Method Article

חילוץ מדגם, כימות כרומטוגרפי סימולטני של דוקסורוביצין, מיטומיצין C שלאחר משלוח סמים בשילוב של חלקיקים נושאות לעכברים

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר תהליך אנליטי יעיל ונוח של חילוץ מדגם ונחישות סימולטני של סמים מרובים, דוקסורוביצין (DOX), מיטומיצין C (MMC), מטבוליט רעיל אירובי DOX, doxorubicinol (DOXol), בהביולוגי דוגמאות של המודל הגידול השד פרה שטופלו nanoparticle ניסוחים שילוב סינרגטי סמים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימותרפיה בשילוב נעשה שימוש תכוף במרפאה לטיפול בסרטן; עם זאת, תופעות לוואי המשויך אל הרקמות עלולה להגביל על התועלת טיפולית. שילוב תרופה מבוססי ננו-חלקיק הוכח להקל על הבעיות בהם נתקלים שילוב תרופתי חינם. מחקרים קודמים שלנו יש מראה כי השילוב של שתי תרופות נגד סרטן, דוקסורוביצין (DOX) ו מיטומיצין C (MMC), הפיק אפקט סינרגיסטי נגד שני מאתר, סרטן השד אנושי תאי במבחנה. DOX ו- MMC פולימרים טעונים שיתוף-השומנים היברידית חלקיקים (DMPLN) עקף משאבות טרנספורטר שונות בזרימת המקנים עמידות multidrug והיעילות משופרת והפגינו במודלים הגידול השד. לעומת פתרון קונבנציונאלי צורות, כגון יעילות מעולה של DMPLN יוחס את פרמקוקינטיקה מסונכרן DOX. MMC ואת הזמינות הביולוגית מוגברת סמים תאיים בתוך תאים סרטניים מופעל על-ידי nanocarrier PLN.

כדי להעריך את פרמקוקינטיקה והפצה ביו-של שיתוף מנוהל DOX ו- MMC פתרון חינם והן nanoparticle טפסים, שיטה פשוטה ויעילה ניתוח סמים רב באמצעות ביצועים גבוהים הפוכה-פאזי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) היה פיתח. בניגוד לשיטות שדווחה בעבר לנתח DOX או MMC בנפרד ב הפלזמה, שיטה זו-hplc, קורס חדש הוא מסוגל בו זמנית quantitate DOX, MMC ורעיל סיבולת לב ריאה DOX מטבוליט מרכזי, doxorubicinol (DOXol), במטריצות ביולוגיים שונים ( למשל, דם, סרטן השד, לב). Methylumbelliferone 4 בדיקה סופג כפול פלורסנט, אולטרה סגול (4-MU) שימש תקן פנימי (I.S.) לגילוי בשלב אחד של ניתוח הסם מרובים עם אורכי גל שונים לזיהוי. שיטה זו הוחלה בהצלחה כדי לקבוע את ריכוזי DOX MMC מועברים על ידי גישות nanoparticle וגם פתרון בדם כל ורקמות שונים מודל מאתר הגידול השד של orthotopic. השיטה האנליטית המובאת הוא כלי שימושי עבור ניתוח קליניים מבוססי ננו-חלקיק משלוח של שילובים תרופתיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימותרפיה היא הטיפול היסודי מודאליות עבור סרטן רבים זה קשורה לעיתים קרובות עם תופעות לוואי חמורות, יעילות מוגבלת עקב עמידות לתרופות, אחרים גורמים1,2,3. כדי לשפר את התוצאה של כימותרפיה, סמים בשילוב משטרי הוחלו במרפאה בהתבסס על שיקולים כגון רעילות שאינם חופפים, מנגנונים שונים של פעולה סמים, סמים-צלב ההתנגדות4,5 , 6. בניסויים קליניים, קצב התגובה גידול טוב יותר לעיתים קרובות נצפתה באמצעות בו-זמנית מנוהל שילובים תרופתיים לעומת משטר של סמים רציפים משלוח7,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויים בבעלי חיים היו שאושרו על-ידי חיה טיפול הוועדה של אוניברסיטת בריאות ברשת במכון הסרטן אונטריו, לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים-

1. ביולוגי הכנת הדוגמא

  1. לאסוף את כל הדם, האיברים העיקריים, ותצמידו הגידול בנקודות מראש זמן-לאחר מינהל תוך ורידית (עירוי) המכילים תרופות פורמולציות (למשל, DMPLN, liposomal DOX)
    1. להזריק עירוי נושאות העכבר של השד עם ניסוח מוכן המכיל סמים.
    2. עזים ומתנגד העכבר הזמן המיועד-נקודות (למשל, 15 דקות) על ידי מתן איזופלוריין 2% נשימים בחדר אטום.
    3. הנח את העכבר anesthetized על גבו, שים את האף שלו דרך nosepiece המספק כל הזמן 2% איזופלוריין....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתי תרופות נגד סרטן, DOX MMC, כמו גם של המטבוליט DOX, DOXol, התגלו בו זמנית בלי התערבות ביולוגי באותו יישומית הדרגתיות HPLC בתנאי שימוש 4-MU I.S. עבור קרינה פלואורסצנטית והן גלאי UV. DOX, MMC, DOXol ו- 4-MU היו היטב מופרדים אחד מהשני עם השמירה פעמים של 5.7 מינימום עבור MMC, מין 10.4 עבור DOXol, 10.9 דקות עבור 4-MU ו- 11.1 דקות עבור DOX (איור 2). כל תרופה על כל הדם ורקמות שונים הראו ריכוז ליניאריות עם מקדמי המתאם (R2) ועד 0.98 1.00 (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעומת שאר שיטות כרומטוגרפיות המאפשרים הגילוי של זן סמים אחד בכל פעם, פרוטוקול HPLC הנוכחי הוא מסוגל בו זמנית quantitate שלוש תרכובות סמים (DOX, MMC ו- DOXol) המטריצה הביולוגי אותו ללא צורך לשנות השלב ניידים. שיטה זו הכנה וניתוח יושם בהצלחה כדי לקבוע את פרמקוקינטיקה, ביו-והפצה של שתי מערכות משלוח סמים מבוססי ננו-חלקיק (קרי, liposomal DOX ו DMPLN)22. מאז חלקיקים PEGylated להאריך את מחזור מערכתי של הסם שנטען כתוצאה בריכוז התרופה בדם גבוהה על פני תקופה ארוכה של זמן (> 24 שעות בימ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים בהכרת תודה לאשר את המענק ציוד מדעי הטבע, הנדסה מחקר (NSERC) המועצה של קנדה לבדיקות, המענק ההפעלה של המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), למחקר סרטן השד קנדי (CBCR) הברית X.Y. וו, המלגה אוניברסיטת טורונטו זאנג R.X., ג'אנג טי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דוקסורוביצין Polymed Theraeutics111023תרופה אנטי סרטנית
Mitomycin CPolymed Theraeutics060814תרופה אנטי סרטנית
Doxorubicinol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020מטבוליט של מלח נתרן DOX
4-Methylumbelliferone Sigma-AldrichM1508
חומצה מיריסטיתSigma-Aldrich544-63-8   חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
פוליאוקסיאתילן (100)ספקטרוםM1402חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
פוליאוקסיאתילן (40) סטארטסיגמא-אולדריץ'P3440חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
אולטרסאונד (UP100H)Hielscher, טכנולוגיית אולטרסאונדNA הכנת ננו-חלקיקים
אמבט מים (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNAהכנת ננו-חלקיקים
ליפוזומלי דוקסורוביצין  (קייליקס)Janssenנרכש מבית המרקחת בית החולים הנסיכה מרגרטניסוח ננו-חלקיקים מאושר קלינית 
מתנולקלדון כימיקלים6701-7-40HPLC הרכב פאזה ניידת
HPLC מדורג HPLC H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC הרכב פאזה נייד
HPLC אצטוניטריל Caledon Chemicals1401-7-40הרכב פאזה ניידת HPLC
חומצה טריפלואורואצטית חומצה סיגמא-אולדריץ'302031הרכב פאזה ניידת HPLC
0.45 μ m נייר סינון ממברנה ניילוןWhatmanWHA7404004HPLC הכנת שלב נייד
1cc מזרקי פלסטיקBecton, Dickinson and Company2606-309659הזרקת טיפול
5cc מזרקי פלסטיקBecton, Dickinson and Company2608-309646אוספי רקמות
30G 1/2 מחטיםBecton, Dickinson and Company305106הזרקת טיפול
25 גרם 5/8 מחטיםבקטון, דיקינסון ושות305122 קולקציות רקמות סטריליות
0.9% מי מלחאוניברסיטת טורונטו האוס מותג1011זילוף רקמות
13 מ"ל צינור חרוטי תחתון מעוגל SARSTEDT62.515.006פרוליפרולן, הומוגניזציה של רקמות
מדיום חיוני אלפא מינימלי (MEM) Gibco12571063Cell medium
1 x Phosphate Buffer SaltGibco10010023הומוגניזציה של רקמות
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLהומוגניזציה של רקמות
חומצה פורמיתCaledon Chemicals1/5/3840התאם את ה-pH למיצוי ממס
נתרן הפרין צינורות פלסטיק מרוססיםBecton, Dickinson and Company367878איסוף דם
מאזן שקילה אנליטי סרטוריוס CPA225Dמד pH NA
 פישר סיינטיפיק13-637-671accumet
BASIC מערבולת מיקסטרפישר סיינטיפיק02-215-365דגימות מערבולת במהירות הרצויה
1.5 מ"ל  צינור מיקרוצנטריפוגהפישרברנד2043-05408129הומוגנייזר פרוליפרולן
דגם 1000פישר סיינטיפיק08-451-672הומוגניזציה של רקמות
5702REppendorf5702Rהכנת מיצוי
מערכת מאייד מחוממתGlas-ColNAמדגם מחדש
בקבוקוני הברגה HPLCDIKMA5320הזרקת מדגם HPLC
מכסי בורג HPLC עם PTFE לבן סיליקון מחיצהDIKMA5325HPLC הזרקת
מדגם HPLC תוספת פוליפרופילן   Agilent Technologies5182-0549נפח מקסימלי 250 μ l, הזרקת דגימה HPLC
Xbridge C18 ColumnWaters Corporation186003117ניתוח תרופות
משאבת שיפוע תאגיד ווטרסW600ניתוח תרופות
דגימה אוטומטיתווטרס קורפוריישןW2707ניתוח תרופות
גלאי מערך פוטודיודה תאגיד ווטרסW2998ניתוח תרופות
מולטי &למבדה; גלאי פלואורסנס תאגיד ווטרסW2475ניתוח תרופות
EMPOWER 2תאגיד ווטרסNAתוכנת ניתוח נתונים
מדעןMicromathNAניתוח פרמקוקינטי
נקבה Balb/c עכברימעבדת ג'קסון001026In vivo
EMT6/WT תאי סרטן שדמסופקים על ידי ד"ר איאן טנוק; מכון הסרטן של אונטריוNAIn vivo
סטנדרטית פנימית סטארט ' צנטריפוגה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles