פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
חומצת גרעין Non-קנונית מבנה שניוני ש-g-quadruplexes (G4) מעורבים תהליכים תאיים מגוונים, כגון שכפול ה-DNA, שעתוק, עיבוד RNA טלומר התארכות. במהלך תהליכים אלה, חלבונים שונים לאגד ולפתור G4 מבנים לביצוע תפקידם. הפונקציה של G4 תלוי לעתים קרובות היציבות של מבנהו מקופל, חשוב לחקור כיצד G4 מחייב חלבונים להסדיר את היציבות G4. עבודה זו מציגה שיטה לטיפול יחיד מולקולות G4 באמצעות פינצטה מגנטי, אשר מאפשרת לימודים של ויסות G4 מחייב חלבונים על מולקולה בודדת G4 בזמן אמת. באופן כללי, שיטה זו מתאימה בהיקף רחב של יישומים מחקרים עבור אינטראקציות חלבונים/ליגנדים והתקנות על מבנים משניים שונים DNA או RNA.
מבוא
ארבע גדילי ה-DNA או RNA G4 מבנים לשחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים חשובים רבים1. חלבונים רבים מעורבים G4 איגוד ורגולציה, כולל טלומר מחייב חלבונים (טלומראז, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, גורמי שעתוק (nucleolin, PARP1)3, RNA עיבוד חלבונים (hnRNP A1, hnRNP A2)4helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, שכפול ה-DNA קשורים חלבונים (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. חלבון מחייב ניתן לייצב או יציבות מבנים G4; במטרה לווסת את תפקודים ביולוגיים הבאים. היציבות G4 נמדדה על ידי תרמי התכה באמצעות אולטר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה של G4 ה-DNA של מולקולה בודדת מתיחות
- הכן 5 '-תיול שכותרתו ו- 5 '-ביוטין תווית dsDNA מטפל באמצעות PCR באמצעות פולימראז DDNA על תבנית ה-DNA phage למבדא באמצעות 5 '-תיול ו- 5 '-ביוטין תחל 14 ( איור 1). שתי ידיות dsDNA יש תכולה גבוהה של GC (> 60%) כדי למנוע ה-DNA נמס כאשר DNA מתקיים לעבר כוחות גבוהה או במהלך מתיחת DNA מעבר 15.
- מוצרים PCR לטהר באמצעות ערכת טיהור מסחרי תקציר עם BstXI אנזים הגבלה על פי היצרן ' פרוטוקול s.
- SsDNA ויוצרים מאתרים ומפסיקים G4, וידיות האגף ssDNA ו- dsDNA באמצעות T4 DNA ליגאז לפי היצרן ' פרוטוקול s. לטהר את המוצר מחוברים על ידי ג'ל ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הגדרת הניסוי למתיחת מולקולה בודדת G4 מוצג באיור4. חד-גדילי G4 ויוצרים רצף המורחב בין שתי ידיות dsDNA הייתה קשורה בין coverslip של חרוז פאראמגנטיים. כדי לחפש חרוז קשור dsDNA יחיד, overstretching assay בוצעה על ידי הגדלת הכוח במחירים טעינה קבועה. שלושה סוגי מדידות שימשו לעיתים קרובות לומדים את הקיפול, התגלגלות של מולקולות: מדידת כוח קבוע (i), (ii) כוח-סרגל מדידה של מדידה (iii) כוח-לקפוץ. בשל שיעור התגלגלות איטי מאוד של מבנה זה G4, האיזון קיפול-התגלגלות המעבר יכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כמתואר לעיל, פלטפורמה עבור הלומדים את יציבות מכנית של ה-DNA G4 ו את האינטראקציות של חלבון ל G4 באמצעות פינצטה מגנטי מולקולה בודדת הוא דיווח. המלווה את הפלטפורמה, פרוטוקולים יעילים ביותר למציאת הקשר G4 DNA, מדידה של הדינמיקות קיפול-התגלגלות ויציבות המבנה G4 עם רזולוציה מיוחד ננומטר מפותחים. נעילת במישור המוקד מאפשר שליטה הסחף נגד יציב מאוד, וזה חשוב לזיהוי שינוי מבנה קטן כגון G4 (שלב גודל ~ 7 ננומטר) ואינטראקציות עם חלבונים בניסויים מאגר exchange. פלטפורמה זו לאחרונה נוקטים מחקרים של הדינמיקות מתקפלים, התגלגלות של telomer.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים מנג פאן על הגהה כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי סינגפור משרד של חינוך אקדמי מחקר קרן שורה 3 (MOE2012-T3-1-001) כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי דרך סינגפור Mechanobiology המכון כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי, משרד, סינגפור ראש הממשלה, תחת תכנית Investigatorship ה-NRF (ה-NRF Investigatorship פרס מס ' ה-NRF-NRFI2016-03 כדי J.Y.; קרן מחקר בסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזי (2017KFYXJJ153) לה Y.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פריימרים DNA PCR | IDT | תכשירי DNA | |
| כימיקלים DNA PCR כימיקלים NEB | מכיני DNA | ||
| אנזים הגבלה BstXI | NEB | R0113S | מכיני DNA |
| כיסויים (#1.5, 22*32 מ"מ ו-20*20 מ"מ) | BMH. BIOMEDIA | 72204 | הכנת תעלות זרימה |
| Decon90 | Decon Laboratories | הכנת ערוץ זרימה | |
| APTES | Sigma | 440140-500ML | הכנת תעלת זרימה |
| Sulfo-SMCC | ThermoFisher Scientific | 22322 | הכנת ערוץ זרימה |
| M-280, חרוזים פרמגנטיים, סטרפטווידין | ThermoFisher Scientific | 11205D | הכנת ערוץ זרימה |
| מיקרוספירות אמינו פוליביד 3.00 μ m | Polysciences, Inc | 17145-5 | הכנת תעלות זרימה |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M6250-250ML | הכנת ערוץ זרימה |
| מיקרוסקופים אולימפוס IX71 | Olympus | IX71 | הגדרת פינצטה מגנטית |
| Piezo-Z Stages P-721 | Physik Instrumente | P-721 | הגדרת פינצטה מגנטית |
| עדשת Olympus Objective MPLAPON-Oil 100X | Olympus | MPLAPON-Oil 100X | הגדרת פינצטה מגנטית |
| מצלמת CCD/CMOS AVT | Pike F-032B | הגדרת פינצטה מגנטית | |
| תרגום שלב ליניארי | Physik Instrumente | MoCo DC | הגדרת פינצטה מגנטית |
| LED | Thorlabs | MCWHL | הגדרת פינצטה מגנטית |
| מגנטים מגנטים | Supermagnete | הגדרת | |
| פינצטה מגנטיתLabview | National Instruments | הגדרת פינצטה מגנטית | |
| OriginPro/Matlab | OriginLab/MathWorks | ניתוח נתונים |
מקורות
- Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
- Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
- Gonzalez, V., Hurley....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
