Method Article

חילוץ מדגם, כימות כרומטוגרפי סימולטני של דוקסורוביצין, מיטומיצין C שלאחר משלוח סמים בשילוב של חלקיקים נושאות לעכברים

DOI:

10.3791/56159

⸱

October 5th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Toronto, 2Departments of Medical Biophysics and Radiation Oncology, University of Toronto, Ontario Cancer Institute, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר תהליך אנליטי יעיל ונוח של חילוץ מדגם ונחישות סימולטני של סמים מרובים, דוקסורוביצין (DOX), מיטומיצין C (MMC), מטבוליט רעיל אירובי DOX, doxorubicinol (DOXol), בהביולוגי דוגמאות של המודל הגידול השד פרה שטופלו nanoparticle ניסוחים שילוב סינרגטי סמים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימותרפיה בשילוב נעשה שימוש תכוף במרפאה לטיפול בסרטן; עם זאת, תופעות לוואי המשויך אל הרקמות עלולה להגביל על התועלת טיפולית. שילוב תרופה מבוססי ננו-חלקיק הוכח להקל על הבעיות בהם נתקלים שילוב תרופתי חינם. מחקרים קודמים שלנו יש מראה כי השילוב של שתי תרופות נגד סרטן, דוקסורוביצין (DOX) ו מיטומיצין C (MMC), הפיק אפקט סינרגיסטי נגד שני מאתר, סרטן השד אנושי תאי במבחנה. DOX ו- MMC פולימרים טעונים שיתוף-השומנים היברידית חלקיקים (DMPLN) עקף משאבות טרנספורטר שונות בזרימת המקנים עמידות multidrug והיעילות משופרת והפגינו במודלים הגידול השד. לעומת פתרון קונבנציונאלי צורות, כגון יעילות מעולה של DMPLN יוחס את פרמקוקינטיקה מסונכרן DOX. MMC ואת הזמינות הביולוגית מוגברת סמים תאיים בתוך תאים סרטניים מופעל על-ידי nanocarrier PLN.

כדי להעריך את פרמקוקינטיקה והפצה ביו-של שיתוף מנוהל DOX ו- MMC פתרון חינם והן nanoparticle טפסים, שיטה פשוטה ויעילה ניתוח סמים רב באמצעות ביצועים גבוהים הפוכה-פאזי כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) היה פיתח. בניגוד לשיטות שדווחה בעבר לנתח DOX או MMC בנפרד ב הפלזמה, שיטה זו-hplc, קורס חדש הוא מסוגל בו זמנית quantitate DOX, MMC ורעיל סיבולת לב ריאה DOX מטבוליט מרכזי, doxorubicinol (DOXol), במטריצות ביולוגיים שונים ( למשל, דם, סרטן השד, לב). Methylumbelliferone 4 בדיקה סופג כפול פלורסנט, אולטרה סגול (4-MU) שימש תקן פנימי (I.S.) לגילוי בשלב אחד של ניתוח הסם מרובים עם אורכי גל שונים לזיהוי. שיטה זו הוחלה בהצלחה כדי לקבוע את ריכוזי DOX MMC מועברים על ידי גישות nanoparticle וגם פתרון בדם כל ורקמות שונים מודל מאתר הגידול השד של orthotopic. השיטה האנליטית המובאת הוא כלי שימושי עבור ניתוח קליניים מבוססי ננו-חלקיק משלוח של שילובים תרופתיים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימותרפיה היא הטיפול היסודי מודאליות עבור סרטן רבים זה קשורה לעיתים קרובות עם תופעות לוואי חמורות, יעילות מוגבלת עקב עמידות לתרופות, אחרים גורמים1,2,3. כדי לשפר את התוצאה של כימותרפיה, סמים בשילוב משטרי הוחלו במרפאה בהתבסס על שיקולים כגון רעילות שאינם חופפים, מנגנונים שונים של פעולה סמים, סמים-צלב ההתנגדות4,5 , 6. בניסויים קליניים, קצב התגובה גידול טוב יותר לעיתים קרובות נצפתה באמצעות בו-זמנית מנוהל שילובים תרופתיים לעומת משטר של סמים רציפים משלוח7,8. עם זאת, בשל תת אופטימלית ביו-הפצת סמים חינם טפסים, הזרקת בו זמנית של מספר תרופות יכול לגרום לרעילות הרקמות בולט זה עולה10,9,את האפקט הטיפולי11. תרופות מבוססות Nanocarrier הוכח לשנות את פרמקוקינטיקה, ביו-והפצה של תרופות שעברו אנקפסולציה, שיפור, ממוקדות הגידול הצטברות12,13,14. כפי שנסקרו במאמרים האחרונים שלנו, חלקיקים נטען במשותף עם שילובים תרופתיים סינרגטי הפגינו יכולת להקל על הבעיות בהם נתקלים שילובים תרופתיים חינם, עקב שלהם מבוקרת הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית שיתוף מסירת תרופות מרובות רקמת הגידול, הפעלת אפקטים סמים סינרגטי נגד סרטן תאים4,15,16. כתוצאה מכך, יעילות טיפולית מעולה ורעילות נמוכה הוכחו בשני מחקרים פרה-קליניים ומחקרים קליניים4,17,18.

שלנו במבחנה מחקרים קודמים מצאו כי השילוב של שתי תרופות נגד סרטן, דוקסורוביצין (DOX) ו מיטומיצין C (MMC), המיוצר אפקט סינרגיסטי נגד מספר שורות תאים של סרטן השד וטעינה, יתרה מזאת, משותף DOX ו- MMC בתוך פולימר-השומנים היברידית חלקיקים (DMPLN) התגבר על שונות בזרימת המשויך עמידים בפני התרופה מרובה משאבות (למשל, P-גליקופרוטאין, חלבון עמיד סרטן השד)19,20,21. In vivo, DMPLN זמין המרחבית-טמפורלית מסירת שיתוף DOX ו- MMC לאתרי הגידול ואת הזמינות הביולוגית מוגברת של סמים בתוך תאי סרטן, כמצוין על-ידי צמצום של היווצרות של doxorubicinol (DOXol) מטבוליט22DOX. כתוצאה מכך, DMPLN משופרת גידול התא אפופטוזיס, עיכוב בצמיחה הגידול והישרדות מארח ממושך בהשוואה חינם לשילוב DOX של MMC או liposomal DOX ניסוח22,23,24, 25.

ניתוח הכמות בפועל של סמים מועברים במשותף על ידי nanocarrier הוא קריטי עבור תכנון יעיל nanoparticle ניסוחים. שיטות רבות פותחו כדי לנתח את רמת פלזמה של מינונים DOX או MMC יחיד באמצעות ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) לבד או בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. עם זאת, שיטות אלה הם לעיתים קרובות מעשי עבור טיפול משולב ועתירת כמו מספר גדול של דגימות ביולוגיות צריכים להיות מוכנים בנפרד לניתוח של תרופות מרובות (כולל לפעמים מטבוליטים סמים). בנוסף הכריכה חלבון חזקה פלזמה של DOX ו- MMC, תאי דם אדומים יש גם יכולת עצומה לאגד ולרכז תרופות נגד סרטן רבים35,36. לפיכך, ניתוח פלזמה DOX או MMC עשויים שמאפילים על פסי דם בפועל סמים ריכוזים. העבודה הנוכחית (איור 1) מתאר פשוטה וחזק מרובים שיטת ניתוח סמים באמצעות היפוך פאזה HPLC כדי לחלץ בו זמנית quantitate DOX, MMC ו- doxorubicinol מטבוליט DOX (DOXol) של דם ורקמות שונות ( למשל, גידולים). זה יושם בהצלחה כדי לקבוע את פרמקוקינטיקה ואת ביו-חלוקת DOX MMC, כמו גם היווצרות של DOXol לאחר משלוח סמים באמצעות פתרונות חינם או טפסים ננו-חלקיק (קרי, DMPLN ו- liposomal DOX) ב- orthotopically מושתל דגם העכבר מאתר הגידול השד לאחר תוך ורידית (עירוי) הזרקה22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויים בבעלי חיים היו שאושרו על-ידי חיה טיפול הוועדה של אוניברסיטת בריאות ברשת במכון הסרטן אונטריו, לפי המועצה הקנדית על הנחיות טיפול בעלי חיים-

1. ביולוגי הכנת הדוגמא

  1. לאסוף את כל הדם, האיברים העיקריים, ותצמידו הגידול בנקודות מראש זמן-לאחר מינהל תוך ורידית (עירוי) המכילים תרופות פורמולציות (למשל, DMPLN, liposomal DOX)
    1. להזריק עירוי נושאות העכבר של השד עם ניסוח מוכן המכיל סמים.
    2. עזים ומתנגד העכבר הזמן המיועד-נקודות (למשל, 15 דקות) על ידי מתן איזופלוריין 2% נשימים בחדר אטום.
    3. הנח את העכבר anesthetized על גבו, שים את האף שלו דרך nosepiece המספק כל הזמן 2% איזופלוריין.
      הערה: כדי להבטיח העכבר עובר הרדמה עמוקה, בעדינות לצבוט פור איבריו של העכבר על המראה עבור כל תנועה עוויתות.
    4. ניקוי יסודי אזורי החזה והבטן באמצעות אתנול 70% ולאחר מכן לבצע הליך מסוף פנצ'רים הלב על העכברים anesthetized עמוק באמצעות מזרק heparinized 1 mL מחט 23 גרם-
    5. לאסוף כל הדם לתוך נתרן שכותרתו הפארין ריסס שפופרת פלסטיק ו מערבולת בעדינות את הצינור כדי להבטיח דם שנאספו בא במגע עם הפרין מצופה של הקיר שפופרת. לאסוף מינימום של 50 µL של דם מלא. תמיד שומרים את הדגימות על קרח
    6. להקליט את כל ארבעת הגפיים של העכבר כדי לאבטח אותו ולפתוח את חלל הבטן ואת בית החזה של העכבר באמצעות זוג מלקחיים ומספריים. משמרת את המעיים לצד ודחף את הכבד כלפי מעלה כדי מספיק לחשוף את וריד שער הכבד. לחתוך וריד שער הכבד ניקוז דם.
    7. Perfuse העכבר כל הגוף עם 50 מ ל תמיסת 0.9% קר כקרח דרך הלב באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 25 גרם-
      הערה: לכופף את המחט ב- 90° עבור המנחה את המזרק לתוך וריד שער הכבד.
      8. סדר
    8. בלו האיברים הבאים: לב, ריאות, כבד, טחול, כליות. לאחר מכן, להפריד את הגידול השד רקמות מסביב בעזרת זוג מספריים החתך משטח שומן החלב נכון של העכבר. לאסוף את כל האיברים בנפרד לתוך צינורות פוליפרופילן 1.5 mL ולהקפיא אותן במהירות בחנקן נוזלי.
      ​ הערה: להפריד את כיס המרה מהכבד.
    9. לאחסן את כל. הדם 4 ° C ורקמות נכרת במקפיא-80 ° C עד ניתחה HPLC.
  2. DOX לחלץ, MMC ו- DOXol של מטריצות ביולוגי.
    1. שוקל כל רקמות ביתור קפוא במהירות ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי התחתון מעוגל מ"ל 13. כדי למנוע את חילוף החומרים סמים אפשריות או השפלה, שומרים את הדגימות על קרח
    2. להוסיף 1-5 מ של מאגר פירוק התא קר כקרח לתוך הצינור.
      הערה: הנפח של מאגר להשתמש תלוי משקל הרקמה המבוסס על יחס רקמות-מאגר של ז' 1: 5 מ"ל (w/v); עבור איברים קטנים, כגון הלב, הטחול, היחס הוא ז' 1: 2 מ"ל.
    3. השתמש תנועה מעלה-מטה שבץ כדי homogenize את דגימות רקמה על הקרח במהירות של 18,000 סל ד באמצעות מהמגן יד חשמלי של.
      הערה: המגון שהושלמו דורש כ 3 עד 5 חזרות של תהליך המגון קצרה של פחות מ- 15 s, ואחריו רקמות קירור מעל הקרח בין כל המגון קצר.
    4. לרחוץ את המכשיר מחולל שיני המסור 10 מ מ מהמגן עם מזוקקים יונים (DDI) H 2 O, 70% אתנול, ולאחר מכן DDI H 2 O בין כל דגימה רקמה כדי למנוע זיהום צולב.
      5. µL
    5. µL 50 העברה של רקמת homogenate או דם מלא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 mL ספייק עם 5 של פנימי רגיל (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) לתוך הצינור.
      הערה: פתרון 4-MU הוכן בשנת מתנול כאן.
    6. 250 להוסיף µL החומר הממיס החילוץ כקרח לתוך הצינור המכילים דם מלא או רקמות homogenate.
      הערה: הממס חילוץ מורכב של 60% acetonitrile (לחצן מצוקה) ו- 40% אמוניום אצטט (5 מ"מ) עם pH להתאים ל- pH = 3.5 באמצעות חומצה פורמית 0.05%. להשתמש במדגם (v/v) 1:5: חילוץ הממס יחס נפח.
    7. נמרצות מערבולת התערובת למשך 2 דקות, צנטריפוגה, ב-3,000 x כוח g ב 4 o C עבור 10 דקות ו- pipet 200 µL supernatant לתוך צינור אחר מיקרו-צנטריפוגה טרום מקורר טריים.
    8. תגובת שיקוע Evaporate ב 60 מעלות צלזיוס תחת זרם איטי של גז חנקן עם הגנה מפני האור.
    9. לשקם את שאריות מיובשים עם 100 µL של מתנול קר כקרח, נמרצות מערבולת עבור 30 s ו צנטריפוגה ב 3000 g x ב 4 ° C עבור עוד 5 דק.
    10. להעביר את תגובת שיקוע לתוך הוספה בקבוקון HPLC ומניחים מדגם בקבוקונים במגש תעשיה להזרקה.

2. מכשור HPLC ופרמטרים מבצע

  1. HPLC להכין נייד-פאזי עם עקבי הפארמצבטית
    1. למדוד 500 מ"ל של HPLC-כיתה ח 2 O באמצעות משורה של.
    2. למדוד 500 מ"ל של כיתה HPLC acetonitrile (לחצן מצוקה) באמצעות משורה נפרדים של.
    3. בזהירות להוסיף 0.5 מ ל חומצה trifluoroacetic (TFA) (זהירות) לתוך כל אחד 500 מ"ל של H 2 O ולחצן מצוקה כדי להשיג את שלב ניידים של H 2 O ולחצן מצוקה המכיל 0.1% TFA, בהתאמה.
      הערה: TFA קורוזיבי ועוד רעילים, צריך להיות מטופל ברדס fume מעבדה. כל הממס תערובות מוכנות בטמפרטורת החדר.
    4. מסנן שלבים נייד דרך פילטר ממברנה ניילון עם מיקרומטר 0.45 גודל הנקבוביות ולהעביר אותו לתוך בקבוקים נקיים של מאגר HPLC.
  2. מכשור HPLC הגדרת גילוי בו זמנית של 4-MU DOX, MMC, ו DOXol ו I.S..
    1. לעבור על משאבת הדרגתיות, דה-גסר, אוטומטי-סמפלר, גלאי מערך פוטודיודה, רב גלאי קרינה פלואורסצנטית λ.
    2. קלט את התנאים הראשוני של הנייד-הרכב ל- 16.5% H 2 O (0.1% TFA) ו- 83.5% לחצן מצוקה (0.1% TFA) (v/v).
    3. להגדיר את גלאי UV על שני ערוצים, אחד 310 ננומטר עבור 4-MU (I.S.) והאחר על 360 nm עבור MMC.
    4. להגדיר את גלאי קרינה פלואורסצנטית על שני ערוצים, אחד בכל λ ex / λ em = 365/445 nm עבור 4-MU והשני -λ ex / λ em = 480 ננומטר nm/560 עבור DOX ו- DOXol, בהתאמה.
    5. לקבוע את שיעור זרימת איזוקראטית של 1.0 מ"ל לדקה
    6. Equilibrate עמודה 18 שהותקנו מראש הפוכה שלב C (4.6 מ מ x 250 מ מ, 5 מיקרומטר) בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות של הממסד בסיסית.
  3. להפריד בין תרופות (DOX, MMC, DOXol ו- 4-MU) באמצעות תנאי נייד-שלב מעבר.
    1. µL להזריק 15 דוגמאות שחולצו ומרוכז מחדש באמצעות auto-סמפלר.
    2. בהדרגה לשנות את התנאי נייד-שלב ראשוני (עיין פרוטוקול שלב 2.2.2) ל- 100% לחצן מצוקה (0.1% TFA) מעל 18 דקות באמצעות המשאבה הדרגתיות אוטומטיות.
      הערה: במהלך תהליך ההפרדה, ארבעה ערוצי (שני ספיגה UV ו פלורסנט שני) מופיעים בו זמנית עם אחד מהערוצים הצגת סמים תרכובת (עיין פרוטוקול שלב 2.2.3 ו 2.2.4).
    3. לשמור על 100% של לחצן מצוקה (0.1% TFA) 1 דקות, ואז לשוב התנאי ראשוני ניידים בתוך מינימלית 1
    4. מחדש להתנות את העמודה עם ניידים בשלב ראשון בקצב הזרימה של 1.5 mL/min במשך 4 דקות על הזריקה הדוגמה הבאה.

3. אימות HPLC

  1. להכין עבודה בסטנדרטים של DOX, MMC ו- DOXol ו- 4-MU (I.S.).
    1. שוקלים בנפרד 1 מ ג של אבקת סם DOX ו- MMC (זהירות), 4-MU-רעננה קטנות במשקל של נייר (3 x 3 ס"מ 2).
      הערה שכל תרופות נגד סרטן נחשבים סיכון בריאותי שיכולים לגרום המוטגניות רעילות, תא הנבט חריפה על שאיפה או בליעה. הם צריכים להיות מטופלים בזהירות עם כפפות ומסכות.
    2. להעביר את שנשקל DOX, MMC ו 4-MU חדש mL 1.5 בודדים פוליפרופילן מיקרו-שפופרת צנטרפוגה.
    3. להוסיף 1 מ"ל של מתאמפטמיןanol ו מערבולת לזמן קצר כדי להשיג ריכוז 1 מ"ג/מ"ל DOX ו- MMC.
    4. להוסיף 1 מ"ל של מתנול לתוך בקבוקון המכיל מראש שנשקל 1 מ ג של DOXol (זהירות) ו מערבולת בקצרה כדי לקבל 1 מ"ג/מ"ל ריכוז DOXol.
      הערה: DOXol הוא מטבוליט רעיל סיבולת לב ריאה ויש לטפל בזהירות.
    5. µL פיפטה 20 פתרונות מניות מוכן DOX, MMC, DOXol, 4-MU חדש נפרד צינור מיקרו-צנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 mL ולהוסיף 980 µL של מתנול כדי לקבל תקן עובד של µg/mL 20 של כל תרופה.
    6. µG/mL 20 לדלל DOX, MMC, DOXol באמצעות מתנול כדי להשיג עבודה בסטנדרטים של 50 ng - /mL 20 µg DOX, MMC של DOXol ו- 2000 ng/mL עבור I.S. 4-MU-
    7. לסגור את הפקק של הצינור של פתרונות עבודה עם חתיכה הצר של פרפין כיסוי הסרט כדי למנוע אידוי מתנול, לעטוף את הצינור כולו ברדיד אלומיניום, כדי למנוע חשיפה אור ישיר חנות ב-20 מעלות צלזיוס
  2. לקבוע את ליניאריות, דיוק, דייקנות DOX, MMC ו- DOXol בביולוגי מטריצות (קרי, דם והגידול homogenate). µL
    1. בו זמנית ספייק 5 עובדים הסטנדרטים של DOX ו- DOXol (50 ng/mL-µg 20/mL), MMC (1,000 ng/mL-µg 16/mL), ו- 4-MU (2 µg/mL) לתוך µL 50 של דם מלא ריק או רקמות homogenate צינורות פוליפרופילן מיקרו-צנטריפוגה כדי להשיג את עקומת ריכוז רגיל החל 5-2000 ng/mL עבור תרכובות סמים ו 200 ng/mL עבור 4-MU (I.S.).
    2. ביצוע וזמינותו החילוץ הסמים המתוארות פרוטוקול 1.2.
    3. השתמש נמוך, חציון וגבוה ריכוזי DOX DOXol (50, 500 ו- 2,000 ng/mL) ו- MMC (100, 1000, 2,000 ng/mL) במשך היום "אינטרה" בין דיוק ודיוק.
      הערה: להכין טרי ריכוזים רגיל ביום של ניתוח.
  3. ניתוח דוגמאות של
    1. µL 15 להזריק המדגם באמצעות auto-סמפלר.
    2. בהדרגה לשנות את השלב ניידים מ 0 עד 18 דקות, הגדלת את ההרכב של לחצן מצוקה על מרווח הזמן.
    3. אחרי 18 דקות, להחזיק התנאי שלב נייד דק 1
    4. לחזור למצב הראשוני מעל הבא 2 דקות, ולאחר מכן equilibrate מחדש במשך 4 דקות לפני הזריקה הבאה.
    5. לאחר כל מדגם לרוץ, שימו לב כי הפסגות של סמים תרכובות עם זמן השמירה שלהם מוצגים כדלקמן: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) ו DOX.
    6. לשלב את האזור שיא תחת עקומת (AUC) של תרכובות סמים באמצעות תוכנה HPLC.
    7. לחשב את יחס חאן אל בין מתחם בודדים סמים I.S. (משוואה 1) ולהשתמש העקומות סטנדרטי מוכן תחת אותם מיצוי הליכים כדי לקבוע את הסמים ריכוזי DOX, MMC DOXol בניסוח DMPLN.
      figure-protocol-1
    8. חישוב האחוזים שחזור סמים (משוואה 2) על-ידי השוואת הריכוזים סמים מחדש באמצעות מתנול של תמציות של דגימות ביולוגיות מחודדים לזה תקן (" מסודר ") סמים פתרון מתנול.
      figure-protocol-2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתי תרופות נגד סרטן, DOX MMC, כמו גם של המטבוליט DOX, DOXol, התגלו בו זמנית בלי התערבות ביולוגי באותו יישומית הדרגתיות HPLC בתנאי שימוש 4-MU I.S. עבור קרינה פלואורסצנטית והן גלאי UV. DOX, MMC, DOXol ו- 4-MU היו היטב מופרדים אחד מהשני עם השמירה פעמים של 5.7 מינימום עבור MMC, מין 10.4 עבור DOXol, 10.9 דקות עבור 4-MU ו- 11.1 דקות עבור DOX (איור 2). כל תרופה על כל הדם ורקמות שונים הראו ריכוז ליניאריות עם מקדמי המתאם (R2) ועד 0.98 1.00 (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לעומת שאר שיטות כרומטוגרפיות המאפשרים הגילוי של זן סמים אחד בכל פעם, פרוטוקול HPLC הנוכחי הוא מסוגל בו זמנית quantitate שלוש תרכובות סמים (DOX, MMC ו- DOXol) המטריצה הביולוגי אותו ללא צורך לשנות השלב ניידים. שיטה זו הכנה וניתוח יושם בהצלחה כדי לקבוע את פרמקוקינטיקה, ביו-והפצה של שתי מערכות משלוח סמים מבוססי ננו-חלקיק (קרי, liposomal DOX ו DMPLN)22. מאז חלקיקים PEGylated להאריך את מחזור מערכתי של הסם שנטען כתוצאה בריכוז התרופה בדם גבוהה על פני תקופה ארוכה של זמן (> 24 שעות בימ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים בהכרת תודה לאשר את המענק ציוד מדעי הטבע, הנדסה מחקר (NSERC) המועצה של קנדה לבדיקות, המענק ההפעלה של המכון הקנדי של הבריאות מחקר (CIHR), למחקר סרטן השד קנדי (CBCR) הברית X.Y. וו, המלגה אוניברסיטת טורונטו זאנג R.X., ג'אנג טי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
דוקסורוביצין Polymed Theraeutics111023תרופה אנטי סרטנית
Mitomycin CPolymed Theraeutics060814תרופה אנטי סרטנית
Doxorubicinol (DOXol)Toronto Research ChemicalsD558020מטבוליט של מלח נתרן DOX
4-Methylumbelliferone Sigma-AldrichM1508
חומצה מיריסטיתSigma-Aldrich544-63-8   חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
פוליאוקסיאתילן (100)ספקטרוםM1402חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
פוליאוקסיאתילן (40) סטארטסיגמא-אולדריץ'P3440חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
Pluronic F68 (PF68)BASF Corp.9003-11-6חומרים לננו-חלקיקים היברידיים פולי-ליפידים
אולטרסאונד (UP100H)Hielscher, טכנולוגיית אולטרסאונדNA הכנת ננו-חלקיקים
אמבט מים (ISOTEMP 3016HS)Fisher ScientificNAהכנת ננו-חלקיקים
ליפוזומלי דוקסורוביצין  (קייליקס)Janssenנרכש מבית המרקחת בית החולים הנסיכה מרגרטניסוח ננו-חלקיקים מאושר קלינית 
מתנולקלדון כימיקלים6701-7-40HPLC הרכב פאזה ניידת
HPLC מדורג HPLC H2OCaledon Chemicals8801-7-40HPLC הרכב פאזה נייד
HPLC אצטוניטריל Caledon Chemicals1401-7-40הרכב פאזה ניידת HPLC
חומצה טריפלואורואצטית חומצה סיגמא-אולדריץ'302031הרכב פאזה ניידת HPLC
0.45 μ m נייר סינון ממברנה ניילוןWhatmanWHA7404004HPLC הכנת שלב נייד
1cc מזרקי פלסטיקBecton, Dickinson and Company2606-309659הזרקת טיפול
5cc מזרקי פלסטיקBecton, Dickinson and Company2608-309646אוספי רקמות
30G 1/2 מחטיםBecton, Dickinson and Company305106הזרקת טיפול
25 גרם 5/8 מחטיםבקטון, דיקינסון ושות305122 קולקציות רקמות סטריליות
0.9% מי מלחאוניברסיטת טורונטו האוס מותג1011זילוף רקמות
13 מ"ל צינור חרוטי תחתון מעוגל SARSTEDT62.515.006פרוליפרולן, הומוגניזציה של רקמות
מדיום חיוני אלפא מינימלי (MEM) Gibco12571063Cell medium
1 x Phosphate Buffer SaltGibco10010023הומוגניזציה של רקמות
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100 MLהומוגניזציה של רקמות
חומצה פורמיתCaledon Chemicals1/5/3840התאם את ה-pH למיצוי ממס
נתרן הפרין צינורות פלסטיק מרוססיםBecton, Dickinson and Company367878איסוף דם
מאזן שקילה אנליטי סרטוריוס CPA225Dמד pH NA
 פישר סיינטיפיק13-637-671accumet
BASIC מערבולת מיקסטרפישר סיינטיפיק02-215-365דגימות מערבולת במהירות הרצויה
1.5 מ"ל  צינור מיקרוצנטריפוגהפישרברנד2043-05408129הומוגנייזר פרוליפרולן
דגם 1000פישר סיינטיפיק08-451-672הומוגניזציה של רקמות
5702REppendorf5702Rהכנת מיצוי
מערכת מאייד מחוממתGlas-ColNAמדגם מחדש
בקבוקוני הברגה HPLCDIKMA5320הזרקת מדגם HPLC
מכסי בורג HPLC עם PTFE לבן סיליקון מחיצהDIKMA5325HPLC הזרקת
מדגם HPLC תוספת פוליפרופילן   Agilent Technologies5182-0549נפח מקסימלי 250 μ l, הזרקת דגימה HPLC
Xbridge C18 ColumnWaters Corporation186003117ניתוח תרופות
משאבת שיפוע תאגיד ווטרסW600ניתוח תרופות
דגימה אוטומטיתווטרס קורפוריישןW2707ניתוח תרופות
גלאי מערך פוטודיודה תאגיד ווטרסW2998ניתוח תרופות
מולטי &למבדה; גלאי פלואורסנס תאגיד ווטרסW2475ניתוח תרופות
EMPOWER 2תאגיד ווטרסNAתוכנת ניתוח נתונים
מדעןMicromathNAניתוח פרמקוקינטי
נקבה Balb/c עכברימעבדת ג'קסון001026In vivo
EMT6/WT תאי סרטן שדמסופקים על ידי ד"ר איאן טנוק; מכון הסרטן של אונטריוNAIn vivo
סטנדרטית פנימית סטארט ' צנטריפוגה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13 (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5 (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., , CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15 (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6 (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15 (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74 (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15 (2), 003372(2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101 (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22 (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15 (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80 (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5 (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9 (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15 (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5 (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2 (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119 (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22 (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12 (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. , 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11 (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334 (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6 (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32 (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764 (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739 (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721 (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43 (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676 (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42 (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6 (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91 (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81 (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7 (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50 (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826 (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19 (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Doxorubicin Mitomycin CHPLC QuantitationDrug Combination AnalysisNanoparticle Drug DeliveryReverse Phase HPLCBiological Matrix ExtractionInternal Standard MethodSimultaneous Drug DetectionPharmacokinetics StudyTumor Tissue Analysis

Related Articles