלחת, מוסיפים 9 מ ל מדיה SMC לנטרל את טריפסין (3:1, מדיה: טריפסין). להעביר צינור חרוטי, לערבב היטב, pipet 10 µL אל hemocytometer כדי לקבוע את המספר.
   1. ספירת מספר התאים ב- 5 x 5 תיבות (קרי, 18), תכפיל את זה ב 10,000 כדי להכניס את מספר התאים 1 מ"ל (180,000). אז תכפיל ב 12 מ ל (סה כ נפח תא השעיה, SMC 2.16 מיליון). להבטיח שאין מספיק SMC כדי לוחית רישוי מספר וולס הרצוי.
      הערה: לדוגמה, 1, ובכן צריך 75,000 SMC ויהיה ובכך בארות 18 SMC סה כ 1.35 מיליון. לחלק 1.35 מיליון תאים הדרושים על ידי תאים 180,000 לכל 1 מ"ל, התוצאה היא 7.5 mL של התליה תא זה יהיה צורך עבור ציפוי. ואז לחשב את עוצמת הקול הסופי הדרוש (18 בארות x 750 µL = 13.5 מ ל). לכן, לקחת 7.5 mL תא השעיה, להביא את אמצעי האחסון עד 13.5 מ עם מראש ומחוממת SMC מדיה, לערבב היטב.
6. µL 750 צלחת של התליה תא המכיל כ 75,000 SMC אל הצד התחתון של כל מסנן, נזהר לא לשפוך כל אחד את הפתרון מדיה, תא. למקם את המכסה למעלה ולהעביר בזהירות על צלחת פטרי עם התוספות לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: צפיפות תא האופטימלי עבור סוגי תאים אחרים יהיה צורך להיקבע מדעית.
7. ביום 2, למלא נקי. ובכן 6 מנות עם 2 מ"ל של מדיה SMC טריים, ומחוממת מראש. הסר את הצלחות של החממה. . קח את המכסים את אחד בכל פעם, להסיר את התקשורת על ידי שאיבה ולאחר מכן למקם את המנה 6-ובכן עם SMC מדיה.
8. מעיל הצד הנגדי של המסנן (EC צד) עם 1 מ"ל של פתרון ג'לטין שור 0.5% במשך לפחות 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
9. Trypsinize את flask(s) ² 225 ס מ של הנציבות האירופית עם 3 מ"ל של 2 מראש ומחוממת X טריפסין-EDTA (10 x מעורבבת עם Dulbecco עקר ' s PBS) פתרון, עם הקשה עדין + בקבוקי שתייה צידניות כדי להרים את התאים מהצלחת.
   הערה: יתכן צורך למקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 דקות.
   1. פעם התאים יש כבד ירד לצלחת, מוסיפים 9 מ ל מדיה EC לנטרל את טריפסין (3:1). להעביר צינור חרוטי, בריכה יחד, לערבב היטב, pipet 10 µL אל hemocytometer כדי לקבוע את מספר הטלפון הנייד.
      1. ספירת מספר התאים ב- 5 x 5 תיבות (קרי, 60), תכפיל את זה ב 10,000 כדי להכניס את מספר התאים 1 מ"ל (600,000). אז תכפיל ב 12 מ ל (סה כ נפח תא השעיה, EC 7.2 מיליון). להבטיח שאין מספיק EC על לוחית רישוי מספר וולס הרצוי.
         הערה: EC כ 360,000 נדרשים לכל טוב. לדוגמה, בארות 18 לדרוש לכלכלת 6.48 מיליון לחלק 6.48 מיליון תאים שתתבקש על-ידי EC 600,000 לכל 1 מ"ל, התוצאה היא 10.8 מ של התליה תא זה יהיה צורך עבור ציפוי. ואז לחשב את עוצמת הקול הסופי הדרוש (בארות 18 x 1 מ"ל = 18 מ"ל). לכן, קח 10.8 מ של התא השעיה, להביא את אמצעי האחסון עד 18 מ עם מראש חימם EC מדיה, בעדינות resuspend.
10. צלחת 1 מ"ל של 360,000 EC על הצד העליון של כל מסנן הוספה. תן את התאים דגירה ללא הפרעה ב 37 ° C ה 24 בינוני החלף ביום הרביעי. קציר ביום 5.

2. קציר שברים של VCCC

1. לבצע את הבידוד בחדר 4 ° C ולשמור את כל הכלים על קרח
2. לזכור את המספר של הפרט מוסיף להיות מבודדת ולהוסיף פירוק מאגר שפופרת 50 מ ל הנקרא MEJ (של המסננים מבודד). ואז תווית שתי מנות 10 מ מ; אחד EC ואחד עבור SMC.
3. התאם את עוצמת הקול של פירוק מאגר תלוי כמה מרוכז lysate צריך להיות; 15 מוסיף, µL 500 פירוק מאגר בים MEJ, µL 250 לכל צלחת פטרי מומלץ.
4. עבודה עם לוח 6-ובכן אחד של מוסיף בכל פעם. היניקה את המדיום הוד התרבות תאים ולאחר מכן תחבורה אל חדר קר על קרח
   הערה: ההוראות הבאות הן עבור 1 להוסיף הבידוד.
5. Pipet 10 µL של PBS 1 x לצד SMC של הקדמי.
6. להשתמש את מרים תא לגרד את התאים בקצה אחד של הקדמי, ולהעביר את התאים מרים לצלחת פטרי SMC בעל מאגר פירוק בתוכו
7. , ברגע מרים תא נגע המאגר פירוק בצלחת, אינם מאפשרים לו לגעת במסנן הוספה עד יש כבר לגמרי מחה והוא התייבש על מגבות נייר. חזור על גירוד של המסנן SMC לפחות אחד עד שני פעמים כדי להסיר לחלוטין את שאריות תאים SMC הנותרים.
8. הופכים את הוספה מעל ואת pipet 10 µL של PBS 1 x הצד העליון/EC של המסנן ' הוספה '. חזור על שלבים 2.6 ו 2.7 עם המגרד של התא, EC הפטרי.
9. לאסוף את התאים הנותרים ואת PBS slurry מהצד EC של המסנן עם פיפטה, העברה כדי EC הפטרי עם פירוק מאגר. להיות יסודית תוך גירוד התאים את שני הצדדים של המסנן והשארת זיהום EC/SMC מינימלי של השבר MEJ.
10. השתמש בזהירות את האזמל כדי לגזור את המסנן מהמכסה הפלסטיק. עושים זאת על ידי חיתוך 70-80% מן הפלסטיק ולהשתמש מלקחיים למשוך את המסנן לגמרי מחוץ למבנה כיסוי הפלסטיק. לשים את המסנן בצינור חרוט 50 מ עם פירוק מאגר תוויות MEJ, ולוודא שזה יושב במאגר של פירוק ונותרה רטובה.
11. חזור על השלבים בידוד, בקבוצות של 6, עד כל התוספות עובדו.
12. להבטיח כי קבוצות טיפול שונה שמורים בתוך צינורות נפרדת ומנות.
13. מערבולת הצינור חרוט MEJ 50 מ בבעוצמה מלאה עבור 15 s או עד מעורבב היטב. הסר את המסננים MEJ חרוט עם מלקחיים, גורר אותם לאורך הקירות הצדדיים של הצינור והשארת את הכמות המרבית של חלבונים ושל נוזל בצינור. לאחר נקודה זו, מחק את מסנני.
14. לאחר כל המסננים הוסרה מן הצינור חרוט MEJ, לעשות סיבוב מהיר (10-15 s ב g ~ 16,000 x מהירות מקסימלית) ומפרידה למשוך כל נוזל, חלבונים לתחתית הצינור- להעביר את התוכן של הצינור MEJ והכלים EC ו- SMC פטרי לתוך צנטריפוגה נפרדים, קטן יותר, צינורות.
15. אופציונלי: Sonicate את התוכן של הצינורות MEJ/SMC/EC הגדרת 4 עבור s 10 שלושה פולסים על קרח או homogenize בעדינות ביד.
16. צנטריפוגה-מהירות מקסימלית (~ 16,000 x g) 15 דקות ב-4 ° C. Pipet החוצה את תגובת שיקוע, assay lysate לתוכן חלבון בשיטת assay bicinchoninic.

3. קציר את VCCC עבור פנים En Immunofluorescence

1. דגירה על יום 5 של VCCC, להסיר את התוספות של החממה. עובד בשכונה התרבות תאים, יניקה את התקשורת SMC מכל הבארות התחתון של הוספת מסנן, יש לשטוף פעמיים עם 1 x PBS . אני חוזר עם הצד EC.
2. שומר את הכיסויים שלם ועל בצלחת, להוסיף 4% paraformaldehyde (PFA) למשך 10-20 דקות בחדר ותא-4 מעלות צלזיוס על מטרף עדין. לשטוף את שני הצדדים של המסנן הוספה עם PBS 1 x עבור 5 דקות וחזור פעמיים.
   התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.
3. לבצע את incubations נוגדנים חסימות, ראשיות ומשניות בצלחת, המבטיח כי שני הצדדים של המסנן שמרו על הנוגדן + חסימת פתרון (9 מ ל PBS, 25 µL טריטון X100, אלבומין שור 50 מ"ג, 500 סרום רגיל µL)
4. כדי לטעון את המסנן בשקופית, לחתוך את המסנן החוצה תותב פלסטיק עם איזמל רכוב על ידית בעלת המקום בשקופית מיקרוסקופ הרכבה בינונית.

4. קציר את VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

1. דגירה על יום 5 של VCCC, להסיר את התוספות של החממה. לשאוב את התקשורת משני הצדדים של המסנן הוספה בשכונה תרבות תא ולשטוף בכל צד של המסנן פעמיים עם PBS 1 x.
2. שומר את הכיסויים שלם ועל בצלוחית 6-ובכן, להוסיף 4% PFA דגירה בין לילה בחדר ותא-4 מעלות צלזיוס על מטרף עדין.
   התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.

5. הטבעה של VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

1. לאחר סינון מוסיף תוקנו כ במשך 24 שעות ביממה ב- 4% מחברים, העברה עד 70% EtOH לפחות 24 שעות, אבל עד מספר שבועות.
2. לעבד את המסננים ארוך (לילה) לרוץ על מעבד רקמות אוטומטית. השתמש בתוכנית כדלקמן: 70% EtOH במשך 30 דקות, 85% EtOH 30 דקות, 95% EtOH 30 דקות, 100% EtOH 30 דקות, 100% EtOH 45 דקות, 100% EtOH 45 דקות, קסילן 30 דקות, קסילן 30 דקות, קסילן 45 דקות, 60 ° C שעוות פרפין 30 דקות, 60 ° C שעוות פרפין 30 דקות , 60 ° C שעוות פרפין 45 דקות
3. לאחר העיבוד, העבר המסננים שנקטפו לתחנה ההטבעה לתוך שמן פראפין, שמירה על המסנן הקלטת.
4. להסיר את המסנן הקלטת, בזהירות באמצעות מלקחיים להחזיק את זה רק בקצה. עם מספריים, לחצי את המסנן, ויוצרים שתי חצי עגול בצורת חצאים. זיון של 2 חצאים בחלק צלחת קר של תחנת ההטבעה בדיוק זמן מספיק כדי למלא את ההטמעה עובש עם שמן פראפין.
5. פעם מלא שמן פראפין, מאוד בקצרה לגעת את להטבעה קר לצלחת, ואז להטביע חצי אחד של המסנן לתוך הטבעת עובש (לחתוך בצד); פעולה זו מבטיחה כי בעת חלוקתה, אחד תנטרלו מהמרכז של המסנן כלפי הקצה .
6. במהלך הטבעה, להשתמש מלקחיים להחזיק את המסנן במקום כדי למנוע את החצאים מנפילה לתוך השני עד הפרפין מגניב מספיק להם לעמוד לבד. לעבור את להטבעה צלחת קר עד פני השטח למוצק לגמרי.
   הערה: קירור בלוקים על מגשי הקרח מסייעת למנוע מקטעים מקומט.

6. חלוקתה, מכתימה את VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

1. עבור אבני פרפין חלוקתה והחלק הרכבה: לחתוך 5 מיקרומטר מקטעים, למקם את המקטעים לתוך אמבט מים 42 ° C, ולאסוף את הסעיפים באמצעות הטעון חיובית שקופיות. ואז להשאיר ללילה שקופיות בתנור 42 ° C כדי לייבש.
2. לפני תחילת המדרגות התייבשות, לאפות את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס להמיס הפרפין ולעזור לדבוק הסעיפים VCCC לשקופית. מגניב בקצרה, ואז להחזיר נוזלים בין השקופיות באמצעות שני שינויים של קסילן, 100% EtOH, 95% EtOH, שינוי אחד של 70% EtOH, ושני שינויים של מים מזוקקים.
3. להימנע שיטות אחזור אנטיגן המערבות במיקרוגל או חימום כמו סעיפים יפלו מחוץ לשקופית.
4. בצע חסימת הרגיל לשעה בטמפרטורת החדר, ואז הדגירה לילה עם נוגדן ראשוני ב 4 ° C, ואחריו שטיפה צעדים, נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר. הר עם הרכבה מדיה, coverslip.

יש הכיסויים המסנן המשמש את VCCC קטנה, 0.4 חורים מיקרומטר. איור 1A, מבט פנים en שיבוץ מסנן VCCC, מציג את הנקבוביות שבו MEJ יכול ליצור במבחנה. התרשים מתאר את תאי השריר החלק מצופה בצד התחתון של המסנן יום אחד לפני תאי אנדותל הם מצופה בצד הנגדי (איור 1B). ברגע התאים הם מצופים, שברים EC, MEJ ו- SMC ניתן לבודד שלושה ימים לאחר מכן. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2A, איפה plasminogen activator מעכב 1 (פאי-1) מאוד מתבטאת השבר MEJ ביחס לשאר EC, אשר נתפסת גם- ויוו MEJs25. נתונים אלה מדגימים את. התועלת VCCC בשנת recapitulating לקיר כלי דם arteriolar ללא פגע.

הבא VCCC ב immunofluorescence ואלקטרון הוא הפגין. VCCC נותר שלם וקבוע עם מחברים עבור immunofluorescence רוחבי. איור 3A מראה את שריר חלק מסוים אלפא-1 קולטנים אדרנרגיים הקולטן אנדותל bradykinin ספציפיים. Phalloidin מכתים של F-אקטין מציגה הגשרים אקטין MEJ (חץ לבן) בין שני התאים, אשר משכפל את הביטוי ראה של עורק תקין26. ב- 3B איור, חתך של VCCC כפי להצגה על-ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים הוא הפגין, אשר הוא שניתנו ב 3D באיור 3C. תצוגות אלה של VCCC להפגין את היכולת במיוחד בתרגום חלבונים, רצפטורים, ultrastructure במבחנה MEJs.

איור 1: ציפוי של התרבות שיתוף תא כלי הדם (VCCC). (א) פנים En אור micrograph של הנקבוביות במסנן הוספה. חצים שחורים מציינות חורים נפרדים. תיאור סכמטי של ציפוי של VCCC (B). יום 1 מציגה היפוך של הוספה של מסנן, ציפוי SMC בתחתית. ביום 2, EC הם מצופה בצד השני של המסנן, VCCC נשאר קונפורמציה זה לתוך צלחת 6-ובכן עד הקציר. החצים הלבנים מציינים את הצד של מסנן שבו התאים הם מצופים, יגדל. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: העשרה חלבונית ב MEJ. (א) תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים חיסונית-שידור של העכבר עורק עם ביטוי של אלפא גלובין-MEJ (חרוזי זהב אשר מופיעים כנקודות שחורות). (B) תספיג מציג plasminogen activator מעכב 1 (פאי-1) ביטוי מועשר בתמציות השבר MEJ לעומת שברים EC או SMC. EC פלסטיק מציין EC גדל על צלחת פלסטיק, אשר לא עושים בצורת MEJ. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: immunofluorescence רוחבי ואלקטרון בסעיפים רוחבי של VCCC. Staining (A) עבור שריר חלק, אנדותל חלבונים ספציפיים. צביעת F-אקטין היא בכל סוגי תאים והן את במבחנה MEJ (חץ לבן). דוגמה של מיקרוסקופ אלקטרונים המשמשות ללימוד ultrastructure של ה במבחנה MEJs ב 2D (B) ותלת מימד (C). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (א); 2.5 מיקרומטר (B); אנכי כ 2.5 מיקרומטר ו- 0.5 מיקרומטר אופקי (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

המחברים אין לחשוף.