הדמיה לחיות תאים תאים פטרייתי לחקור מצבים של ערך ולוקליזציה Subcellular של הצמח נגד פטריות Defensins

הצמחים התפתחו מערכת חיסונית מולדת מתוחכמים להגנה נגד פתוגנים צמח חיידקים¹. הם מבטאים רבים פפטידים ההגנה מארח גן מקודד עם פעילות מיקרוביאלית בשם². ואכן, רבים של פפטידים אלה מציגים פעילות מיקרוביאלית במבחנה³. Defensins מהווים את אחת הקבוצות הגדולות של פפטידים ההגנה מארח הממלכה של הצמח⁴. אלה פפטידים עשיר ציסטאין, cationic להפגין פעילות מעכבות צמיחה חזקה נגד פטרייתי, פתוגנים oomycete ריכוזי micromolar, ייצגו אחת השורות הראשונות של הגנה מפני פתוגנים אלה,^5,6. בשל פעילותם נגד פטריות חזק, אפשר לנצל defensins ביישומים agribiotechnological ליצירת גידולים עמידים בפני מחלות. ביטוי המכונן של מספר defensins הצמח הוכח כדי לשפר את ההתנגדות המחלה בבדיקות החממה ושדה של העברה⁶. חשוב לפענח את מנגנוני הפעולה (מואה) של פפטידים פטריות אלה על מנת מלא לרתום את הפוטנציאל שלהם ככלים יעילים עבור הגנת הצומח. עם זאת, מואה של אלה defensins צמח הם הבינו כהלכה. הראיות הנוכחי עולה כי הם מציגים שונות מואה^5,6,7,8. כמה defensins לפעול extracellularly פטריות לכוון דופן התא הספציפי/פלזמה ממברנה sphingolipids תושב, לשבש הקרומיות, להפעיל רעילות הסלולר מסלולים^9,10,11. לאחרונה, עם זאת, defensins פטריות זה translocate לתוך תאים פטרייתי היה שהתגלו^12,13,14. חלק defensins אלה לאגד תושב קרום phospholipids ביו, יוצרים קומפלקסים oligomeric, permeabilize ממברנות פלזמה^15,16,17. לפיכך, היבטים מסוימים של מואה של הצמח defensins יש כבר מבואר. עם זאת, מואה של הצמח defensins סביר כוללות מערך מורכב של אירועים אשר עדיין לא מזוהה, משולב לתוך מודל מקיף. בפרט, נותר פער רציני בהבנה שלנו של המטרות הסלולר של פפטידים אלה.

עם ההתקדמות מיקרוסקופ טכנולוגיות ופיתוח של הגששים פלורסנט חדש, טכניקות הדמיה לחיות תאים עכשיו משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד מואה של פפטידים מיקרוביאלית (אמפר). טכניקות אלה משלימים שיטות שימוש נרחב כגון immunolocalization, מיקרוסקופ אלקטרונים, מיקרוסקופ כוח אטומי או רנטגן טומוגרפיה¹⁸, אשר יש כבר מועסקים בעיקר כדי לנתח את ההשפעות של פפטידים פטריות על המורפולוגיה, הצמיחה של תאים פטרייתי כולל המחקר של דופן התא שלמות, שינוי דפוסי צמיחה/מסעף תא, כמו גם קרום פלזמה permeabilization ולהרוג. למרות זאת, מחקרים אלה היה מוגבל הדמיה תאים בשלב זמן מסוים לאחר הטיפול עם פפטידים במקום ביצוע זמן לשגות הדמיה על אותם התאים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים שלהם בתגובה defensin אתגר. בשנים האחרונות השימוש פפטידים fluorescently שכותרתו בשיתוף עם חיים תא הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אפשרה ויזואליזציה בזמן אמת של הדינמיקה של המגבר – חיידק אינטראקציות. שניהם באופן טבעי טהור ו מסונתז כימית פפטידים פטריות יכול להיות מתויג עם תוויות פלורסנט (למשל, DyLight, rhodamine, BODIPY או אלקסה עבור חיל הים על בסיס צבע), ישירות ציין במהלך האינטראקציה שלהם עם תאים על-ידי בצילום מואץ הדמיה לחיות תאים. השימוש אלה שכותרתו פפטידים גדל באופן משמעותי את ההבנה שלנו של היבטים שונים של שלהם מואה כולל מצב של ערך, לוקליזציה subcellular, וגדילת ואתרים של פעולה נגד פטריות בתוך תאים חיים פטרייתי ¹⁸.

לאחרונה, מספר מחקרים הראו כי פפטידים פטריות שונות כולל צמח defensins הם לנחלתו של חיים תאים פטרייתי^12,14,19,20. מואה של אלה defensins סביר כרוכות באינטראקציה עם מטרות תאיים. לאחרונה דיווחנו בפעולה נגד פטריות של צמח defensin MtDef4 שני בפטרייה ascomycete, Neurospora crassa , Fusarium graminearum. MtDef4 הוצגה לשימוש מסלולים שונים עבור ערך התא פטרייתי ולוקליזציה subcellular אלה פטריות¹⁴. במחקר זה נעשה שימוש כימי מסונתז tetramethyl rhodamine (טמרה)-הנקרא MtDef4 בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני (קרום בררני לצבוע, FM4-64; צבע ממברנה-permeant, SYTOX ירוק תא מותו כתב לצבוע, יודיד propidium), מעכבי חילוף החומרים. ניתוחים אלה הפגינו את קינטיקה של ההפנמה של MtDef4, שלה מנגנונים תאיים תחבורה שלו מטרות subcellular¹⁴.

כאן מוצג עבור הדמיה לחיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פרוטוקול. הפרוטוקול מנצל פפטידים שכותרתו fluorescently בשילוב עם צבעי פלורסנט חיוני ללמוד אינטראקציות צמח defensin-פטרייתי, בפרט, המסלולים של טרנסלוקציה המטרות תאיים של defensins בתאים פטרייתי.

1. תיוג של Defensins עם Fluorophores

1. בחר fluorophore בעל השפעה מינימלית על המאפיינים מיקרוביאלית כמו גם ספיגת ועל לוקליזציה של defensin בתוך התא החי.
   הערה: בחירת fluorophore האופטימלי תלוי מטרות ספציפיות ניסיוני. ספקטרלי והכימיות, פוטוסטביליטי, אחראי על fluorophore וגודל גם להתייחס.
2. תווית defensin עם fluorophore שנבחר באמצעות פפטיד המתאים של תיוג ערכת ולמשקאות מסחרי. לחלופין, מבחינה כימית לסנתז defensins התווית על-ידי fluorophore. במחקר זה, תווית MtDef5 defensin עם DyLight550 באמצעות תיוג מסחרי קיט על פי הפרוטוקול ואת tetramethyl rhodamine היצרן (טמרה)-defensin MtDef4 שכותרתו כימית סונתז מסחרית.
   הערה: מומלץ כי מסונתז כימית fluorophore מתויג פפטידים (במיוחד עבור פפטידים קצרים של חומצות אמינו 50 או פחות) לשמש מאז שניתן לחבר את fluorophore N - או C-מסוף השאריות פפטיד כדי להבטיח השפעה מינימלית על שלה פעילות מיקרוביאלית. סינתזה של פפטידים ארוכים עם יותר משלושה חוב דיסולפידי הוא מאתגר. במקרה זה, מומלץ פפטיד זה להיקרא עם fluorophore אופטימלי באמצעות פפטיד זמינים מסחרית מתאימים תיוג קיט.
3. מבחן במבחנה פעילות מיקרוביאלית של defensin שכותרתו ולקבוע את הריכוז המעכב מינימלי (MIC) נגד פטריות להיחקר.
   הערה: במחקר זה, המיקרופון של DyLight550-MtDef5, TMR-MtDef4 היה נחוש נגד Neurospora crassa Fusarium graminearum.

2. מדיום הגידול ומתרבויות פטרייתי

1. העברת conidia מתרבות מניות crassa ש שיפוע הצינור המכיל של ווגל אגר בינוני²¹ , דגירה בטמפרטורת החדר בתאורה במשך 5 ימים.
2. תרבות graminearum פ זן PH-1 על צלחות המכיל שלם בינוני (ס מ)²² -28 ºC במשך 5 ימים. לייצור של conidia, לחסן 4 פקקים (10 מ מ קוטר) של בן 5 יום התרבות של פ graminearum PH-1 לתוך 50 מ של carboxymethyl תאית (CMC) בינונית (15 גר' carboxymethyl תאית, 1 g תמצית שמרים, 0.5 g MgSO₄.7 H₂O, NH 1 g ₄ אין₃ו- 1 g ח'₂PO₄) ותרבות 4-7 ימים-ºC 28 ב שייקר רוטרי ב 180 סל ד.

3. הכנה של הבולם Conidial

1. ההשעיה conidial graminearum פ
   1. מערבולת התרבות נוזלי פ graminearum , conidia לאסוף על-ידי סינון 1.5 mL תרבות פטרייתי דרך שתי שכבות של חומר סינון (כגון Miracloth) לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל. Centrifuge את המתלים conidial ב 13,226 x g מהירות microcentrifuge למשך 2 דקות.
   2. למחוק את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של מים סטריליים לשטוף בגדר.
   3. Centrifuge המתלים conidial ב 13,226 x g מהירות microcentrifuge עבור 2 דק להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של X SFM (מדיה פטרייתי סינתטי) 2²³.
   4. לספור את conidia באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור.
   5. התאם את המתלים conidial כדי 10⁵ conidia/mL עם 2 X SFM.
2. (ש ע) crassa הבולם conidial
   1. העברת כמות קטנה של תרבות גדל (בן 5 יום) crassa ש באמצעות ללולאה חיסון לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל 2 מ של המדיום הנוזלי של ווגל.
   2. מערבולת המתלה conidial ומסנן דרך סינון החומר לתוך צינור microcentrifuge.
   3. Centrifuge המתלים conidial במהירות מקסימלית microcentrifuge עבור 2 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר conidial ב 1 מ"ל של המדיום הנוזלי של ווגל.
   4. לספור את conidia באמצעות hemocytometer תחת מיקרוסקופ אור.
   5. התאם את המתלים conidial כדי 10⁵ conidia/mL בינונית נוזלי של ווגל.

4. לדגום קונפוקלית והכנה

1. לוקליזציה subcellular של MtDef4 defensin לתוך תאים פטרייתי
   1. פיפטה 50 µL של כל השעיה conidial (10⁵ conidia/mL) לתוך microwell 10 מ מ של 35 מ מ זכוכית התחתון microwell מנות. עבור הצפיה conidia, ישירות להמשיך לשלב הבא, או להכנה germlings, µL 50 פיפטה crassa ש ו פ graminearum conidia לתוך הכלים תרבות 35 מ מ ולתת לנבוט במשך 3-6 שעות בטמפרטורת החדר.
   2. להוסיף 50 µL של defensin fluorescently עם תוויות על המיקרופון כדי כל מנה microwell, תקופת דגירה של 2.5 h. המיקרופון של התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) 3 מיקרומטר crassa ש וגם פ graminearum , המיקרופון של TMR-MtDef4 crassa ש ו פ graminearum היה 1 מיקרומטר ו 12 מיקרומטר, בהתאמה.
   3. להוסיף 2 µL של ממברנה סלקטיבית לצבוע FM4-64 (הריכוז הסופי: 5 מיקרומטר) בתרבות צלחת ואת תקופת דגירה של 30 דקות לטעון מיד על מיקרוסקופ קונפוקלי עבור הדמיה.
   4. בחר את לייזר אור לבן (יקלו). להשתמש את nm מקורות 488 לייזר שני 550 ננומטר לגרות צבע TMR-MtDef4 ו- FM4-64, בהתאמה. זריחה של TMR-MtDef4-580-700 nm ויוכל לזהות צבע FM4-64-690-800 ננומטר.
      הערה: בצע מיקרוסקופיה קונפוקלית בחדר חשוך.
2. זמן לשגות הדמיה של הפנמה של MtDef5 defensin
   1. פיפטה µL 50 crassa ש ו פ graminearum conidial השעיה (10⁵ conidia/mL) לתוך 10 מ מ microwell של 35 מ מ זכוכית התחתון microwell מנות. Microwell 10 מ מ הוא ללא ציפוי ויש לו כוס כיסוי מס 1.5 בתחתית. עבור הצפיה conidia, ישירות להמשיך לשלב הבא. להשגחה של germlings, דגירה conidia במשך 3-6 שעות בטמפרטורת החדר לפני שתמשיך עם מיקרוסקופ.
   2. הפעל יקלו. בחר את השורה לייזר ב 550 ננומטר לרגש את התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) ואת FM4-64 בעוצמה 1.00% ולהפעיל את גלאי המתאימים. התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) התגלה ב- 560-600 nm, FM4-64dye התגלה ב- 690-800 ננומטר.
      הערה: השתמש לייזר נמוך עוצמה תא חי הדמיה כמו עוצמת לייזר גבוה יכול לגרום נזק לתאי פטרייתי בשידור חי.
   3. הר המנה microwell על המיקרוסקופ. למצוא את התאים באמצעות מטרות x 10 בתחילה, ואז לעבור 100 x / 1.44 שמן. המטרה הגדלה גבוהה יותר.
      הערה: הגדרת מצב סריקה כדי xyzt (שילוב של Z-מחסנית ומצבי בצילום מואץ), Z עמדה, זום, התדירות של לכידת התמונה, וכו '.

חיים תא הדמיה בוצע מעקב אחר ולהשוות את הפנמה ואת subcellular לוקליזציה של defensins שני, MtDef4, MtDef5, מ- אספסת truncatula; בתאים פטרייתי. TMR-MtDef4 היה מסונתז כימית בזמן MtDef5 סומן עם Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidia היו מודגרות עם או defensin בשילוב עם קרום בררני לצבוע FM4-64. איור 1 מראה כי TMR-MtDef4 יש מסלולים שונים סחר ב ש crassa לעומת פ graminearum. Crassa ש, FM4-64 לא לשפה משותפת עם defensin אך מעדיף כתמי הממברנות של וקואלות שבתוכה defensin הוא בבידוד. פ graminearum, מצד שני, TMR-MtDef4 הוא לא מקומי בתוך כל organelles קרום מסוימים מאוגדים אך מפוזרת בציטופלסמה (איור 1).

זמן לשגות הדמיה של crassa ש תאים עם תוויות עם התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) והן FM4-64 מראה כי defensin הוא מסוגל להיכנס פטרייתי תאים בתוך 30 עד 40 דקות של טיפול (איור 2). כשנכנסתי לתוך התאים, התווית על-ידי fluorophore defensins המשמש כאן (שלב 1.3) לא בתרגום בתוך כל אברון ספציפי אך מפזרת בקלות לתוך הציטופלסמה. זאת בניגוד TMR-MtDef4 אשר מזין תאים crassa ש נשאר לכוד בתוך הגופים vesicular גם לאחר 3hrs של הטיפול (איור 1).

איור 1: MtDef4 יש מסלולים שונים סחר ב crassa ש ו פ graminearum. TMR-MtDef4 רגישה לתוך גופים vesicular crassa ש (א) אך מפוזרת לתוך הציטופלסמה של פ graminearum (B). Conidia של crassa ש ו פ graminearum היו במשותף עם תוויות עם 1 מיקרומטר ו 12 מיקרומטר TMR-MtDef4 (אדום), בהתאמה, ועם FM4-64 (ירוק). התמונות צולמו לאחר 3 שעות של טיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: MtDef5 הוא לנחלתו של crassa ש ו מפזרת בתוך התאים. DyLight550-MtDef5 הוא הפנימו לתאים crassa ש ו מפזרת לתוך הציטופלסמה. Crassa ש התאים היו במשותף עם תוויות מיקרומטר 3 DyLight550-MtDef5 (אדום) ו- FM4-64 (ירוק). הסרטונים הוקלט עבור 2 שעות ו- 30 דקות. ההשהיה בין התוספת של MtDef5 והתחלת ייבוא תמונות היה 5 דק סולם בר = 4 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

המחברים אין לחשוף.