Pronuclear (PN) הזרקה של באשכולות באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר (CRISPR), מערכת CRISPR-הקשורים חלבון-9 נוקלאז (CRISPR/Cas9) היא שיטה יעילה במיוחד להפקת מהונדס גנטית אוגרים סוריים הזהב. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט של הזרקת PN לייצור של אוגרים נוקאאוט גנטי עם מערכת CRISPR/Cas9.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הייצור של מהונדסים אוגרים סוריים הזהב באמצעות הזרקת Pronuclear של המתחם CRISPR/Cas9
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקת ההזרקה (PN) pronuclear הוקם לראשונה בעכברים להציג חומרים גנטיים זרים לתוך pronuclei של שלב אחד-תא עוברי. החומר הגנטי הציג עשויים לשלב הגנום העוברי וצור הטרנסגניים חיות עם זרים מידע גנטי בעקבות העברת העוברים מוזרק לטפח אימהות. בעקבות ההצלחה בעכברים, הזרקת PN הוחל בהצלחה במינים בעלי חיים רבים אחרים. לאחרונה, הזרקת PN כבר בהצלחה מועסקים להציג ריאגנטים עם שינוי גנטי פעילויות, כגון מערכת CRISPR/Cas9, כדי להשיג שינויים בייעודי לאתר גנטית במעבדה מספר החווה מיני בעלי חיים. בנוסף מאסטרינג בערכה מיוחדת של מיומנויות microinjection כדי לייצר חיים מהונדסים בזריקה PN, חוקרים חייב להבין את הפיזיולוגיה של רבייה וההתנהגות של המין היעד, בגלל כל מיני מתנות ייחודיות אתגרים. לדוגמה, אוגר סורי זהוב עוברי יש ייחודי טיפול בדרישות במבחנה כזאת PN הזרקת טכניקות היו אפשריים במין זה עד פריצות דרך זה התבצעה על ידי הקבוצה שלנו. עם מינים-השתנה PN הזרקת הפרוטוקול שלנו הצלחנו לייצר מספר נוקאאוט גנטי (KO) ו knockin אוגרים (KI), אשר שימשו בהצלחה מודל מחלות אנושיות. כאן נתאר את הליך הזרקת PN מוסר את CRISPR/Cas9 מורכבים מופרות של האוגר, העובר טיפול בתנאים, נהלי ההעברה העובר ולאחר גידול הדרושה להפקת גנטית שונה אוגרים.
מבוא
האוגר הסורי הזהב (אם לדייק Mesocricetus) הוא אחד המכרסמים הנפוצה ביותר למחקר ביורפואי. על-פי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, כ-100,000 אוגרים שימשו בארצות הברית בשנת 2015, המייצג 13% השימוש בבעלי חיים המעבדה הכולל בין המינים מכוסה על ידי חוק רווחת בעלי חיים (http://www.aphis.usda.gov; לגשת מרץ 10, 2017).
האוגר מציע כמה יתרונות על פני מכרסמים אחרים במחקר של מספר מחלות אנושיות. לדוגמה, אדנוקרצינומה בלבלב histopathology של N-nitrosobis(2-oxopropyl) אמין (BOP) המושרה ductal ב אוגר דומה גידולים בלבלב האנושי, בעוד הטיפול בופ מעוררת בעיקר גידולי בלוטת התריס חולדות, ריאות, גידולים בכבד עכברים1. בגלל אוגרים למכרסמים קט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת יוטה (פרוטוקול IACUC: 2484). אוגרים המשמשים פרוטוקול זה הם מבוגרים (מגיל 6-10 שבועות) LVG זן הזהב אוגרים סוריים. אוגרים כל מלון את ביבר במרכז Bioinnovation, אוניברסיטת מדינת יוטה. בטמפרטורת החדר מוגדר ב 23 ° C, לחות מוגדרת ב- 40-50%, ולכן מחזור אור מוגדר 14L: 10D (בהירה: כהה). במידת האפשר, שגרות מניפולציה ו- surugical העובר צריכה להתבצע עם טכניקות סטרילי.
1. sgRNA והכנות Ribonucleoproteins (RNP) Cas9/sgRNA
- לסנתז sgRNAs ביצוע במבחנה שעתוק הפרוצדורות המתוארות במדריך של ערכת סינתזה (חומרים לטבלה, נספח 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
היעילות של הפרוטוקול המתואר בהפקת אוגרים מהונדסים תלוי התוצאות של שני קריטי בשלבים הבאים: live הילודה של נקבות הנמענים ואת מספר הגורים בשידור חי עם השינויים הגנטי המיועד. קצב הילודה live הוא של תוצאות ישירות של איכות העובר את המיומנות של הפרט מבצע את הזרקת PN העובר נהלי ההעברה. כדי להבטיח כי הפוטנציאל ההתפתחותי של עוברי מניפולציה לא נפגעת, נדרשת זהירות רבה במהלך הטיפול במבחנה של העוברים אוגר. אנחנו באופן קבוע להשיג שיעור הלידה live של 60-80% עם הנקבות הנמען pseudopregnant.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדאי לנצל את הפוטנציאל של אוגרים סוריים הזהב כמודלים של מחלות אנושיות, פיתחנו פרוטוקול הזרקת PN להעברת של CRISPR/Cas9 מורכבים כדי למקד את הגנום אוגר. פרוטוקול הזרקת PN מיטוב מספר משתני מפתח לרבות העובר תרבות בינוני, טמפרטורה, אורכי גל של אור13. ישנם גם מספר הליכים ספציפיים אוגר לטיפול בבעלי חיים צריך לעקוב בהצלחה המסויים ג'ין פילוח האוגר. לדוגמה, התבגר מינית אוגרים הנקבה יש יציבה מחזורים estrous 4 ימים שאין אפשרות לסנכרן עם הורמונים אקסוגני (למשל PMSG). לפיכך במדויק מעקב אחר שמחזורי estro.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ZW יש אינטרסים כלכליים בביוגרפיה לדייק, LLC., חברה מתמחה ביצירת חיות מהונדס גנטית המחקר הביו-רפואי ויישומים חקלאיים.
תודות
מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIAID) של מכוני הבריאות הלאומיים תחת 1R41OD021979 מספר פרס (כדי ZW) ועל -ידי מענק מחקר של 21 BioGreen הדור הבא התוכנית, הרפובליקה של קוריאה, להעניק. לא. PJ01107704 (כדי ZW) ולהעניק לא. PJ01107703 (כדי IK). התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נוף הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים או BioGreen 21. אנו מודים ד ר ניקולס Robl על עריכת כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Cas9 | Invitrogen | B25640 | 1 μ g/μ L (~6.1 μ M) |
| ערכת סינתזה מדויקת של GeneArtTM | Invitrogen | A29377 | לסינתזה sgRNA |
| אלבומין מסרום אנושי | Sigma | A1653 | למדיום גידול |
| Illuminator | Nikon | NI-150 | להעברת עוברים |
| אינקובטור | ניו ברונסוויק | גלקסי 14S | לגידול עוברים |
| Microforge | Narishige | PB-7 | להכנת מחטי הזרקה |
| מיקרוסקופ | Nikon | ECLIPSE Ti-S | למיקרו-הזרקה |
| מיקרוסקופ | invitrogen | SMZ745T | להעברת עוברים |
| שמן מינרלי | Sigma | M1840 | שמור בחושך |
| PMSG | Sigma | G4877-2000IU | לביוץ |
מקורות
- Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease. Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).
- Wold, W. S., Toth, K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
