הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56024

⸱

31 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine-Cardiology Division, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה איזופורמים התפתחה כמבדיל המדינה-of-the-art של סיבי השריר והשלד-סוג (קרי, סוג, הקלד IIA, הקלד IIX, הקלד IIB). כאן, אנו מציגים פרוטוקול מכתימים יחד עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן המקל על הערכה מהירה של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים.

תקציר

במשך שנים, היו הבחנות בין סוגי סיבי שריר השלד הטוב דמיינו ידי מכתימה צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase. לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סוג סיבים. מסוג I, הקלד IIA, הקלד IIX ו סיבים מסוג IIB עכשיו יכול להיות מזוהה עם דיוק בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC; עם זאת, ניתוח ידנית של נתונים אלו יכול להיות איטי ולא גמור מייגע. בהקשר זה, הערכה מהירה, מדויקת של סיבים מסוג הרכב מורפולוגיה הוא כלי מאוד רצוי. כאן, אנו מציגים עבור המדינה-of-the-art נוגדן של MyHCs בסעיפים קפוא המתקבל העכבר שריר hindlimb בהופעה עם אלגוריתם חצי אוטומטיות הרומן שמאיץ את ניתוח סיבים מסוג וסיבים מורפולוגיה של פרוטוקול. כצפוי, שריר הסוליה מוצג צביעת עבור מסוג I ו סיבים IIA, אך לא עבור סוג IIX או סוג סיבי IIB. מצד שני, שריר השוקה הקדמי היה ברובו מורכב סוג IIX ו- type IIB סיבים, חלק קטן של סוג IIA סיבים, מעט או ללא סוג סיבים. מספר תמונות המרות שימשו כדי ליצור מפות ההסתברות לצורך מדידת היבטים שונים של סיבים מורפולוגיה (קרי, שטח חתך הרוחב (CSA), קוטר Feret מקסימלית וללא מינימלי). הערכים שהתקבלו עבור פרמטרים אלו הושוו עם ערכים שהושג באופן ידני. אין הבדלים משמעותיים נצפו בין בכל מצב של ניתוח לגבי CSA, קוטר Feret מינימלי או מקסימלי (כל p > 0.05), המציין את הדיוק של שיטת שלנו. לפיכך, פרוטוקול הניתוח שלנו immunostaining ניתן להחיל את החקירה של השפעות על השריר הרכב דגמים רבים של הזדקנות, מיופתיה.

מבוא

זה כבר ידוע מזה זמן כי שרירי השלד מורכב של סיבי יחיד של סוגים רבים1. בתחילה, שתי קבוצות של סיבי מאופיינים על סמך מאפייניהם כויץ ו בשם, בהתאם, איטי עווית (סוג), במהירות עווית (סוג II). קטגוריות אלה היו מכובדים נוספים על בסיס סיבים חילוף החומרים. מאז סוג סיבים עשירים המיטוכונדריה, מסתמך על מטבוליזם חמצוני, הם היו הובהר על-ידי nicotinamide אדנין dinucleotide robustly חיובי-tetrazolium רדוקטאז (NADH-TR) diaphorase2 או succinate דהידרוגנאז (SDH)3 מכתים. לעומת זאת, סוג II סיבי הציג פחותה מעלות משתנה של NADH-TR diaphorase או SDH מכתים, חולקו לשתי תת-קבוצות במהירות עווית (מסוג IIA ו- IIB) במידה מסוימת בגסות על סמך קיבולות חמצוני היחסי שלהם. הבדלים אלו בין סיבי היה רוחי בצורה יעילה יותר על ידי צביעת צולבות הקישור חוטים שרירן-ATPase שבו סוג סיבים כתם כהה לאחר דגירה מראש ב- pH 4.0 ולקלוט מסוג IIB סיבי precipitate דגירה לפני הבא ב- pH 10.0 בסיבי IIA סוג צביעת intermediately4.

לאחרונה, נוגדן של צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה (MyHC) איזופורמים התפתחה מבדיל עדינה יותר של סיבים מסוג5. סוג אני, הקלד IIA, מסוג IIB סיבים ניתן כל לזהות בדייקנות בהתבסס על הפרופיל שלהם MyHC. בנוסף, במהירות עווית סמויה ביניים סיבים מסוג אחר, הקלד IIX, היה מזוהה6. סיבי היברידית לבטא MyHC אחד או יותר היו גם אושרו5,7,8. מינים מסוימים כגון החתול הבבון ידועים לא מסוג IIB MyHCs אקספרס6. למרות MyHC immunostaining הוא כעת הערכת המדינה-of-the-art הקומפוזיציה שריר, הניתוח של הנתונים שהושגו באמצעות טכניקה זו היא מסורבלת ולדרוש זמן רב ללא עזרה אוטומטית. לשם כך, קומץ בשיטות אוטומטיות למחצה כדי לנתח את הנתונים האלה כבר מפותחת5,9,10. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סטנדרטי יחסית לזיהוי immunohistochemical של סיבי השריר-סוג5,7,8,10, יחד עם רומן חצי אוטומטיות אלגוריתם שמאיץ את ניתוח של מורפולוגיה סיבים מסוג וסיבים עם דיוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בכל ההליכים הכרוכים עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו-Anschutz קמפוס מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה (91813(05)1D).

1. יום 1: ראשי (1°) Immunostaining עם חסימת שור אלבומין (BSA)

  1. Air-dry קפוא מקטעי שריר hindlimb העכבר (למשל, השוקתי הקדמי, הסוליה) רכוב על שקופיות טעונה ~ 30 דקות 11. לשרטט גבול סביב הסעיפים באמצעות עט PAP הידרופובי המכשול.
  2. המקום ~ µL 250 תמיסת מלח 5% BSA/פוספט buffered (BSA/PBS) בכל שקופית כדי לחסום נוגדן ספציפי שאינו מחייב. דגירה שקופיות בטמפרטורת החדר במשך ה 1
  3. תוך חסימת, להכין 1:50 דילולים של הנוגדן 1° supernatant ב 5% BSA/PBS (כל הם נוגדנים חד-שבטיים העכבר; ראה טבלה 1 6 , 12); להכין 250 µL של פתרון לכל שקופית. תמשיך 1° נוגדן מניות ואגרות דילולים קרח

figure-protocol-1
טבלה 1: נוגדנים העיקרי היה להבחין MyHCs.

  1. בעקבות השאיפה של הפתרון חסימה של BSA/PBS 5%, להוסיף 250 µL של 1° נוגדן דילול על השקופיות המתאים. להוסיף 250 שקופיות BSA/PBS משני (2°) נוגדן בלבד שליטה שלילי µL של 5%.
  2. Incubate ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות בסביבה לחה.
    הערה: צלחת פטרי יתעופף עם לחה מסנן נייר עשוי לשמש חדר מתאים הדגירה.

2. יום 2:2 ° Immunostaining עם פלורסנט נוגדנים

  1. תשאף 1° נוגדן פתרון או לשלוט פתרון BSA/PBS 5%. תשטוף הכל מחליק שלוש פעמים, 10 דקות עם 5% BSA.
  2. בעת הכביסה, להכין 1:200 דילולים של הנוגדנים מטוהרים, fluorophore מצומדת ° 2 ב- 5% BSA/PBS (ראה טבלה 2, כל הם העכבר נגד עז). להכין µL 250 של פתרון לכל שקופית. להחזיק 2° fluorophore מצומדת נוגדנים בחשכה על קרח

figure-protocol-2
בטבלה 2: נוגדנים משניים Fluorophore מצומדת נהגו להמחיש העיקרי נוגדן זיהוי של MyHCs.

  1. בעקבות השאיפה של היישום השלישי של 5% BSA/PBS פתרון חסימה, להוסיף 250 µL של דילול נוגדן 2° על כל השקופיות. תקופת דגירה של 90 דקות בטמפרטורת החדר בסביבה האפל, הלח.
  2. וביופסיה 2° נוגדן פתרון. תשטוף הכל מחליק שלוש פעמים, 10 דקות עם 5% BSA/PBS.
  3. שטיפה עם PBS. להתייבש במשך 10 דקות
  4. הר את coverglass עם מדיום הרכבה מימית לא קבועים, צמיגות נמוכה.
  5. כאשר יבש, לאטום את הקצוות שקופיות עם לק. יבש ואחסן slidebox האפל.

3. הדמיה שקופיות עם מיקרוסקופ Epifluorescence

  1. לנקות את השקופיות עם קטן, 70% ספוג אתנול מעבדה-מחיקה.
  2. קבל תמונות דיגיטליות סעיפים שריר immunostained באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד עם מנגנון הצילום (ראה את הטבלה של חומרים).
    1. בחר אזור של 1 מ 2 (10 X אובייקטיבי, נה 1.4).
    2. תצוגה מצומדת אלקסה 488 ° 2 פלורסצנטיות נוגדנים דרך 505 ננומטר מסנן לעבור זמן. להציג את קרינה פלואורסצנטית שנוצר על ידי עירור של אלקסה 594-מצומדת ° 2 נוגדנים דרך מסנן פס ארוך 595 nm. דיגיטייז תמונות עם מחשב PC עם תוכנת הדמיה תואם. כולל את בר בקנה מידה של הדמיה תוכנה לניתוח בשלב מאוחר יותר.

4. ניתוח של תמונות עם פיג'י

הערה: לפני שתמשיך עם ניתוח, פיג'י (זמין באופן חופשי של מכוני הבריאות הלאומיים, בת'סדה, מרילנד) חייב להיות מותקן באמצעות https://imagej.net/Fiji/Downloads. כמו כן, המאקרו המשמשים בתהליך הזה מסופק קובץ משלים. מקם את קובץ המאקרו במדריך נגיש.

  1. טען brightfield תמונה של המקטע הנבחר בפיג'י. נווט אל תוספים → פילוח → פילוח לומד מהר קודם ל-
  2. על מנת מתנים האזורים הסלולר של המקטע, למתוח קו על בד, ולחץ " להוסיף מחלקה 1 ". לאחר מכן, צייר קו על השטח בין סיבי, ולחץ " להוסיף לשיעור 2 " כדי לסמן על התחומים חוץ-תאית. חזור עד ישנם 5-10 תוויות בכל כיתה.
    1. לחץ על הרכבת המסווג. על וכתוצאה מכך אדום וירוק הכיסוי, להוסיף תוויות יותר באופן ידני (ראה שלב 4.2) לחתיכות באופן שגוי מקוטע של התמונה, במידת הצורך. חזור עד סיבים (אדום) מופרדים כראוי הרווח בין סיבים (ירוק)-
  3. לחץ על " ההסתברות לקבל " ולשמור את התמונה בתיקיה החדשה שכותרתו.
  4. חזור על הפעולות לעיל (שלבים 4.2-4.3) עם התמונה פלורסנט שנלקחו באותו השדה. תווית סיבי immunostained כמו " מחלקה 1 " ואת כל האיזורים הלא-פלורסנט כמו " מחלקה 2 ". לשמור את מפת הסתברות שנוצר באותה תיקיה שבה מאוחסן התמונה brightfield מעובד.
  5. פתח את אחת ממפות שנשמר קודם לכן ההסתברות בפיג'י. לצייר קו ישר על הבר סולם המסופקים על ידי תוכנת הדמיה. . לך לנתח → לקבוע קנה מידה. לשנות את הפרמטרים (קרי, מרחק ידוע, יחידת אורך) לערכים המתאימים שלהם כפי שהוצגה על ידי סרגל קנה מידה ולאחר מכן בדוק " Global " תיבת לתקנן את קנה המידה עבור כל תמונה.
  6. נווט אל תוספים → מאקרו → לרוץ → Tyagi et al. סיבים כמת macro.ijm (ראה קובץ משלים). . מיד, תופיע חלונית הניווט. פתחו את התמונה ' s מארח תיקיה; תיבת דו-שיח תופיע. עבור כל תיבת דו-שיח, לשנות " רקע " ערך רשימה נפתחת כדי " האור. "
    הערה: התיקיה עכשיו יאוכלסו עם תמונות של קווי המתאר סיבים וקבצים תוכנת הגיליון האלקטרוני של התוצאות (קוטר CSA, Feret הם הכי יקר לכימות סיבים מורפולוגיה; פרמטרים נמדד ניתן להתאים במדידות לנתח הגדר). סיבים מורפולוגיה נתונים שנוצרו על-ידי הפונקציה נקבובית-אנליזה של פיג'י יועברו באופן אוטומטי לקבצים תוכנת הגיליון האלקטרוני עבור שתי תמונות שדה פלורסנט ובהיר.
  7. לחשב את השבר של סיבי לבטא MyHC נתונה בשדה על-ידי חלוקת מספר סיבים פלורסנט בשטח על ידי מספר סיבים הכולל בתמונה בהירים השדה התואם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השרירים Hindlimb (קרי, השוקתי הקדמי, הסוליה) גזור מן עכבר C57BL/6 זכרים בגיל לא ידוע היו פלאש קפוא ידי שוקע כייר פלסטיק המכיל את השריר ב אוקטובר במתחם איזופנטאן מקורר חנקן נוזלי. לאחר מכן, משתמש cryotome, 8-10 מיקרומטר מקטעים טורי היו ב-20 ° C גזורה הועבר שקופיות זכוכית שונים מפרוטונים שמטענם12.

בחרנו השוקתי הקדמי, הסוליה כי אלה השרירים מורכבים בעיקר סיבי fast - ו איטי עווית, בהתאמה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

. הנה, סיפקנו כיוון שימושי לצורך זיהוי סוגי סיבי שריר השלד. בעשותו כן, נתאר באלגוריתם הרומן לניתוח הנתונים.

מאז התוצאות שלנו במידה רבה לאשר את אלה של דוחות קודמים5,8,10 , משקפים משלנו מדידות ידניות, האלגוריתם מופיע לדייק. ובכל זאת, נתקלנו כמה מלכודות ניסיוני נדירים כולל גבולות ברורים סיבים הנובע חלוקתה החפץ. ניתן למזער את ההשפעה של לכלוכים אלה באמצעות חלוקתה זהירה ובחינה על המשמר של המקטע מעובד לפני נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש אינטרסים סותרים לא לחשוף.

תודות

. אנחנו אסירי תודה קרן Boettcher, האגודה נוירודגנרטיביות (#17-II-344) על תמיכתם של מחקר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר אלבומיןסיגמא אולדריץ'A9418-100G5%
במעבדת מכשיריםמדעיים של PBS מחסום הידרופובי9804-02
מיקרוסקופ שקופיותגלובוס מדעי1358W
CoverglassFisher Scientific12-544-E
ImmumountThermo Scientific9990402
לק לציפורנייםלוריאל
ניקון אקליפס TE-200 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך וברייטפילדהופסק SPOT
1:50
נוגדנים ראשונייםבנק היברידומה באוניברסיטת איווהעכבר חד שבטי IgG1; 1:50
BF-F3מחקרי התפתחות נוגדנים ראשוניים בנק היברידומה באוניברסיטת איווהעכבר חד שבטי IgGM; 1:50
נוגדנים ראשונייםבנק היברידומה באוניברסיטת איווהעכבר חד שבטי IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2bInvitrogenA21145נגד עכבר; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1InvitrogenA21121עז נגד עכבר; 1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGMInvitrogenA21044עז נגד עכבר; 1:200
OCTSakura Finetek4583
איזופנטןפישר סיינטיפיקO3551-4מגניב עם חנקן liguid
PBSפישר ביוריאגנטיםBP665-110x, מדלל ל-1x
מגבוני קיםקימברלי-קלארק06-666A
RT/KE SPOT IMAGING SOLUTIONS RT940 Dell Optiplex BA-F8 מחקרי התפתחות נוגדנים ראשוניים בנק היברידומה באוניברסיטת איווה עכבר חד שבטי IgG2b;SC-71 מחקרי התפתחות6H1 מחקרי התפתחות

מקורות

  1. Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
  3. Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
  4. Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
  5. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
  6. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
  7. Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
  8. Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
  9. Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
  10. Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254(2014).
  11. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
  12. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
  13. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  14. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  15. Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

סוג סיבי שריר שלדשרשרת כבדה של מיוזיןצביעה אימונוהיסטוכימיתמורפולוגיה של סיביםשטח חתך רחבקוטר פרט (Feret Diameter)שריר גפה אחורית של עכברמפות הסתברותתוכנת Fiji
ניתוח חצי אוטומטי של מורפולוגיה שרירי השלד העכבר והרכב סיבים מסוג
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.