טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

תקציר

המטרה של פרוטוקול זה הוא לבודד את וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) ה-DNA של תאים נגועים לצורך הזיהוי הקשורים ויראלי החלבונים על ידי מסה ספקטרומטר. למרות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הגנום הנגיפי משחק תפקידים עיקריים בקביעת התוצאה של זיהום, ניתוח מקיף של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לא היה אפשרי בעבר. כאן נדגים שיטה המאפשרת את טיהור ישירה של HSV-1 הגנום של תאים נגועים. שכפול ה-DNA הנגיפי מסומן באופן סלקטיבי עם נוקלאוטידים ששונה מכילים קבוצה פונקציונלית של אלקין. דנ א שכותרתו אז במיוחד ובלתי הפיך מתויג באמצעות החזקה קוולנטיות של ביוטין אזיד דרך נחושת (I)-מזורז אזיד-אלקין cycloaddition או לחץ על התגובה. מתויג ביוטין DNA מטוהר על חרוזים מצופים streptavidin, חלבונים הקשורים eluted, המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. שיטה זו מאפשרת מיקוד סלקטיבי ובידוד של מזלגות שכפול HSV-1 או כל הגנום של סביבות ביולוגיות מורכבות. יתר על כן, עיבוד של גישה זו יאפשר החקירה של היבטים שונים של זיהום herpesviral, כמו גם הבחינה של הגנום של וירוסים אחרים, ה-DNA.

מבוא

וירוסים יש קיבולת מוגבלת כדי לבצע פונקציות חיוניות, ולכן תלויות בגורמים המארח כדי להקל על היבטים קריטיים זיהום כולל ביטוי גנים ויראליים, שכפול, תיקון, רקומבינציה תחבורה. הפעילות של גורמים אלה מארח הם לעיתים קרובות בתוספת לשווק מקודד חלבונים. בנוסף, וירוסים עליך להימנע וזיהוי הפרעות על-ידי תגובות הסלולר זיהום ויראלי. לכן, וירוס מחשב מארח אינטראקציות להכתיב את התוצאה של זיהום. חשיבות עליונה היא ההבנה כמה וירוסים לשנות את הסביבה הסלולר, במטרה להתאים את מכונות הסלולר כדי להקל על התהליכים ויראלי. עניין מיוחד הוא זיהוי גורמים ותהליכים אשר פועלים על הגנום הנגיפי במהלך מחזור זיהומיות.

וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) הוא שכפול תקועים וירוס DNA מדבי....

פרוטוקול

1. תרבית תאים, זיהום נגיפי ו- EdC תיוג ( איור 1)

בפרוטוקול הבא כרוך בעבודה עם וירוסים. נא עיין המוסד שלך ' s ביולוגית פרוטוקולים בדבר לטפל וירוסים ותוכנות אחרות ביולוגיים. פרוטוקול זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של אוניברסיטת פיטסבורג.

1. Trypsinize confluent 150 ס"מ ² תרביות רקמה בקבוקון MRC-5 תאים ולהעביר את התאים צלחת תרביות רקמה ² ס מ 600 המכיל 100 מ ל DMEM בתוספת 10% FBS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO ₂ 3-4 ימים להגיע לשלב confluency, נייח. תבשיל ² ס מ 600 confluent מכיל ~ 7 x 10 ⁷ תאים. להכין לוח 1 עבור כל תנאי וצלחת 1 עבור כל....

תוצאות

השימוש לחץ כימיה לטיהור של ה-DNA של תאים בוצעה לראשונה על ידי שיטת iPOND²¹. מטרת iPOND היא לטהר מזלגות שכפול הסלולר לצורך זיהוי חלבונים הקשורים. אנחנו הסתגלו טכניקה זו ללמוד אינטראקציות חלבון vDNA במיוחד במהלך זיהום. מניפולציה של הגישה לתייג הגנום הנגיפי עם EdC (איור 1), בשילוב עם זיהומים מסונכרן, אפשרה עבור בידוד סלקטיבי והחקירה של אוכלוסיות נפרדות vDNA. DNA HSV-1 מסומן עם EdC (איור 1) כדי להקל על הקובץ ה.......

דיון

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים אשר, אם לא עקבו בזהירות, עלולה לגרום התשואה חלבון מופחתת באופן משמעותי או זיהום עם תאי ה-DNA. . זה קריטי כי נייח תאים משמשים לניסויים כל כדי להבטיח כי DNA הסלולר לא מתויג, מטוהרים זה יכול להיות מאושרות על ידי העדר polymerases DNA הסלולר במדגם חלבון כי HSV-1 לא לנצל את הסלולר DNA פולימראז של הגנום סינתזה. במהלך EdC תיוג גרעינים קציר צעדים, דגימות צריך להיות התנודד כדי להבטיח כי כל אחד מעובד באופן שווה. במהלך שלבי טיהור, להקפיד לא אתמרן גרעינים על-ידי pipetting מדי. זה יכול להוביל פירוק מוקדמת ש.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תאי MRC-5	ATCC	CCL-171
סרום בקר עוברי (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	מוחלף ב-10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 12 mM  (לגידול בצלוחיות) או 30 מ"מ (לגידול בכלים) נתרן-ביקרבינאט
600 ס"מ2 צלחת תרבית רקמות	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4			137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 491 מ"מ MgCl, 680 מ"מ CaCl, 25.1 מ"מ
		HSV-1	מלאי עם טיטרים גדולים מ-1x109 PFU/mL עובד בצורה הטובה ביותר
ספדקס G-25  טור (עמודת התפלה PD-10)	GE Healthcare	17085101
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	פישר סיינטיפיק	D128-1
5´-אתיניל-2&אקוטי;-דאוקסיציטידין (EdC)	סיגמא-אולדריץ'	T511307	ממיסים ב-DMSO להכנת מלאי של 40 מ"מ, מכילים ומאחסנים ב-20 מעלות; C
2´-deoxycytidine (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	ממיסים במים להכנת ציר של 40 מ"מ, aliquot, ומאחסנים בטמפרטורה של -20° C
מאגר מיצוי גרעיני (NEB)			הכן טרי (20 מ"מ Hepes pH 7.2, 50 מ"מ NaCl, 3 מ"מ MgCl2, 300 מ"מ סוכרוז, 0.5% Igepal)
מגרד תאים	זכוכית Bellco	7731-22000	חיטוי לפני השימוש
תמיסה כחולה טריפאן	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 מ' NaCl, 27 מ"מ KCl, 100 מ"מ Na2HPO4, 18 מ"מ KH2PO4 (לדלל ל-1x במים סטריליים לפני השימוש)
נחושת (II) סולפט פנטהידראט (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	הכן מלאי של 100 מ"מ ואחסן ב-4 מעלות; C עד חודש
(+) נתרן L-אסקורבט	Sigma-Aldrich	A4034	הכן טרי מלאי 100 מ"מ ואחסן על קרח עד לשימוש
בביוטין אזיד	Invitrogen	B10184	הכן מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, aliquot, ואחסן ב-20 מעלות; C לתקופה של עד שנה
לחץ על תערובת			הכן מיד לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים בסדר המצוין (10 מ"ל: 8.8 מ"ל 1x PBS, 200 מ"ל 100 מ"מ CuSO4, 25 מ"ל 10 מ"מ ביוטין אזיד, 1 מ"ל 100 מ"מ נתרן אסקורבט)
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם	Roche	11697498001	ממיסים ב-1 מ"ל מים להכנת ציר פי 50, ניתן לאחסן ב-4 מעלות; C עד שבוע, או הוסף ישירות כדור אחד למאגר 50 מ"ל
מאגר			הכן טרי (7 מ"ל 100% גליצרול, 3 מ"ל NEB, 200 μ מעכב פרוטאז L 50x)
בופר B1			הכן טרי (25 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)
מאגר B2			הכן טרי (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)
מאגר B3			הכן טרי (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1x מעכב פרוטאז)
מעבד Vibra Cell Ultra Sonic מצויד בבדיקה 3 מ"מ	microtip Sonics	VCX 130
מסננת תאים	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
מיני צינור מסובב	פישר סיינטיפיק	260750F
2x Laemmli מאגר			מערבבים 400 מ"ג SDS, 2 מ"ל 100% גליצרול, 1.25 מ"ל של 1 M Tris (pH 6.8) ו-10 מ"ג ברומופנול כחול ב-8 מ"ל מים. אחסן ב-4  ° C עד 6 חודשים. לפני השימוש הוסף 1 M DTT לריכוז סופי של 200 מ"מ.
מנעולי מכסה לצינור 1.5 מ"ל	פישר סיינטיפיק	NC9679153
ריאגנטים
NOVEX ערכת צביעה כחולה קולואידית	Invitrogen	LC6025
צלחת תרבית רקמות 12 בארות	קורנינג	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	אוטוקלאב לפני השימוש
שקופיות מיקרוסקופ	פישר סיינטיפיק	12-552-5
16% פרפורמלדהיד	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי	15710	לדלל ל-3.7% ב-1x PBS לפני השימוש
אלבומין בסרום בקר (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	הכן 3% ב-1x PBS
מאגר פרמיביליזציה (0.5% טריטון-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	הכן 0.5% טריטון-X 100 ב-1x PBS
קוקטייל תגובת קליק - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ערכת הדמיה	בדיקות מולקולריות	C10337	הכן לפי פרוטוקול היצרן
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	הכן 10 מ"ג/מ"ל במים, יכול לאחסן ב-4 מעלות; C למשך עד שנה
עכבר נגד ICP8 נוגדן ראשוני	Abcam	ab20194	השתמש בדילול של 1:200 בנוגדנים ראשוניים 1x PBS
Mouse anti-UL42 (2H4)	Abcam	ab19311	השתמש בדילול של 1:200 ב-1x PBS
עז נגד עכבר 594-מצומד נוגדן משני	Life Technologies	a11005	השתמש בדילול של 1:500 ב-1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
2x תמיסת			2% SDS, 200 מ"מ NaHCO3
פנול: כלורופורם: אלכוהול			מערבבים 25:24:1 לפחות יום אחד לפני השימוש, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכלורופורם הכהה
: אלכוהול			מערבבים 24:1 לפחות יום אחד לפני השימוש, יש לאחסן בטמפרטורת החדר בחושך
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 מ"מ Tris, 10 מ"מ EDTA (לדלל ל-1x לפני השימוש)
ערכת טיהור Qiaquick PCR Qiagen		28104
3 M נתרן אצטט pH 5.2
קיוביט 2.0 פלואורומטר	Invitrogen	Q32866
ערכת בדיקה של Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851
צינורות בדיקת Qubit	Invitrogen	Q32856
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד בתוכנת
מיקרוצנטריפוגה לצינורות
צנטריפוגה שולחנית לצינורות
תא חממת
ארון
גושי			65 מעלות; C ו-95 מעלות; ג

מלאי Tricine תגובה הקפאה דגימה מערביים סטנדרטיים SDS-bicarb איזואמיל איזואמיל הדמיה1.5 מ"ל15 ו-50 מ"לתרבותבטיחות ביולוגית חום