הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56014

⸱

25 באוקטובר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה אפיון, הזרקה של פפטידים עמילואיד monomeric-β42 ליצירת עמילואיד רעילות של דג זברה בוגרת כדי ליצור מודל של מחלת אלצהיימר, ואחריו ניתוחים היסטולוגית וזיהוי של הסיכומים.

תקציר

מחלת אלצהיימר (AD) היא מתישה מחלות ניווניות איזה הצטברות עמילואיד רעיל-β42 פפטידים (Aβ42) מוביל ניוון סינפטית, דלקת, מוות עצביים, למידה גירעונות. בני אדם לא יכול להתחדש נוירונים אבוד במקרה של המודעה בחלקו בשל קיבולת proliferative לקוי של תאי גזע עצביים/קדמון (NSPCs) ושל נוירוג'נסיס מופחת. לכן, טיפולים משובי יעיל צריך גם לשפר את ההתפשטות neurogenic קיבולת של NSPCs-דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור משובי ואני נוכל ללמוד את התוכניות מולקולרי בסיסי שבו היינו יכולים לעצב גישות טיפוליות כדי להתמודד עם AD. מסיבה זו, הדור של דגם AD-כמו בדג זברה היה הכרחי. באמצעות המתודולוגיה שלנו, אנחנו יכולים להציג נגזרות סינתטי של פפטיד Aβ42 עם יכולת חדירה לרקמות לתוך המוח דג זברה למבוגרים, ולנתח המחלה פתולוגיה ואת התגובה משובי. היתרון מעל שיטות קיימות או בבעלי חיים הוא שדג זברה הזאת יכולה ללמד אותנו איך מוח חוליות יכול להתחדש באופן טבעי, ובכך לסייע לנו להתייחס מחלות ניווניות אנושי טוב יותר על ידי מיקוד NSPCs אנדוגני. לפיכך, המודל עמילואיד רעילות הוקמה במוח דג זברה למבוגרים עשוי להיפתח דרכים חדשות למחקר בתחום של מדעי המוח, רפואה קלינית. בנוסף, ביצוע פשוט בשיטה זו מאפשר הערכת ניסיוני חסכונית ויעילה. כתב יד זה מתאר את סינתזה של הזרקה של פפטידים Aβ42 למוח דג זברה.

מבוא

המודעה היא מחלה פרוגרסיבית כרונית המאופיינת על ידי האובדן של נוירונים, synapses קליפת המוח1,2,3,4,5. גולת neuropathological הקלאסית של AD הן בתצהיר של פפטידים עמילואיד וסבך היווצרות neurofibrillary (NFTs)6. שלטי סנילי, הידוע גם בשם עמילואיד הפלאק, מורכבים של פפטידים עמילואיד-β (Aβ) שיוצרים מבנים קפלים β parenchyma המוח5. ההצטברות של Aβ42 בחולים לספירה יש תפקיד מוקדם וקריטיים התקדמות המחלה. המודעה מפעילה מפל של האירועים שהובילו סינפטית בתפקוד לקוי פלסטיות, אובדן עצביים7,8,9,10.

המוח למבוגרים של דג זברה teleost משמש מודל מצויין ללמוד ברגולציה של תאי גזע פלסטיות11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 ומחלות שונות במערכת העצבים המרכזית (CNS), לרבות לספירה21,22,23 ,24. בשל מגוון רחב של שיטות נסיוניות זמין19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, מחקרים אלה הן אינפורמטיבי ריאלי. דג זברה יכול לחדש את מערכת העצבים המרכזית13,15,32,33,34,35,36,37, 38, בין השאר באמצעות תוכניות מולקולרי מופעל לאחר אובדן עצביים19,39,40,41,42,43, 44. לכן, קביעת מודל מחלות ניווניות דג זברה יכול לעזור כתובת הרומן שאלות הנוגעות משובי יכולת גזע ביולוגיה של התא במוח חוליות.

לאחרונה, פיתחנו מודל רעילות עמילואיד במוח דג זברה למבוגרים באמצעות הזרקת Aβ42 סינתטי פפטידים (טבלה 1)39. זריקה זו גרמה הקשורים ניוון מוחיים פנוטיפים מזכיר הפתולוגיה במוח האנושי (למשלמוות של תאים, microglial הפעלה, ניוון סינפטית, גירעונות זיכרון), המציין את דג זברה יכול לשמש עבור העלאת הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה, Aβ42 פפטידים יכולים להתגלות עם immunohistochemical stainings, המנגנונים המולקולריים של התחדשות של דג זברה בוגרת ש-CNS יכול להיות מזוהה39. ב פרוטוקול זה, נדגים ההזרקה של peptides סינתטי עמילואיד למוח דג זברה באמצעות של cerebroventricular הזרקה (CVMI) שיטה27,39,45,46 כדי לחקות את התצהיר עמילואיד (איור 1). CVMI מספק דרך מקורית להעביר את פפטידים, אשר צבירה בעת הזרקת כמבני β-גיליון ולעשות מאמץ רעילות. פפטידים מפוזרים באופן אחיד ברחבי המוח, פילוח האזור חדרית לאורך כל ציר rostro-סימטרית45. בנוסף, שיטה זו מאפשרת ניתוח התגובה מולקולרית מורפולוגיים של NSPCs במוח דג זברה בוגרת בעקבות תכלילים עמילואיד. מחקרים כאלה תספק לנו תובנה עבור תיקון מוצלח המוח ביונקים. השיטה שלנו יכול לשמש כדי להבין את המנגנון המולקולרי הכרחי של תגובה התחדשות מוצלחת אחרי לספירה תסמינים לזירוז חידוש המלאי של נוירונים לאיבוד שחזור פונקציונלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא הליך סטנדרטי שהוצעה על ידי המנחים של האיחוד האירופי (2010/63) החברה האירופית דגים מודלים בביולוגיה ורפואה (EuFishBioMed) ב קרלסרוה המכון של טכנולוגיה (קיט). כל השיטות המתוארות לאחר כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה (Landesdirektion דרזדן; מספר המסמך לך טלוויזיה-52/2015).

1. הכנה של פפטיד Aβ42

  1. Synthesize פפטידים (ראה טבלה 1) באמצעות הכימיה תקן 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) כמו הכימית צימוד על סינתיסייזר פפטיד מוצק-פאזי אוטומטיות 52. קנה המידה של הסינתזה היה 100 µmol.
  2. לטעון את סינתיסייזר פפטיד אוטומטית עם 500 מ ג של שרף המוגנים Fmoc כמו השלב מוצק (טעינה קיבולת של 0.2 mmol/g). לטעון את המומס המוגנים Fmoc חומצות אמינו בריכוז 0.5 M באמצעי האחסון הנדרשים, כפי שמחושבת עבור סינתיסייזר בהתאמה.
    הערה: החישובים נעשים כדי לאפשר צימוד של כל חומצת אמינו המוגנים Fmoc פעמיים עם 5 פעמים עודף של כל הבניין כדי שרף 47.
  3. לפזר את ריאגנטים הנדרשים עבור פפטיד סינתזה dimethlyformamide (DMF). לדוגמה, להכין activator, HBTU, בריכוז של 0.48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (הבסיס), ו-5% v/v אנהידריד אצטי (התערובת הגבלת התכיפות) וחוץ הקבוצות אמינו שאינן הגיבו.
  4. קליב כל פפטידים מן השרף ברציפות ערבוב של תמיכה מוצקה באמצעות תועמלן בתערובת המחשוף הטרי המורכב Trifluoroacetic חומצה (TFA): Triisopropylsilane(TIS): מים: Dithiothreitol (DTT) בגיל 90 (v/v): 5 (v/v): 2.5 (וי/v): 2.5 (m/v), עבור 4 h השתמש 10 מ"ל עבור היקף סינתזה 100 µmol.
  5. לזרז את המוצר cleaved על-ידי הוספת את התערובת המחשוף דיאתיל כקרח 100 מ. עוברים דרך יחידת סינון המכילה מסנן טפלון (PTFE) עם גודל הנקבוביות של 0.45 מיקרומטר, לשטוף עם 20 מ ל קרה כקרח דיאתיל אתר.
  6. לאסוף את פפטיד מסוננים נייר הסינון, להמיס 100 מ ג של פפטיד זירז ב 5 מ ל מים יונים מזוקקים: acetonitrile-1:1.
  7. Purify דרך הפוכה-פאזי בלחץ גבוה כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) ב- HPLC מפוח למחצה מצויד עמודה נקבוביים פוליסטירול divinylbenzene של חרוז בגודל 10 מיקרומטר.
    1. מראש בחום את העמודה ולתחזק ב 50 מעלות צלזיוס משתמש בעמודה חימום התקן. לאסוף את כל השברים הגדולים באמצעות אספן שבר אוטומטית על-ידי החלת מעבר הצבע מ- 5% על 100% ממס B מעל 25 דקות ב 4 מ"ל לדקה
      הערה: החומר הממיס הוא 0.1% TFA מים, הממס B הוא 0.1% TFA ב acetonitrile 52.
    2. לפקח על chromatogram-220 nm, לאסוף את הפסגות המתאים, ולנתח תוך שימוש LC-גב'
  8. אשר הטוהר על ידי הפוך אנליטית תלת פאזי גבוהה במיוחד לחץ נוזל כרומטוגרפיה (UPLC)-220 ננומטר על-ידי ניטור עם גלאי UV תוך העברת המדגם באמצעות עמודת סי18 אנליטי (חרוז בגודל 1.7 מיקרומטר). לאשר את המוצר פפטיד באמצעות ספקטרומטר מסה.
    הערה: UPLC זה משולב של ספקטרומטריית electrospray יינון ספקטרומטר מסה (ESI-MS), גלאי פאול טנדם.
  9. Lyophilize שברים הנכון של פפטיד הרצוי בבקבוקון התחתון עגול, על-ידי החלת ואקום של 0.052 mbar, אבקה רכות. כמה את משאבת ואקום ליחידה מקפיא ומתוחזק על חנות-78 מעלות צלזיוס ב- 80 ° C, ללא הגבלת זמן.
  10. שימוש של פפטיד lyophilized כדי להכין פתרון מניות של 1 מ מ בתערובת של acetonitrile: DMF: מים אנליטית כיתה ב- 1:1:1 על הניסויים. פתרון זה ניתן לאחסן במשך לפחות 6 חודשים, כמו פפטידים ולא צבורים בפתרון זה.

2. הכנת התערובת הזרקת

  1. להתכונן באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה 2 HPO 4, 2 מ מ ח' 2 PO 4, pH 7.4) דילול של פפטידים lyophilized.
  2. לפזר את פפטיד כדי ריכוז סופי של 20 מיקרומטר ב- PBS. להכין טרי פתרון זה. מערבבים היטב ולאחסן על הקרח עד הזריקה. לא יעלה על 30 דקות כדי למנוע צבירת בפתרון.

3. הרדמה

  1. הכן הפתרון מניות של הרדמה, 0.1% אתיל-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), במים רגילים דגים מלהסתובב המערכת. להכין את פתרון anaesthetization בריכוז סופי 0.0025% (v/v).
  2. להסיר את המספר הרצוי של דגים הטנקים שלהם לתוך מיכל להובלה עם 5 L של מערכת מים.
  3. חצי-מילוי פלסטיק פטרי (90 מ מ) עם 40 מ"ל הרדמה. שימוש זה מאכל לזריקות.
  4. דגירה הדג במשככי כאבים עד שחדל התנועה opercular.

4. Cerebroventricular Microinjection

  1. הכנה של מכשיר הזרקת
    1. הכן הזכוכית הזרקת נימים באמצעות של פולר מחט עם הפרמטרים הבאים: חימום מחזור, 537; מושך מחזור, 250; מהירות, 1.5 s; הפעם, גב' 80
    2. להביא את הגדרת לחץ על מקור הלחץ 25 psi.
    3. קבע את הפרמטרים microinjector הבאים: להחזיק לחץ 20 psi; הוצאת לחץ 10 psi; ערך תקופה 2.5 המגביל ערך 100 גב
    4. לטעון את נימי זכוכית עם הפתרון הזרקה. הכנס את נימי זכוכית בעל microinjection. לכוון את זווית הזריקה ° 45.
      הערה: פרוטוקולים מפורט יותר ניתן למצוא כפי שמתואר הפניות 27 , 46.
  2. מקום אחד דגים לתוך צלחת פטרי חדש מלא anaesthetization פתרון (כמו שלב 3.3).
  3. להחזיק את הדגים עם מלקחיים, אוריינט להזרקה.
  4. ליצור חתך באמצעות קצה מחט 30 גרם בתוך הגולגולת מעל tectum סיב אופטי שבו לפגוש שני לוחות לרוחב. לא להכניס את הטיפ רקמת המוח, זה יכול לגרום דימום ופגיעה. ראה הפניות 27 , 45 ,, 46, לפרטים נוספים-
  5. להוסיף את נימי זכוכית לתוך הסדק.
    1. להשתמש רק את קצה המחט, לא לחדור יותר מ 1 מ"מ דרך הגולגולת. תמשיך להחזיק את הדגים ולהוסיף קצה זכוכית נימי דרך החתך.
    2. אוריינט קצה זכוכית נימי לכיוון telencephalon בזווית של 45°. מזריקים µL 1 של הפתרון. הנוזל מפזר מיד לאחר ההזרקה.

5. שחזור

  1. המקום הדג בחזרה אל מיכל להובלה עד זה יחלים. להתחבר את המיכל המים דגים באופן קבוע במחזור כדי להבטיח איכות אופטימלית המים.
    הערה: ההתאוששות בדרך כלל צריך לקחת 1 דקות. אם זה לוקח יותר זמן, הדגים חייבים להיות כל הזמן את במשככי כאבים למשך זמן קצר יותר (זה צריך להיות מותאם על ידי הנסיין).

6. רקמות והכנה Sectioning

  1. להמתין תקופה הרצוי לפני להקריב את הדגים.
    הערה: זה תלוי השאלה ניסיוני. ניתן לראות בתצהיר עמילואיד מוקדם ככל 1 יום לאחר ההזרקה-
  2. להקריב את הדג באמצעות השיטה המתאימה בהתאם תקנות אתיות (למשל, מתייחסים הדג עם 0.1 M MESAB).
  3. לחתוך את. הגולגולת מעל tectum סיב אופטי באמצעות forcep הצביע על הצד הגבי, ומנתחים את הראש מאחוריו מקסימום באמצעות אזמל.
  4. את ראשי באמצעות 2% paraformaldehyde (PFA) בן לילה-4 ° C. השתמש 3 מ"ל של מחברים לראש צינור פלסטיק עם מכסה בורג.
    התראה: ללבוש ציוד מגן אישי המתאים את בעת טיפול PFA.
  5. עבור cryoprotection ו- decalcification, לשטוף את ראשי שלוש פעמים ב 0.1M מאגר פוספט (pH 7.4), ואז להעביר אותם לתוך 20% sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) פתרון, דגירה בין לילה ב-4 מעלות צלזיוס
  6. כדי להטביע את הרקמה לתוך חלוקתה שרף, להקפיא את ראשיהם בפתרון סוכרוז gelatin/20% 7.5% בהיסטולוגיה פלסטיק בתבניות על קרח יבש (כ 3-5 דקות כדי להקפיא גוש). לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס או להמשיך לשלב הבא (cryosectioning).
  7. סעיף ראשי לתוך 12 מיקרומטר עבה cryosections באמצעות cryostat כמו שמתואר 28 , 42. להעביר את cryosections ישירות על גבי מדרון זכוכית ולאחסן ב-20 ° C לשימוש לטווח ארוך-

7. נוגדן, מיקרוסקופ

הערה: ביצוע כל הצעדים הדגירה בתוך תא humidified. כל השלבים כביסה הם 10 דקות כל אחד.

  1. יבש הסעיפים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מפשיר, לשטוף את הסעיפים פעמיים ב- PBS ופעם ב- PBSTx (PBS 0.03% טריטון-X-100).
  2. Incubate עם נוגדן ראשוני (נוגדן anti-Aβ42; שבערך דילול ב- PBSTx) ב 4 ° C בלילה. בעקבות יום, לשטוף פעם ב- PBS פעמיים ב- PBSTx.
  3. דגירה הסעיפים עם הנוגדן המשני (זיהוי מצמידים פלורסצנטיות, שבערך דילול) יחד עם דאפי (1 μg/מ"ל) ב- PBSTx עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  4. שטיפת שלוש פעמים ב- PBSTx. לאחר השטיפה האחרונה לטעון את השקופיות עם coverslip שימוש 100 גליצרול 70% μL.
  5. ידרשו פלורסנט תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (לדוגמה עם 20 X PL APO נ. א 0.7 אובייקטיבית עם מגוון עירור 488, מסנן ירוק רגיל; איור 2) 39.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

HPLC שימש לטהר את פפטיד מסונתז, ספקטרומטר מסה שימש לאפיין את פפטידים β עמילואיד מטוהרים. העמודה HPLC היה מחומם ל 50 מעלות כדי לשפר את ההפרדה של פפטידים Aβ, נאספו כל השברים. כדי לזהות את פפטיד כראוי מסונתז, בוצע ניתוח לספקטרומטרית לשברים כל. Chromatogram UPLC מציג את הטוהר של המתחם. השבר HPLC הניב שיא אחד על UPLC (דהיינו, המסה נכונה לחייב יחס של פפטיד β עמילואיד נדרש) היה עיבוד נוסף לניסויים (איור 2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתן לשנות את פפטידים עמילואיד שיכלול וריאציות ברצף או תגיות שונות. למשל, מקושקשות פפטיד עמילואיד יכול להיווצר, פפטידים יכול להיות המסומנות בתגי פלורסנט-קצה אמיני של הסוף פפטיד או מתויג עם פפטידים נושאת39. באופן דומה, פרוטוקול זה, הינו פפטיד נושאת חודר לתא פפטיד TR בגלל היעילות שלו כדי תחבורה מטען עמוק לתוך רקמת המוח39. בנוסף, השיטה שלנו מאפשר הזרקת וניתוחים של פפטידים שונים שיכולים לגרום רעילים הצטברויות של50,51. ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי DZNE, האגודה הלמהולץ (VH-NG-1021), CRTD, ט ו דרזדן (FZ-111, 043_261518) ולאחר DFG (KI1524/6) (סי. קיי); על ידי לייבניץ ההתאגדות (ראה-2011-IPF-2) ו BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). כן נרצה להודות אולריקה הופמן פפטיד סינתזה, וכדי נאנדיני אשוקה, Prayag Murawala וטאנאקה אלי לעזרה במהלך הצילומים ההליך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצות אמינו מוגנות FmocIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)חומצות אמינו מבוססות Fmoc לסינתזה של פפטידים בשלב מוצק (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)אורוניום הקספלואורופוספט (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)RL-1030Activator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)RL-1180מדכא Racemization
N,N-DiisopropylethylamineIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)SOL-003בסיס
DimethylformamideIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, גרמניה)SOL-004ממס
N-MethylmorpholineThermo Fisher (Kandel) GmbH, גרמניהA12158בסיס
1-הידרוקסיבנזוטריאזול הידרט (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. ( סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)157260 ALDRICHActivator
PiperidineMERCK KGaA (דרמשטדט, גרמניה)822299מגיב הגנה מפני Fmoc
דיכלורמתאן (DCM)MERCK KGaA (דרמשטדט, גרמניה)106050
חומצה פורמית ממס (FA)MERCK KGaA (דרמשטדט, גרמניה)100264רכיב חיץ
לחומצה טריפלואורואצטית HPLC (TFA)MERCK KGaA ( דרמשטדט, גרמניה)808260מגיב תערובת Clevage
Triisopropylsilane (TIS)MERCK KGaA (דרמשטדט, גרמניה)233781 ALDRICHמגיב תערובת Clevage
אצטוניטריל (עבור UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1Lממס
אצטוניטריל (עבור HPLC)VWR International Ltd, אנגליה83639.320ממס
DiethyletherVWR International Ltd, אנגליה23811.326ממס למשקעי פפטיד
Dithiotritol (DTT)VWR International Ltd, אנגליה0281-25Gמגיב תערובת Clevage
TentaGel S RAM Fmoc זירת החלקה שרף אמידRapp Polymere GmbH (Tuebingen, גרמניה)S30023שלב מוצק
לסינתזה של פפטיד SPPS מזרקים 5 מ"ל עם מסננים כלוליםIntavis AG (קלן, גרמניה)34.274צינור תגובה ל-SPPS ולגובה ממסנן השלב המוצק
Polytetrafluoroethylene (PTFE)Sartorius Stedtim (Aubagne, France)11806-50-Nסינון של פפטידים משקעים
מסנן מזרק פוליווינילידנפלואוריד (PVDF)Carl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1סינון מקדים עבור HPLC
פפטיד סינתיסייזרIntavis, קלן, גרמניהResPep SLסינתיסייזר פפטיד אוטומטי בשלב מוצק
Water Alliance HPLCWaters, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"בWaters 2998, Waters e2695כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה בלחץ גבוה (HPLC)
PolymerX, גודל חרוז 10μ m, 250x10 מ"מPhenomenex Ltd. גרמניה00G-4328-N0פוליסטירן נקבובי divinylbenzene עמודת HPLC
Milli-Q Advantage A10, עם מסנן Milli-QEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, ארה"בLCPAK0001מערכת טיהור מים
יחידת סינוןSartorius Stedtim (Aubagne, צרפת)16307יחידת סינון למשקעי פפטיד
UPLC Aquity עם גלאיUVווטרס, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"בM09UPA 664Mאולטרה HPLC פאזה הפוכה אנליטית עבור LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, גודל חרוז 1.7 μ m, 50x2.1 מ"מווטרס, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"ב186002350אנליטי C18 עמודה
ACQUITY TQ גלאימים, מילפורד מסצ'וסטס, ארה"בQBB908ספקטרומטריית מסה יינון אלקטרוספריי (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD פלוס + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, גרמניה16706, 101542ליופילייזר עם משאבת ואקום
קורא צלחת פרדיגמהבקמן קולטר
MESAB (אתיל-m-אמינובנזואט מתאןסולפונאט)Sigma-AldrichA5040
צלחות פטריSarstedt821.472
תמיסת מלח חוצצת פוספטLife Technologies, GIBCO10010-056
מחטבקטון-דיקינסון305178
ניתוח מיקרוסקופאולימפוס, לייקה, Zeissמשתנה עם היצרן
Dumont TweezersWorld Precision Instruments501985
Gillies Dissecting LeverpsWorld Precision Instruments501265
נימי הזרקת זכוכיתWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
פנאומטי PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
תאורת טבעת; מדריך אור טבעתParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950

מקורות

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395(2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27(2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073(2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415(2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

עמילואיד בטא 42סינתזה של פפטידיםטכניקת מיקרו-הזרקהמיקרוסקופיה קונפוקליתתאי גזע עצבייםמודל למחלת אלצהיימרטיהור באמצעות HPLCפרוטוקול ליופיליזציהצביעה פלורסצנטית
מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.