פרוטוקול זה מתאר שיטה להחדיר פלסמיד DNA לתוך הכליה העכבר באמצעות אגן הכליה כדי לייצר transgene ביטוי במיוחד בתוך הכליה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הזרקת hydrodynamic יוצר סביבה מקומיים, בלחץ גבוה כדי transfect רקמות שונות עם דנ א פלסמיד וחומרים אחרים. הזרקת וריד הזנב hydrodynamic, לדוגמה, היא שיטה ומבוססת שבאמצעותו יכול להיות transfected הכבד. כתב יד זה מתאר יישום של עקרונות hydrodynamic על ידי הזרקה של הכליה העכבר ישירות עם פלסמיד הדנ א על ביטוי גנים ספציפיים כליות. עכברים הם מרדימים, הכליה נחשף על ידי חתך האגף ולאחריה זריקה מהירה של פלסמיד פתרון ה-DNA המכיל ישירות לתוך אגן הכליה. המחט הוא שמר על המקום לעשר שניות, מקום החתך מאוחה. למחרת, לחיות הדמיה בעלי חיים, תספיג או אימונוהיסטוכימיה עשוי לשמש assay ביטוי גנים או אחרים מבחני מתאים את transgene של בחירה משמשים לגילוי של החלבון עניין. שיטות שפורסמו להאריך ביטוי גנים כוללים אינטגרציה transgene בתיווך transposon וטיפול ציקלופוספמיד כדי לעכב את התגובה החיסונית כדי transgene.
מבוא
טכניקת ההזרקה של וריד הזנב hydrodynamic הפך נפוץ דרך כדי להשיג רמות גבוהות של ביטוי גנים העכבר הכבד1,2. הכליות הן גם transfected באמצעות הטכניקה הזו ברמה יותר נמוכה, כ 100-fold פחות3. הזרקת hydrodynamic אגן הכליה המתוארים כאן מספק דרך פשוטה כדי לשלוט יחודיות של איברים ביטוי באמצעים פיזיים, באמצעות אותם עקרונות hydrodynamic שהוקמו בעבר כבד4,5 , שרירים6ו-7,8אחרים איברים. שיטה זו transfects תאים בעלי חיים ויוו באמצעות לחץ ותוקנו מהירות כדי ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש ועדות (IACUCs) של ביילור לרפואה, המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.
1. מכינים את הפתרון DNA להזרקה
- בחר את plasmid(s) כדי לבטא את transgene(s) בקפידה כדי למקסם את מאפייני רצוי לשפר את יעילות תרביות תאים transgene הביטוי.
הערה: אגן הכליה Hydrodynamic הזרקה של פלסמידים לבטא את סמן פלורסנט TdTomato, הורמון אריתרופויאטין (Epo) ו גחלילית לוציפראז כבר שתואר לעיל11. אם לא וזמינותו מפותח ליעילות תקנים עבור transgene, לבצע הדמיה בעלי חיים חיים של לוציפראז על ידי החדרת µg 10 של הבעת לוציפראז פלסמיד כגון משופרת גחלילית לוציפראז הדי מדולל להזרקה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
טכניקת הניתוח, הזרקת פשוטים לביצוע נשכחו, הדורשים לא הציוד העיקרי או בחומרים יקרים. אם חדש האגף-חתך ניתוח בכליה, יום הדרכה אחד על מספר עכברים מתוכננת המתת חסד אסור שבו העכברים אינם התאושש הניתוח הבא כי הניסיון הראשון-ניתוח זה עשוי לארוך זמן רב יותר מהרגיל. לחלופין, חוקרים מוכר עם טכניקות דומות עלול למצוא את זה די פשוט. בזהירות בצע האיור באיור 1 בהוראות ציורית באיור2. למיקום כראוי את החתך, המנתח ניתן להשתמש האצבעות כדי ללחוץ על הע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ב פרוטוקול זה מתוארת שיטה חזקה להשגת ביטוי גנים לשחזור באופן ספציפי בתוך הכליה. בידי מנתח מנוסה בינוני מצאנו האחוז של עכברים transfected באמצעות הטכניקה הזו להיות בטווח של 50-100%, בהתאם לגיל העכבר ואת הרגישות של המדידה של transgene. הרמה של ביטוי גנים לוציפראז היה מעל רקע במשך מספר חודשים בעכברים שקיבלו piggyBac טרנספוזונים ומתוחזק לחלוטין למשך מספר שבועות בעכברים immunocompromised קבלת טרנספוזונים אותו11. בעוד הרבה תאים מוכתם במאור פנים transgene באזור ההזרקה, היעילות הכוללת של תרביות ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף ולהצהיר אין ניגוד אינטרסים.
תודות
פרס פיתוח הקריירה של המחלקה ותיקי לענייני [BX002797] תמך L.E.W. מכוני הבריאות הלאומיים [R01-DK095867] ונתמך American Heart Association [15GRNT25700209] ג'יי מכוני הבריאות הלאומיים [DK093660], המחלקה לענייני חיילים משוחררים [BX002190] ואנדרבילט לחקר מחלת כליות תמיכה, M.H.W. חומר זה הוא התוצאה של עבודה נתמכת עם משאבים ושימוש במתקני במערכת הבריאות VA עמק טנסי.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| AnaSed Xylazine | Patterson וטרינרי | 07-808-1947 | הרדמה - חומר לא מבוקר |
| BD מזרק אינסולין 0.5 מ"ל 29 גרם 1/2 אינץ' | 309306 בריאות קרדינל | מזרקים נדרשים | |
| בופרנקס | רוקח/וטרינר | משככי כאבים - חומר מבוקר | |
| Dynarex וילון מגבת חד פעמית | תרמו פישר סיינטיפיק | 19-310-671 | הנח מעל כרית חום |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | השתמש רק ב-DNA פלסמיד נטול אנדוטוקסין |
| Endosafe Jer-Clot LAL בקרה חיובית מהירה | צ'ארלס ריבר | PC200 | בקרה חיובית לבדיקת אנדוטוקסין Endosafe |
| Jer-Clot LAL בקבוקון בדיקה יחיד מהיר | צ'ארלס ריבר | R13500 | בדיקת אנדוטוקסין |
| מספריים מיקרו חיתוך עדין במיוחד | Roboz כירורגי מכשיר | RS-5882 | כלי כירורגי |
| Fisherbrand נרתיק עיקור איטום מיידי - 9 אינץ' | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | לחיטוי כלים כירורגיים |
| Gaymar משאבת חום | פרגון רפואי | TP-700 | משאבת חום במחזור מים |
| נביטה 500 | מכשיר כירורגי | Roboz DS-401 | לשימוש חוזר בכלים כירורגיים במהלך הניתוח |
| Graefe | מלקחיים Roboz מכשיר כירורגי | RS-5136 | כלי כירורגי |
| מלקחיים רקמות Graefe | Roboz מכשיר כירורגי | RS-5153 | כלי כירורגי |
| מחזיק מחט הלסי, | מכשיר כירורגי Roboz | RS-7841 | כלי כירורגי |
| רפידות חום - 15 אינץ' x 21 אינץ' - צריך לפחות 3 | Paragon Medical | TP22G | לשימוש עם משאבת |
| חום GaymarIsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | להדמיה והמתת חסד |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | להדמיה והמתת חסד |
| קטמין רוקח/וטרינר | הרדמה - חומר מבוקר | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | רקמות מעבדה |
| תוכנת תמונה חיה | קליפר מדעי | להדמיית בעלי חיים | |
| חיים לוציפרין | פרקין אלמר | 122796 | להדמיית בעלי חיים |
| חיים Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | ספקטרופוטומטר למדידת DNA |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | לניתוחי עור הכנה |
| פרולן 5-0 תפרים Taper 30 " | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | תפרים לא נספגים לעור |
| Puralube מותג משחה אופטלמית | פטרסון וטרינרי | 07-888-2572 | כדי לשמור על לחות העיניים במהלך הניתוח |
| Trans IT - פתרון אספקה הידרודינמי QR | Mirus Bio | MIR-5240 | מאגר אספקה הידרודינמי לדילול DNA |
| Vicryl 5-0 תפרים J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | תפרים נספגים לשכבת השריר |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | מכונת גילוח להכנת העור |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | להדמיית בעלי חיים |
מקורות
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
