הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

7.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55992

⸱

8 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

במאמר זה

סיכום

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים מתואר, המאפשר ניתוח איתות המסלולים אנדותל, שריר חלק, או בין אנדותל שריר חלק (צומת myoendothelial). יישום סלקטיבי של אגוניסטים או בידוד חלבון, מיקרוסקופ אלקטרונים או immunofluorescence יכול להיות מנוצל בעזרת המודל התרבות תאים.

תקציר

צומת myoendothelial (MEJ), microdomain איתות ייחודי בקוטר קטן התנגדות העורקים, תערוכות לוקליזציה של חלבונים ספציפיים ותהליכים איתות בהן שולטת הטון כלי הדם ולחץ דם. כפי שזה הקרנה מכל אחת תא אנדותל או שריר חלק, עקב שלה קטן גודל (בממוצע, שטח של ~ 1 מיקרומטר2רשימות), על MEJ קשה ללמוד בבידוד. עם זאת, פיתחנו מודל התרבות התא הנקרא תא וסקולרית שיתוף התרבות (VCCC) המאפשר במבחנה היווצרות MEJ, תאי אנדותל קיטוב של דיסקציה של איתות חלבונים ותהליכים בדופן כלי הדם של התנגדות העורקים. VCCC ניתן להתאים בהתאם לסוגי תאים שונים, ויש שפע של יישומים. המודל מורכב משני סוגים של התא גדל על צידי מסנן עם נקבוביות מיקרומטר 0.4 שבו ה במבחנה MEJs יכול ליצור. כאן נתאר כיצד ליצור את VCCC באמצעות ציפוי של תאים ובידוד של אנדותל, MEJ, שברים השריר החלק, שבו ניתן להשתמש עבור בידוד חלבון או פעילות מבחני. יכול להיות קבוע את המסנן עם שכבות תאים שלמים, מוטבע, המחולקת למקטעים לניתוח immunofluorescent. חשוב, לרבים מהגילויים של מודל זה אושרו באמצעות התנגדות ללא פגע העורקים, דבר המלמד להתאמתו פיזיולוגיים.

מבוא

קוטר קטן התנגדות העורקים, דק פרופריה אלסטית פנימית (אישור IEL) מפריד בין אנדותל (EC) ותאי שריר חלק (SMC). התאים יכולים פרויקט דרך חורים אלסטי מטריצה זו ולעשות חיבורים ישירים cytoplasmic via gap junction ערוצים1,2. מבנה ייחודי זה נקרא צומת myoendothelial (MEJ). MEJ הוא מלון קטן (כ 0.5 מיקרומטר x 0.5 מיקרומטר, בהתאם המיטה כלי הדם), הקרנה הסלולר מורכב ברובו של תאי אנדותל, אבל עשוי לנבוע שריר חלק גם3,4. מספר חוקרים הוכיחו את המורכבות העצומה של רשתות שמתרחשים באופן סלקטיבי MEJ, טיוח זה הוא מקום חשוב במיוחד להקלה על מערכת אזעקה דו-כיוונית בין אנדותל שריר חלק5 איתות ,6,7,8,9,10.

עם זאת, הקרע מכניסטית של איתות המסלולים-MEJ קשה בעורק ללא פגע. מכיוון MEJ תחזית הסלולר, אין אפשרות כרגע לבודד של ויוו MEJ מהקיר כלי הדם. מסיבה זו, פותח מודל VCCC1 . חשוב לציין, VCCC משכפל מורפולוגיה אנדותל פיזיולוגיים11 וקיטוב של איתות בין הפסגה MEJ חלקים לתא12. זה היה מודל ייחודי זה, פוריה התגלית המוגלובין אלפא הוא בתא אנדותל, מקוטב עד MEJ... זאת בניגוד כמקובל בתרבית תאי אנדותל המבטאים לא אלפא המוגלובין13. עבור חוקרים המעוניינים אנדותל microvascular, ייתכן מתאים יותר להשתמש תאי אנדותל יש כבר תרבותי ב VCCC, במיוחד אם הכוונה היא לנתח איתות המסלולים המתרחשת קוטר קטן התנגדות העורקים.

באמצעות הוספה פלסטיק חסון המכיל מסנן עם נקבוביות בקוטר קטן (0.4 מיקרומטר בקוטר) תרבות משותפת לשני סוגי תאים נפרדים מונעת את התאים נודדים בין שכבות. התוצאה היא במרחק 10 מיקרומטר בין התאים, אשר באופן משמעותי יותר מאשר בתוך vivo, אבל עדיין משכפל רבים ויוו המאפיינים של MEJs, כולל חלבון לוקליזציה ושליח השני איתות1 , 14. בנוסף, VCCC מאפשרת מיקוד של התא איתות באמצעות התוספת של אגוניסט אנטגוניסט ל תא הסלולר ספציפי או ייחודיים לסוג. לדוגמה, טעינה ל- EC עם BAPTA-בבוקר עד chelate סידן, מגרה את SMC עם phenylephrine14. בניגוד תיאורים אחרים של תרבות שיתוף מודלים15,16,17,18,19,20,21, זה מספק הוראות על בידוד שברים נפרדים עבור ה-mRNA, חלבון, כולל השבר MEJ נפרדות בתוך הנקבוביות מסנן. התוספת של טכניקה זו VCCC מאפשר חקירה ספציפיות של שינויים ב- mRNA לוקליזציה או שעתוק22, חלבון זרחון12,23, חלבון פעילות12. מאמר זה יתאר ציפוי של הנציבות האירופית על גבי המסנן ואת SMC בתחתית, למרות שפעולה זו אפשרית על תרבות של סוגי תאים שני הייצורים החיים שונים11,18,24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ציפוי תאים עבור VCCC

  1. תרבות גדול 225 ס מ 2 בקבוקונים של EC ו- SMC בתנאים סטריליים ב 37 מעלות צלזיוס, עד 70-90% confluent. תבטיח EC יותר מאשר SMC שימוש; אם משתמש ראשי EC אנושי ו- SMC, בדרך כלל 3 מבחנות גדולות של EC ל 1 בקבוק גדול של SMC.
    1. להשתמש בתאים ראשי-מעברים נמוך והם אינם משתמשים מעבר פסקה 10. בחירת המדיה תרבות המבוססת על התאים להיות שותף בתרבית. עבור ראשי האדם עורקים EC, להשתמש במדיה הבזליים EC EBM-2 עם גורמי גדילה EGM2 MV. עבור ראשי SMC כלילית אנושי, להשתמש במדיה הבזליים SmBM SMC עם גורמי גדילה SmGM-2. לפני השימוש עם תאים בתרבית, להוסיף גורמי גדילה למדיה.
  2. הבנייה של 1 יום VCCC: לרסס צלחות פטרי גדולה (150 מ"מ) ומכסים עם חומר חיטוי (למשל, Cavicide), לנגב עם מגבת נייר או מגבונים ללא מוך. ואז לרסס את צלחות פטרי עם 70% אתנול (EtOH), למקם אותם בשכונה מהאוויר היבש.
  3. פתח את הצלחת של הוספת מסנן (ראה את הטבלה של חומרים) תחת תנאים סטריליים ולאחר מעיל SMC בצד (בצד התחתון של מסנן) תותב עם fibronectin פתרון. שמירה על הוספה בצלחת 6-ובכן שסופקו, pipet הפתרון fibronectin דרך הצד חריצים בתחתית הלוח, לוודא כי בתחתית חצי של המסנן זה מכוסה (לא יותר מ- 1 מ"ל).
  4. לאחר 30 דקות של טיפול עם פתרון fibronectin בטמפרטורת החדר בשכונה התרבות תאים, קח מוסיף מהצלחת, ואקום כל פתרון עודף, ועל ' היפוך ', הצבת לתוך החלק התחתון מחצית הפטרי נקי. להפריש. להיות בטוח שלא להפריע את הקרום הוספה של מסנן כאשר suctioning פתרון עודף; זה יכול להימנע על ידי הטיית הלוח ובעדינות שואב אבק הפתרון מקצה תותב.
  5. הבקבוק Trypsinize 225 ס מ 2 של SMC עם 3 מ"ל של פתרון X טריפסין-EDTA 2 ומחוממת מראש, וברגע התאים יש כבד ירד לצלחת, מוסיפים 9 מ ל מדיה SMC לנטרל את טריפסין (3:1, מדיה: טריפסין). להעביר צינור חרוטי, לערבב היטב, pipet 10 µL אל hemocytometer כדי לקבוע את המספר.
    1. ספירת מספר התאים ב- 5 x 5 תיבות (קרי, 18), תכפיל את זה ב 10,000 כדי להכניס את מספר התאים 1 מ"ל (180,000). אז תכפיל ב 12 מ ל (סה כ נפח תא השעיה, SMC 2.16 מיליון). להבטיח שאין מספיק SMC כדי לוחית רישוי מספר וולס הרצוי.
      הערה: לדוגמה, 1, ובכן צריך 75,000 SMC ויהיה ובכך בארות 18 SMC סה כ 1.35 מיליון. לחלק 1.35 מיליון תאים הדרושים על ידי תאים 180,000 לכל 1 מ"ל, התוצאה היא 7.5 mL של התליה תא זה יהיה צורך עבור ציפוי. ואז לחשב את עוצמת הקול הסופי הדרוש (18 בארות x 750 µL = 13.5 מ ל). לכן, לקחת 7.5 mL תא השעיה, להביא את אמצעי האחסון עד 13.5 מ עם מראש ומחוממת SMC מדיה, לערבב היטב.
  6. µL 750 צלחת של התליה תא המכיל כ 75,000 SMC אל הצד התחתון של כל מסנן, נזהר לא לשפוך כל אחד את הפתרון מדיה, תא. למקם את המכסה למעלה ולהעביר בזהירות על צלחת פטרי עם התוספות לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: צפיפות תא האופטימלי עבור סוגי תאים אחרים יהיה צורך להיקבע מדעית.
  7. ביום 2, למלא נקי. ובכן 6 מנות עם 2 מ"ל של מדיה SMC טריים, ומחוממת מראש. הסר את הצלחות של החממה. . קח את המכסים את אחד בכל פעם, להסיר את התקשורת על ידי שאיבה ולאחר מכן למקם את המנה 6-ובכן עם SMC מדיה.
  8. מעיל הצד הנגדי של המסנן (EC צד) עם 1 מ"ל של פתרון ג'לטין שור 0.5% במשך לפחות 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  9. Trypsinize את flask(s) 2 225 ס מ של הנציבות האירופית עם 3 מ"ל של 2 מראש ומחוממת X טריפסין-EDTA (10 x מעורבבת עם Dulbecco עקר ' s PBS) פתרון, עם הקשה עדין + בקבוקי שתייה צידניות כדי להרים את התאים מהצלחת.
    הערה: יתכן צורך למקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-3 דקות.
    1. פעם התאים יש כבד ירד לצלחת, מוסיפים 9 מ ל מדיה EC לנטרל את טריפסין (3:1). להעביר צינור חרוטי, בריכה יחד, לערבב היטב, pipet 10 µL אל hemocytometer כדי לקבוע את מספר הטלפון הנייד.
      1. ספירת מספר התאים ב- 5 x 5 תיבות (קרי, 60), תכפיל את זה ב 10,000 כדי להכניס את מספר התאים 1 מ"ל (600,000). אז תכפיל ב 12 מ ל (סה כ נפח תא השעיה, EC 7.2 מיליון). להבטיח שאין מספיק EC על לוחית רישוי מספר וולס הרצוי.
        הערה: EC כ 360,000 נדרשים לכל טוב. לדוגמה, בארות 18 לדרוש לכלכלת 6.48 מיליון לחלק 6.48 מיליון תאים שתתבקש על-ידי EC 600,000 לכל 1 מ"ל, התוצאה היא 10.8 מ של התליה תא זה יהיה צורך עבור ציפוי. ואז לחשב את עוצמת הקול הסופי הדרוש (בארות 18 x 1 מ"ל = 18 מ"ל). לכן, קח 10.8 מ של התא השעיה, להביא את אמצעי האחסון עד 18 מ עם מראש חימם EC מדיה, בעדינות resuspend.
  10. צלחת 1 מ"ל של 360,000 EC על הצד העליון של כל מסנן הוספה. תן את התאים דגירה ללא הפרעה ב 37 ° C ה 24 בינוני החלף ביום הרביעי. קציר ביום 5.

2. קציר שברים של VCCC

  1. לבצע את הבידוד בחדר 4 ° C ולשמור את כל הכלים על קרח
  2. לזכור את המספר של הפרט מוסיף להיות מבודדת ולהוסיף פירוק מאגר שפופרת 50 מ ל הנקרא MEJ (של המסננים מבודד). ואז תווית שתי מנות 10 מ מ; אחד EC ואחד עבור SMC.
  3. התאם את עוצמת הקול של פירוק מאגר תלוי כמה מרוכז lysate צריך להיות; 15 מוסיף, µL 500 פירוק מאגר בים MEJ, µL 250 לכל צלחת פטרי מומלץ.
  4. עבודה עם לוח 6-ובכן אחד של מוסיף בכל פעם. היניקה את המדיום הוד התרבות תאים ולאחר מכן תחבורה אל חדר קר על קרח
    הערה: ההוראות הבאות הן עבור 1 להוסיף הבידוד.
  5. Pipet 10 µL של PBS 1 x לצד SMC של הקדמי.
  6. להשתמש את מרים תא לגרד את התאים בקצה אחד של הקדמי, ולהעביר את התאים מרים לצלחת פטרי SMC בעל מאגר פירוק בתוכו
  7. , ברגע מרים תא נגע המאגר פירוק בצלחת, אינם מאפשרים לו לגעת במסנן הוספה עד יש כבר לגמרי מחה והוא התייבש על מגבות נייר. חזור על גירוד של המסנן SMC לפחות אחד עד שני פעמים כדי להסיר לחלוטין את שאריות תאים SMC הנותרים.
  8. הופכים את הוספה מעל ואת pipet 10 µL של PBS 1 x הצד העליון/EC של המסנן ' הוספה '. חזור על שלבים 2.6 ו 2.7 עם המגרד של התא, EC הפטרי.
  9. לאסוף את התאים הנותרים ואת PBS slurry מהצד EC של המסנן עם פיפטה, העברה כדי EC הפטרי עם פירוק מאגר. להיות יסודית תוך גירוד התאים את שני הצדדים של המסנן והשארת זיהום EC/SMC מינימלי של השבר MEJ.
  10. השתמש בזהירות את האזמל כדי לגזור את המסנן מהמכסה הפלסטיק. עושים זאת על ידי חיתוך 70-80% מן הפלסטיק ולהשתמש מלקחיים למשוך את המסנן לגמרי מחוץ למבנה כיסוי הפלסטיק. לשים את המסנן בצינור חרוט 50 מ עם פירוק מאגר תוויות MEJ, ולוודא שזה יושב במאגר של פירוק ונותרה רטובה.
  11. חזור על השלבים בידוד, בקבוצות של 6, עד כל התוספות עובדו.
  12. להבטיח כי קבוצות טיפול שונה שמורים בתוך צינורות נפרדת ומנות.
  13. מערבולת הצינור חרוט MEJ 50 מ בבעוצמה מלאה עבור 15 s או עד מעורבב היטב. הסר את המסננים MEJ חרוט עם מלקחיים, גורר אותם לאורך הקירות הצדדיים של הצינור והשארת את הכמות המרבית של חלבונים ושל נוזל בצינור. לאחר נקודה זו, מחק את מסנני.
  14. לאחר כל המסננים הוסרה מן הצינור חרוט MEJ, לעשות סיבוב מהיר (10-15 s ב g ~ 16,000 x מהירות מקסימלית) ומפרידה למשוך כל נוזל, חלבונים לתחתית הצינור- להעביר את התוכן של הצינור MEJ והכלים EC ו- SMC פטרי לתוך צנטריפוגה נפרדים, קטן יותר, צינורות.
  15. אופציונלי: Sonicate את התוכן של הצינורות MEJ/SMC/EC הגדרת 4 עבור s 10 שלושה פולסים על קרח או homogenize בעדינות ביד.
  16. צנטריפוגה-מהירות מקסימלית (~ 16,000 x g) 15 דקות ב-4 ° C. Pipet החוצה את תגובת שיקוע, assay lysate לתוכן חלבון בשיטת assay bicinchoninic.

3. קציר את VCCC עבור פנים En Immunofluorescence

  1. דגירה על יום 5 של VCCC, להסיר את התוספות של החממה. עובד בשכונה התרבות תאים, יניקה את התקשורת SMC מכל הבארות התחתון של הוספת מסנן, יש לשטוף פעמיים עם 1 x PBS . אני חוזר עם הצד EC.
  2. שומר את הכיסויים שלם ועל בצלחת, להוסיף 4% paraformaldehyde (PFA) למשך 10-20 דקות בחדר ותא-4 מעלות צלזיוס על מטרף עדין. לשטוף את שני הצדדים של המסנן הוספה עם PBS 1 x עבור 5 דקות וחזור פעמיים.
    התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.
  3. לבצע את incubations נוגדנים חסימות, ראשיות ומשניות בצלחת, המבטיח כי שני הצדדים של המסנן שמרו על הנוגדן + חסימת פתרון (9 מ ל PBS, 25 µL טריטון X100, אלבומין שור 50 מ"ג, 500 סרום רגיל µL)
  4. כדי לטעון את המסנן בשקופית, לחתוך את המסנן החוצה תותב פלסטיק עם איזמל רכוב על ידית בעלת המקום בשקופית מיקרוסקופ הרכבה בינונית.

4. קציר את VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

  1. דגירה על יום 5 של VCCC, להסיר את התוספות של החממה. לשאוב את התקשורת משני הצדדים של המסנן הוספה בשכונה תרבות תא ולשטוף בכל צד של המסנן פעמיים עם PBS 1 x.
  2. שומר את הכיסויים שלם ועל בצלוחית 6-ובכן, להוסיף 4% PFA דגירה בין לילה בחדר ותא-4 מעלות צלזיוס על מטרף עדין.
    התראה: PFA רעיל, יש לטפל בזהירות.

5. הטבעה של VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

  1. לאחר סינון מוסיף תוקנו כ במשך 24 שעות ביממה ב- 4% מחברים, העברה עד 70% EtOH לפחות 24 שעות, אבל עד מספר שבועות.
  2. לעבד את המסננים ארוך (לילה) לרוץ על מעבד רקמות אוטומטית. השתמש בתוכנית כדלקמן: 70% EtOH במשך 30 דקות, 85% EtOH 30 דקות, 95% EtOH 30 דקות, 100% EtOH 30 דקות, 100% EtOH 45 דקות, 100% EtOH 45 דקות, קסילן 30 דקות, קסילן 30 דקות, קסילן 45 דקות, 60 ° C שעוות פרפין 30 דקות, 60 ° C שעוות פרפין 30 דקות , 60 ° C שעוות פרפין 45 דקות
  3. לאחר העיבוד, העבר המסננים שנקטפו לתחנה ההטבעה לתוך שמן פראפין, שמירה על המסנן הקלטת.
  4. להסיר את המסנן הקלטת, בזהירות באמצעות מלקחיים להחזיק את זה רק בקצה. עם מספריים, לחצי את המסנן, ויוצרים שתי חצי עגול בצורת חצאים. זיון של 2 חצאים בחלק צלחת קר של תחנת ההטבעה בדיוק זמן מספיק כדי למלא את ההטמעה עובש עם שמן פראפין.
  5. פעם מלא שמן פראפין, מאוד בקצרה לגעת את להטבעה קר לצלחת, ואז להטביע חצי אחד של המסנן לתוך הטבעת עובש (לחתוך בצד); פעולה זו מבטיחה כי בעת חלוקתה, אחד תנטרלו מהמרכז של המסנן כלפי הקצה .
  6. במהלך הטבעה, להשתמש מלקחיים להחזיק את המסנן במקום כדי למנוע את החצאים מנפילה לתוך השני עד הפרפין מגניב מספיק להם לעמוד לבד. לעבור את להטבעה צלחת קר עד פני השטח למוצק לגמרי.
    הערה: קירור בלוקים על מגשי הקרח מסייעת למנוע מקטעים מקומט.

6. חלוקתה, מכתימה את VCCC עבור רוחבי Immunofluorescence

  1. עבור אבני פרפין חלוקתה והחלק הרכבה: לחתוך 5 מיקרומטר מקטעים, למקם את המקטעים לתוך אמבט מים 42 ° C, ולאסוף את הסעיפים באמצעות הטעון חיובית שקופיות. ואז להשאיר ללילה שקופיות בתנור 42 ° C כדי לייבש.
  2. לפני תחילת המדרגות התייבשות, לאפות את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס להמיס הפרפין ולעזור לדבוק הסעיפים VCCC לשקופית. מגניב בקצרה, ואז להחזיר נוזלים בין השקופיות באמצעות שני שינויים של קסילן, 100% EtOH, 95% EtOH, שינוי אחד של 70% EtOH, ושני שינויים של מים מזוקקים.
  3. להימנע שיטות אחזור אנטיגן המערבות במיקרוגל או חימום כמו סעיפים יפלו מחוץ לשקופית.
  4. בצע חסימת הרגיל לשעה בטמפרטורת החדר, ואז הדגירה לילה עם נוגדן ראשוני ב 4 ° C, ואחריו שטיפה צעדים, נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר. הר עם הרכבה מדיה, coverslip.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

יש הכיסויים המסנן המשמש את VCCC קטנה, 0.4 חורים מיקרומטר. איור 1A, מבט פנים en שיבוץ מסנן VCCC, מציג את הנקבוביות שבו MEJ יכול ליצור במבחנה. התרשים מתאר את תאי השריר החלק מצופה בצד התחתון של המסנן יום אחד לפני תאי אנדותל הם מצופה בצד הנגדי (איור 1B). ברגע התאים הם מצופים, שברים EC, MEJ ו- SMC ניתן לבודד שלושה ימים לאחר מכן. דוגמה לכך היא שמוצג באיור 2A, איפה plasminogen activator מע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

VCCC יש מספר יתרונות במונחים של recapitulating MEJs במבחנה, אבל יש נקודות לדיון בעת החלטה אם VCCC יכול להיות מנוצל עבור יישומים ספציפיים. לדוגמה, אם לסוגי תאים שונים לשימוש עם מודל זה, היא תצטרך להיות ממוטבים. השתמשנו תאים אנושיים הראשי, אבל ניתן לבודד תאים aortas שור24או עכברים wildtype או נוקאאוט, ולהשתמש בהם ב5,1,VCCC14.

אם משתמש VCCC את MEJ בידוד, הטכניקה הכי חשוב ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי ללב, ריאות, מכון דם מעניקה 14PRE20420024 אחוות predoctoral R01088554, T32HL007284 ו- American Heart Association. אנו מודים במיוחד סנט ג'וד הסלולר הדמיה משותפים מחקר הליבה, כולל וויקפילד רנדל, לינדה הורנר לתמונות מיקרוסקופ אלקטרונים, אדם סטרוב לקבלת סיוע עם נציג immunofluorescence תמונות Pooneh Bagher בשבילה משוב בעל ערך בפרוטוקול כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוטר 24 מ"מ, 0.4 ומיקרו; m Transwell פוליאסטר ממברנה מסנן הכנסקורנינג3450זהו אחד 6 באר צלחת של מוסיף
225 ס"מ בקבוקקורנינג431082
6 באר צלחות (ללא מוסיף מסנן)קורנינג3506
תאי אנדותל עורק כלילי אנושי ראשוניLonzaCC-2585
עורק כלילי אנושי ראשוני תאי שריר חלקLonzaCC-2583
EBM-2 EC מדיה בזאליתLonzaCC-3156
EC גורמי גדילה (EGM2 MV ציטוטים בודדים)LonzaCC-4147הוסף למדיה בזאלית לפני השימוש
SmBM SMC מדיה בזאליתLonzaCC-3181
גורמי גדילה SMC (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149הוסף למדיה הבזאלית לפני השימוש
0.5% Trypsin-EDTA 10XGibco15400-054לדלל ל-2X עם המוציטומטר dPBS סטרילי
VWR15170-208
צלחות פטרי גדולות לציפוי SMC (150 מ"מ)קורנינג353025
ג'לטין בקרסיגמאG-9382
פיברונקטין אנושיקורנינג3560085&מיקרו; גרם/מ"ל של פיברונקטין ואחסן ב-20
10x תמיסת מלח חוצצת של הנקס (HBSS)Gibco14065-056לדלל ל-1x במים סטריליים
10x Dulbecco's Phosphate buffered Salt (dPBS)Gibco14200-075לדלל ל-1x עם מים סטריליים
אזמל מעוקל חד פעמי (קצה חיתוך 30 מ"מ) עם ידיתAmazonMDS15210
ForcepsFisher17-467-201
מרים תאיםקורנינג3008
מגרד תאיםBD Falcon353085
50 מ"ל צינור חרוטיקורנינג352070
10 מ"מ צלחות פטריפלקון35-1008
Rneasy מיני קיטQiagen74104
RNA מגיב ליזהQiagen79306
ParaformaldehydeSigma158127הכינו תמיסה של 4% עם dPBS
70% אתנולפישר04-355-305
חומר חיטוי Cavicideפישר131000
RIPA מאגר ליזה חלבוןSigmaR0278
מפרק סוניקפישרדגם 50
1x PBS לקטיף EC/SMC ו אימונוציטוכימיהGibco10010023לא צריך להיות סטרילי
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
<חזק>הטמעה/חתך/מכתים<>
חזק פרפיןפישר P31-500
מעבד רקמות אוטומטיExcelsiorES
תחנת הטמעה + צלחת קרהLeicaHistoCore Arcadia
רקמות Tek Accu-Edge להב מיקרוטוםVWR25608-961 או 25608-964
שקופיות מיקרוסקופתרמו פישר22-230-900
כיסוייםתרמו פישר12-548-5E
להאריך זהב הרכבה בינוניתתרמו פישרP36931
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
><חזק>פתרונות אחרים<חזק>**בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים אם משתמשים בתמיסה על תאים חיים
dPBSסטריליים לעיקור. בעזרת המים הסטריליים יוצרים DPBS (450 מ"ל מים סטריליים: 50 מ"ל 10X DPBS), מערבבים ומסננים לעקר (0.2µ מסנן m).
ריכוז סופי: 1X
HBSSסטריליים לעיקור. באמצעות המים הסטריליים יוצרים HBSS (450 מ"ל מים סטריליים: 50 מ"ל 10X HBSS), מערבבים ומסננים לעקר (0.2µ מסנן m).
ריכוז סופי:
מלאי פיברונקטיןהשתמש ב-50 מ"ל מים סטריליים לפיברונקטין כדי ליצור מלאי של 1 מ"ל אליקוטים, ואז להקפיא עד הצורך
ריכוז סופי: 100µ גרם/מ"ל
פיברונקטין לציפוי צד SMC של VCCCלהפשיר אליקוט אחד ולהוסיף 1 מ"ל של פיברונקטין (100&מיקרו; גרם/מ"ל) ל-19 מ"ל של 1X HBSS כדי להגיע לריכוז סופי של 5µ g/mL.
ריכוז סופי: 5µ g/mL
2x תמיסתלדלל את 10X 0.5% Trypsin-EDTA ל-2X עם 1X dPBS (40 מ"ל DPBS: 10 מ"ל 10X טריפסין) .
ריכוז סופי: 2X
תמיסת(9 מ"ל 1X PBS, 25 מ"ל טריטון X100, 50 מ"ג אלבומין בסרום בקר, 500 מ"ל סרום רגיל)
ג'לטין בקר לציפוי EC VCCCמערבבים 0.5 גרם ג'לטין בקר למים מזוקקים של 100 מ"ל. חיטוי לפני השימוש הראשון ויש לאחסן בטמפרטורת החדר. שמור בתנאים סטריליים.
ריכוז סופי: 0.50%
1x PBS לקצירת תאיםלא צריך להיות סטרילי
מי חיטוי מי חיטויתמיסת 1X Trypsin EDTA חסימה/נוגדנים

מקורות

  1. Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
  2. Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
  3. Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
  4. Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
  5. Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
  6. Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
  7. Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
  8. Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
  9. Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
  10. Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
  11. Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
  12. Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
  13. Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
  14. Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
  15. Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
  16. Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
  17. Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123(2014).
  18. Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
  19. Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
  20. van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
  21. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  22. Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
  23. Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
  24. Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
  25. Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
  26. Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
  27. Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

צומת מיואנדותליאליתרבית משותפת של תאי כלי דםתאים אנדותליאלייםתאי שריר חלקהפרדת פראקציות של תאיםאנליזה אימונופלואורסצנטיתטמיעה בפרפיןWestern Blotבידוד חלבונים
מודל התרבות התא של התנגדות העורקים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.