מאמר שיטה

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

13.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56374

⸱

31 באוגוסט 2017

 , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of Pittsburgh School of Medicine

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

תקציר

המטרה של פרוטוקול זה הוא לבודד את וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) ה-DNA של תאים נגועים לצורך הזיהוי הקשורים ויראלי החלבונים על ידי מסה ספקטרומטר. למרות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם הגנום הנגיפי משחק תפקידים עיקריים בקביעת התוצאה של זיהום, ניתוח מקיף של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לא היה אפשרי בעבר. כאן נדגים שיטה המאפשרת את טיהור ישירה של HSV-1 הגנום של תאים נגועים. שכפול ה-DNA הנגיפי מסומן באופן סלקטיבי עם נוקלאוטידים ששונה מכילים קבוצה פונקציונלית של אלקין. דנ א שכותרתו אז במיוחד ובלתי הפיך מתויג באמצעות החזקה קוולנטיות של ביוטין אזיד דרך נחושת (I)-מזורז אזיד-אלקין cycloaddition או לחץ על התגובה. מתויג ביוטין DNA מטוהר על חרוזים מצופים streptavidin, חלבונים הקשורים eluted, המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה. שיטה זו מאפשרת מיקוד סלקטיבי ובידוד של מזלגות שכפול HSV-1 או כל הגנום של סביבות ביולוגיות מורכבות. יתר על כן, עיבוד של גישה זו יאפשר החקירה של היבטים שונים של זיהום herpesviral, כמו גם הבחינה של הגנום של וירוסים אחרים, ה-DNA.

מבוא

וירוסים יש קיבולת מוגבלת כדי לבצע פונקציות חיוניות, ולכן תלויות בגורמים המארח כדי להקל על היבטים קריטיים זיהום כולל ביטוי גנים ויראליים, שכפול, תיקון, רקומבינציה תחבורה. הפעילות של גורמים אלה מארח הם לעיתים קרובות בתוספת לשווק מקודד חלבונים. בנוסף, וירוסים עליך להימנע וזיהוי הפרעות על-ידי תגובות הסלולר זיהום ויראלי. לכן, וירוס מחשב מארח אינטראקציות להכתיב את התוצאה של זיהום. חשיבות עליונה היא ההבנה כמה וירוסים לשנות את הסביבה הסלולר, במטרה להתאים את מכונות הסלולר כדי להקל על התהליכים ויראלי. עניין מיוחד הוא זיהוי גורמים ותהליכים אשר פועלים על הגנום הנגיפי במהלך מחזור זיהומיות.

וירוס הרפס סימפלקס סוג 1 (HSV-1) הוא שכפול תקועים וירוס DNA מדביק חלק ניכר של האוכלוסייה האנושית. בתוך שעה הראשונה של זיהום, הגנום הנגיפי נכנס לגרעין, איפה מדורגת מסודרת של ביטוי גנים ויראליים מתפתח בתיאום עם שכפול נגיפי DNA (vDNA)1. בגרעין, הגנום הם כפופים לכללים epigenetic, לעבור רקומבינציה ותיקון, ארוזים לתוך capsids, כך virions הראשון רומא מיוצרים תוך פחות מ-6 שעות. הערכה מקיפה של גנום ויראלי הקשורים חלבונים לאורך כל הקורס של זיהום תניח את הקרקע כדי לחקור את הפרטים מולקולרית של תהליכים פועלים על הגנום הנגיפי, יספק תובנות אילו גורמים נגיפיים וסלולריות מעורבים בשלבים שונים של זיהום.

שיטות קודמות לחקירה של המארח גורמים מעורבים זיהום ויראלי לכלול טיהור זיקה של חלבונים נגיפיים לניתוח של החלבונים הקשורים2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. מבחני אלה סייעו לצורך הזיהוי של הגורמים המעורבים הסלולר מארח תגובות אנטי ויראליים, כמו גם השינוי כרומטין ויראלי, ביטוי גנים, ותיקון דנ א. עם זאת, קשה לאמת אם האינטראקציות תלויים השיוך vDNA ולאחר פרוטאומיקס רק לספק תובנות האינטראקציות המתרחשות כפונקציה של גורם ויראלי ספציפי. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) נעשה שימוש כדי לזהות איפה לאגד חלבונים נגיפיים וסלולריות ספציפיים הגנום הנגיפי10,11,12,13,14 , 15 ופלורסנט היברידיזציה (דגים) בשילוב עם immunocytochemistry אפשרה את הפריט החזותי של גורמים הסלולר colocalize עם vDNA16,17,18, 19 , 20. מבחני אלה מאפשרים יכולות ניתוח. עם זאת, מגבלות כוללים את הצורך של נוגדנים ספציפיים מאוד רגישות מוגבלת, הצורך הקודם תובנה וירוס מחשב מארח אינטראקציות. לכן פיתחנו שיטת עבודה המבוססת על iPOND (בידוד של חלבונים על ה-DNA nascent)21 , aniPOND (iPOND יליד מואצת)22 כדי לתייג באופן סלקטיבי ולטהר vDNA מן נגוע תאים לצורך זיהוי מוטים אפידמיולוגיה חלבונים הקשורים באמצעות ספקטרומטר מסה. iPOND היה אינסטרומנטלי החקירה של דינמיקה מזלג שכפול הסלולר.

לטיהור סלקטיבי של הגנום הנגיפי של תאים נגועים, שכפול vDNA נקראת עם ethynyl ששינה נוקלאוזידים, 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (אדו) או 5-ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) (איור 1), ואחריו קוולנטיות ההטיה כדי ביוטין אזיד באמצעות לחץ על כימיה כדי להקל על צעד בודד טיהור של הגנום הנגיפי וחלבונים הקשורים על חרוזים מצופים streptavidin (איור 2B). חשוב לציין, זיהומים מבוצעות בתאי נייח, אשר לא עוסקים הסלולר שכפול ה-DNA כדי לאפשר תיוג ספציפית של vDNA. יתר על כן, זיהום HSV-1 גורם מחזור מעצר התא, ומעכב הסלולר DNA שכפול23,24. הוירוס יכול להיות prelabeled לפני זיהום לניתוח של חלבונים הקשורים נכנסות הגנום הנגיפי (איור 1 א') או תווית במהלך שכפול ה-DNA על הניתוח של חלבונים הקשורים לאחרונה מסונתז vDNA (איור 1B) 25. יתר על כן, ניתוח צ'ייס הדופק יכול לשמש כדי לחקור את הטבע של חלבונים הקשורים שכפול ויראלי מזלגות (איור 1C)26. בנוסף, vDNA ethynyl-השתנה יכול מצומדת covalently כדי fluorophore לחקירה המרחבי של חלבון דינמיקה (2A איור , איור 3). הדמיה מאפשר פריט חזותי ישיר של vDNA היא גישה ללא תשלום עבור האימות של אינטראקציות חלבון vDNA, ניתן להתאים לאתר הגנום הנגיפי במהלך זיהום. אנו צופים כי הגישות האלה יכול להיות עוד יותר שונה ללמוד בכל היבט של זיהום herpesviral, לרבות השהיית הפעלה מחדש, וכדי ללמוד וירוסים אחרים, ה-DNA. יתר על כן, תיוג עם 5-ethynyl uridine (EU) עלולה לאפשר לניתוח של הגנום נגיפי RNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים, זיהום נגיפי ו- EdC תיוג ( איור 1)

בפרוטוקול הבא כרוך בעבודה עם וירוסים. נא עיין המוסד שלך ' s ביולוגית פרוטוקולים בדבר לטפל וירוסים ותוכנות אחרות ביולוגיים. פרוטוקול זה אושרה על ידי ועדת הבדיקה המוסדי של אוניברסיטת פיטסבורג.

  1. Trypsinize confluent 150 ס"מ 2 תרביות רקמה בקבוקון MRC-5 תאים ולהעביר את התאים צלחת תרביות רקמה 2 ס מ 600 המכיל 100 מ ל DMEM בתוספת 10% FBS. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 5% CO 2 3-4 ימים להגיע לשלב confluency, נייח. תבשיל 2 ס מ 600 confluent מכיל ~ 7 x 10 7 תאים. להכין לוח 1 עבור כל תנאי וצלחת 1 עבור כל פקד שלילי המתאים.
    הערה: תאים חייב להגיע לשלב נייח לעכב הסלולר שכפול ה-DNA כדי להבטיח את vDNA רק עם התווית וטיהרו בצעדים העוקבים.
    הערה: כל מדגם מחייבת ללא תשלום ללא תווית שלילית שליטה מוכנה תוך שימוש באותם תנאים זיהום ונקודת הזמן ללא התוספת של EdC.
    הערה: A את גירסת ניסוי זה צריך להתבצע במשולב עבור תיוג של DNA. תאית על ידי הדמיה באמצעות צמיחת תאים דומים, זיהום, EdC תיוג תנאים, ולבחון נקודות זמן (ראה שלב 2).
  2. לדלל 7 x 10 8 PFU HSV-1 ב- 7 mL קר Tris-Buffered מלוחים (TBS). להסיר את מדיום הגידול ולאחסן ב 37 º C. כדי להדביק, להוסיף את הוירוס מדולל 7-mL MRC-5 תאים ורוק לשעה בטמפרטורת החדר. בעקבות ספיחה, להסיר inoculum, לשטוף עם טמפרטורת החדר 50 מ ל TBS ולהחליף מדיום הגידול המקורי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות CO 5% 2. שלב זה צריך להתבצע עבור כל תנאי הניסוי והבקרה שלילי.
    הערה: תיוג EdC מוגברת יכולה להיות מושגת באמצעות מוטציות HSV-1 פגום עבור הביטוי dUTPase ויראלי (ג'ין UL50) ו/או glycosylase אורציל (UL2 ג'ין). DUTPase HSV-1 יש ירידה לפרטים המצע נמוך והוא יכול להקטין את ההפעלה של מספר nucleoside תחליפי 25 , 27-
  3. הגנום הנגיפי תווית עם EdC. בצע את ההוראות כדי להדביק תווית הגנום נכנסות (1.3.1.), שכפול הגנום (1.3.2.), או מזלגות שכפול ויראלי (1.3.3.).
    הערה: צעד אחד בלבד 1.3.1, 1.3.2 או 1.3.3 צריכה להתבצע בהתאם האם הגנום נכנסות, הגנום משוכפלת או מזלגות שכפול הן כדי להיות מנותח בשלבים הבאים, בהתאמה.
    הערה: EdU או f-עארה אדו. הרבה מכדי EdC. הרעילות של תחליפי nucleoside צריך להיות במעקב, ממוזער.
    1. שימוש prelabeled מניות לבצע זיהום ב- 1.2 שלב ולהמשיך לשלב 2 או 3 בתוך 4 שעות לפרסם זיהום. מדד מחירי הבתים (. של) לחקור את unreplicated vDNA ( איור 1 א').
      הערה: להכין וירוס prelabeled מניות באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל 25. וירוס מניות חייבים להיות מועברים דרך העמודה G-25 כדי להסיר כל EdC שיורית.
    2. תווית שכפול vDNA על-ידי הוספת 5-25 מיקרומטר EdC למדיום התרבות התא של התאים הנגועים עבור 2-4 h ( איור 1B). לפני הוספת, לדלל EdC ב 1 מ"ל של מדיום הגידול.
    3. לה תווית מזלגות שכפול ויראלי, לאחר תחילתה של שכפול vDNA (≥ מדד מחירי הבתים של 4), הדופק תווית שכפול vDNA עם 5-25 מיקרומטר EdC למשך 5-20 דקות. לרדוף אחרי, לשטוף 3 x עם צ'ייס בינוני המכיל 25-100 מיקרומטר 2´deoxycytidine (deoxyC), ואז דגירה במעמד בינוני צ'ייס עבור נוספים 20-40 דקות ( איור 1C).
      הערה: דופק וצ'ייס בינוני צריך equilibrated ל- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 לפני השימוש.
      הערה: לניסויים צ'ייס הדופק, חשוב לקחת בחשבון את כמות הזמן שלוקח נוקלאוזידים הזן את התא, להיות phosphorylated לפני שהם שניתן לשלבן שכפול ה-DNA. זה חייב להיקבע מדעית.
      הערה: כדי לקבוע את הרזולוציה של הדופק צ'ייס ניסויים, לחשב את קצב שכפול ויראלי בתנאים ניסיוני המשמש. זה יכול להיקבע על ידי PCR כמותי של הגנום הנגיפי במהלך הקורס 26 זמן צמיחה צעד בודד.
      הערה: הדמיה הגנום הנגיפי המשך לשלב 2 והמשך לטיהור של הגנום הנגיפי לשלב 3-

2. הדמיה של EdC שכותרתו דנ א ( איור 2 א)

הערה: מומלץ לבצע הדמיה במשולב עם שיטת טיהור גנום ויראלי כדי לוודא כי הדנ א הסלולר לא מתויג בניסויים. הדמיה יכול לשמש גם כדי להמחיש את טיב vDNA שכותרתו וכדי לאמת נתונים פרוטאומיקס. דוגמאות הסלולר, נגיפי DNA מכתים דפוסי מוצגות באיור 3.

  1. לבצע זיהומים ו EdC תיוג כפי שמצוין בשלב 1 חוץ באמצעות מדע פשוט התנאים על coverslips בקערה תרביות רקמה 12-ובכן המכיל 1 מ"ל של מדיום הגידול.
    2. Paraformaldehyde
  2. לתקן תאים עם 1 מ"ל 3.7% ב- 1 x PBS למשך 15 דקות ב- RT. לאחר קיבוע, שטיפה תאים 2 x עם 1 מ ל BSA 3% ב- PBS.
    התראה: Paraformaldehyde עלולה לגרום לפציעה חמורה או קבועה. בצע את אמצעי זהירות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה ואת coverslips שניתן לאחסן ב 4 ° C בכביסה השני עד 3 ימים.
  3. Permeabilize תאים עם 1 מ"ל permeabilization מאגר [ראה טבלה של חומרים] למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה.
  4. לשטוף עם 1 מ"ל של BSA 3% ולאחר מכן בלוק עם 1 מ ל BSA 3% ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה.
  5. להוסיף 1 מ"ל של התגובה לחץ קוקטייל [ראה טבלה של חומרים] כדי coverslips כדי covalently נזווג אלקסה עבור חיל הים 488 אזיד כדי EdC הנקרא DNA. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך נדנדה. האחות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.
  6. DNA הסלולר הכתם עם 1 מ"ל של 1:2,000 לדילול Hoechst ב- PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך נדנדה. האחות ולשטוף פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.
    7. Immunofluorescence עקיפה
  7. הכתם עם נוגדנים והמשניים בהתאם לתקן תקנות 25.
    הערה: עם תוויות vDNA colocalizes ICP8, ICP4 או UL42 ו מתויג הסלולר DNA colocalizes עם צביעת הכסט.
  8. לעלות coverslips על גבי שקופיות על התמונה תאים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
    הערה: שקופיות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.

3. טיהור של vDNA וחלבונים הקשורים

הערה: מספר היבטים של פרוטוקול זה הותאמו מ ליונג. et al. 22
הערה: כל מאגרי, ריאגנטים צריך להיות מקורר על הקרח לפני השימוש, כל הצעדים צריכה להתבצע על קרח אלא אם צוין אחרת.

  1. הקציר גרעינים.
    הערה: לפני ניתוקה של גרעינים, פורמלדהיד יכול לשמש crosslink חלבונים ל- DNA. שטיפת בתנאים המחמירים יותר יכול לשמש לאחר מכן במהלך טיהור DNA על חרוזים מצופים streptavidin. עבור crosslinking ותנאי שטיפת לראות. Sirbu et al. 21.
    1. להחליף את מדיום הגידול עם 20 מ ל מאגר החילוץ גרעינים (נב), תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם נדנדה מפעם לפעם. הגרעינים יהפכו לגלויים במיקרוסקופ.
    2. גרעינים מגרדים מהצלחת באמצעות תא במגרדת העברת צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,500 ב 4 ° C הצניפה גרעינים, למחוק את תגובת שיקוע.
      הערה: Trypan צביעת התכלת יכול לשמש כדי לאמת את ניתוקה של גרעינים מתאי.
    3. בעדינות מכך בגדר גרעינית ב 10 מ"ל PBS, העברת צינור חרוטי 15-mL, ו הצניפה מאת צריך שתוציאו 10 דקות ב 2,500 g x-4 ° C. לחלוטין להסיר PBS.
      הערה: גרעינים שיכול להיות קפוא, ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה. כדי לעשות זאת, resuspend בעדינות בגדר גרעיני 500 µL קפוא מאגר, דגירה הצינור באמבט קרח אתנול/יבש. חנות קפוא גרעינים ב-80 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, להפשיר גרעינים בטמפרטורת החדר, העבר במהירות קרח, להוסיף 10 מ"ל PBS, רוק בעדינות כדי לערבב, גלולה על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב g x 2,500 ב 4 ° C, ו להסיר לחלוטין PBS. הקפאת גרעינים עלול להניב תשואה מופחת.
  2. Covalently תרכיב ביוטין-אזיד כדי EdC הנקרא vDNA.
    1. Resuspend בגדר גרעיני בתגובה לחץ 10 מ"ל לערבב [ראה טבלה של חומרים] על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 5 פעמים עם pipet 10 מ ל-
      הערה: חשוב כי ריאגנטים הכלולים המיקס תגובת לחץ נוספים לפי הסדר שצוין.
    2. לסובב עבור h 1-4 מעלות צלזיוס. תוך כדי סיבוב להתכונן ולהירגע מאגרי B1, B2, B3 [ראה טבלה של חומרים].
    3. צנפה גרעינים על ידי צריך שתוציאו 10 דקות ב 2,500 g x-4 ° C. לחלוטין להסיר לחץ על תערובת התגובה ולשטוף בגדר מאת resuspending ב- 10 מ"ל PBS ובעדינות צריך שתוציאו 10 דקות ב g x 2,500 ב-4 מעלות צלזיוס
    4. Resuspend בעדינות את צניפה גרעינית ב 1 מ"ל PBS ואת העברת צינור microfuge 1.5 mL באמצעות טיפ פיפטה גדולה. גלולה גרעינים על ידי צריך שתוציאו 10 דקות-2,500-ג'י ב- 4 ° C. לחלוטין להסיר PBS והקפאת פלאש בחנקן נוזלי.
      הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, ניתן לאחסן גרעינים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס להקפיא הפשרת מסייע עם פירוק העוקבים אז מומלץ כי הגרעינים להיות פלאש קפוא גם כאשר הליך שלב 3.3 באותו יום.
  3. Lyse גרעינים, קטע הדנ א.
    1. להפשיר גרעינים על קרח, resuspend ב 500 µL B1 מאגר על-ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה על קרח במשך 45 דקות
    2. Sonicate דגימות 6 פעמים ב-30 s כל ב 40% משרעת באמצעות בדיקה microtip 3 מ מ. במקום דוגמאות על הקרח ב-30 s בין פולסים. לאחר sonication, דגימות אמור להופיע ברור, לא מעוננים.
      הערה: Sonication התנאים צריכים להיות אופטימיזציה עבור sonicators בודדים. לקבלת הוראות מפורטות על איך לייעל את התנאים sonication להפנות ליונג. et al. 22.
    3. גלולה שאריות תאים על-ידי צריך שתוציאו ב 14,000 g x 10 דקות ב 4 º C. גודל צניפה צריך להקטין באופן משמעותי. לסנן את תגובת שיקוע דרך 100 מיקרומטר תא מסננת ולשמר את הזרימה.
    4. µL 500 להוסיף מאגר B2 כדי µL מסוננים תגובת שיקוע. 900 של דוגמה זו תשמש בשלב 3.4.2.
    5. לקחת את aliquot של כל תנאי עבור בידוד של דנ א (50 µL או כרך 1/20) ולהוסיף 50 µL 2 x מרחביות-ביקרבונט פתרון [ראה טבלה של חומרים]. להמשיך פרוטוקול בידוד של דנ א (שלב 3.6).
    6. לקחת את aliquot של כל תנאי עבור קלט חלבון (50 µL או כרך 1/20) ולאחר להוסיף 50 µL 2 x מאגר מדגם Laemmli, להקפיא במצב חנקן נוזלי ולאחסן ב- 80 ° C. שימוש בשלב 3.5.6.
  4. Biotinylated איגוד ה-DNA כדי streptavidin מצופה חרוזים.
    1. Streptavidin T1 להכין beads מגנטי על-ידי העברת µL 300 של חרוז slurry צינור microfuge 1.5 mL. להכין את שפופרת אחת של חרוזי לדגימה. שטיפת חרוזים 3 x 1 מ ל מאגר B2 vortexing כדי resuspend, החלת מגנט כדי להפריד את החרוזים ועל כ רפה בעברית המאגר לשטוף.
      הערה: אופטימיזציה מחייב תוצאה תנאי התשואה מוגדל ואיגוד רקע מינימלי. השפעול נקבע כי beads מגנטי Streptavidin T1 יש יכולת איגוד גדול יותר באופן משמעותי מאשר חרוזים agarose, כמו גם חרוזים Streptavidin אחרים, ופחות רקע מחייב מאשר Streptavidin C1 חרוזים ( איור 4A ).
    2. הוסף 900 µL מדגם מהשלב 3.3.4. ואליה לסובב את החרוזים רחץ לילה ב-4 מעלות צלזיוס
      הערה: האם לא מערבולת חרוזים ברגע מדגם מתווסף להם.
      הערה: אם כמות משמעותית של דנ א או חלבון מבודדים בפקד תווית שלילית, שלב זה אפשר לצמצם מ לילה 4 h כדי להפחית את הרקע איגוד.
  5. Elute vDNA, חלבונים הקשורים וקונטה חרוזים.
    הערה: מומלץ להשתמש במסנן טיפים עבור השלבים הנותרים.
    1. דגימות מקום בארון צינור microfuge מגנטי, הסר תגובת שיקוע, בעדינות resuspend ב 1 מ"ל מאגר B2, סובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.
    2. חזור על שלב 3.5.1 שלוש פעמים.
    3. במקומו את הדגימות לתוך מתלה צינור microfuge מגנטי, להסיר את תגובת שיקוע, בעדינות resuspend ב 1 מ"ל מאגר B3, וסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק.
    4. העברת 100 µL חרוז התערובת (1/10 בתאנון נפח) עד צינור בידוד ה-DNA מאוגד. להחיל את הצינור הזה על המגנט, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend חרוזים ב 100 µL 1 x מרחביות-ביקרבונט פתרון והמשך בפרוטוקול בידוד ה-DNA (שלב 3.6).
    5. להחיל את הצינור המכיל את התערובת חרוז הנותרים 900 µL מ שלב 3.5.3. למגנט, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend חרוזים ב- 50 µL 2 x Laemmli מאגר הדגימה כדי elute חלבון לבין מכלולי חלבון-דנ א.
    6. לרתיחה דגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מערבולת, לסובב, microfuge, ובמהירות להחיל מגנט. Eluate להעביר צינור חדש, הקפאת פלאש, חנות ב-80 מעלות צלזיוס
      הערה: שימוש מנעולים כובע כדי להבטיח כי צינורות לא צצים פתיחת תוך הרתחה.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול בשלב זה, דוגמאות שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
    7. ניתוח דגימות חלבון כחול Coomassie מכתים, סופג המערבי או ספקטרומטר מסה מאת נהלי 25. התוצאות נציג מוצגים באיור 4, איור 5.
      הערה: כדי לקבוע אם התשואה חלבון מספיקה ספקטרומטר מסה, 7.5 µL של כל מדגם משמש לצורך ניתוח כחול Coomassie מכתים ומקושרת µL 7.5 עבור סופג המערבי של גנום ויראלי נציג חלבון (ICP4, ICP8 או UL42). באותו אמצעי אחסון של lysates מ שלב 3.3.6. פועלים לצד לפקד עבור רמות החלבון קלט. המדגם הנותרים (35 µL) מכן נותחו על ידי מסה ספקטרומטר כפי שתואר לעיל 25.
  6. בידוד ה-DNA
    1. דגירה בדגימות מצעדי 3.3.5. ואת 3.5.4. ב 65 מעלות צלזיוס במשך 4-16 ה' הסר לדגום beads מגנטי, במידת הצורך.
    2. לחלץ דוגמיות עם µL 150 פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (PCI) ולהעביר את פאזה מימית צינור חדש.
    3. לחלץ את PCI הנותרים עם 100 µL טריס-EDTA (TE) ולהוסיף את פאזה מימית צינור חדש.
    4. לחלץ דוגמיות עם אלכוהול כלורופורם: isoamyl µL 200 (24:1).
    5. לטהר את פאזה מימית באמצעות ערכת טיהור PCR על פי היצרן ' פרוטוקול s.
      הערה: מחוון ה-pH ב PB מאגר יהפוך סגול כאשר הוסיף את הדגימה. להוסיף 10 & #181; L-3 מ'-NaOAc-pH 5.0 כדי להקטין את רמת ה-pH של המדגם-
    6. DNA לקבוע ריכוז באמצעות fluorometer.
      הערה: פרוטוקול זה בדרך כלל מניבה 100-400 ng חרוז מכורך DNA. אין דנ א צריך לזהות את eluate של הפקד שלילי שבו EdC לא נוספה ב- 1.3 צעד.
    7. דנ א יכול להיות מאוחסן איגוד ה-DNA נמוך צינור על 4 או - 20 ° C, ניתן להשתמש עבור ה-PCR בזמן אמת או ניתוח רצפי התפוקה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השימוש לחץ כימיה לטיהור של ה-DNA של תאים בוצעה לראשונה על ידי שיטת iPOND21. מטרת iPOND היא לטהר מזלגות שכפול הסלולר לצורך זיהוי חלבונים הקשורים. אנחנו הסתגלו טכניקה זו ללמוד אינטראקציות חלבון vDNA במיוחד במהלך זיהום. מניפולציה של הגישה לתייג הגנום הנגיפי עם EdC (איור 1), בשילוב עם זיהומים מסונכרן, אפשרה עבור בידוד סלקטיבי והחקירה של אוכלוסיות נפרדות vDNA. DNA HSV-1 מסומן עם EdC (איור 1) כדי להקל על הקובץ ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים אשר, אם לא עקבו בזהירות, עלולה לגרום התשואה חלבון מופחתת באופן משמעותי או זיהום עם תאי ה-DNA. . זה קריטי כי נייח תאים משמשים לניסויים כל כדי להבטיח כי DNA הסלולר לא מתויג, מטוהרים זה יכול להיות מאושרות על ידי העדר polymerases DNA הסלולר במדגם חלבון כי HSV-1 לא לנצל את הסלולר DNA פולימראז של הגנום סינתזה. במהלך EdC תיוג גרעינים קציר צעדים, דגימות צריך להיות התנודד כדי להבטיח כי כל אחד מעובד באופן שווה. במהלך שלבי טיהור, להקפיד לא אתמרן גרעינים על-ידי pipetting מדי. זה יכול להוביל פירוק מוקדמת ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו להכיר חנה פוקס לעזרה בהכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH הענק R01AI030612.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי MRC-5ATCCCCL-171
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco26140-179
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-082מוחלף ב-10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 12 mM  (לגידול בצלוחיות) או 30 מ"מ (לגידול בכלים) נתרן-ביקרבינאט
600 ס"מ2 צלחת תרבית רקמותThermo Fisher Scientific166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 491 מ"מ MgCl, 680 מ"מ CaCl, 25.1 מ"מ
HSV-1מלאי עם טיטרים גדולים מ-1x109 PFU/mL עובד בצורה הטובה ביותר
ספדקס G-25  טור (עמודת התפלה PD-10)GE Healthcare17085101
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)פישר סיינטיפיקD128-1
5´-אתיניל-2&אקוטי;-דאוקסיציטידין (EdC)סיגמא-אולדריץ'T511307ממיסים ב-DMSO להכנת מלאי של 40 מ"מ, מכילים ומאחסנים ב-20 מעלות; C 
2´-deoxycytidine (deoxyC)Sigma-AldrichD3897ממיסים במים להכנת ציר של 40 מ"מ, aliquot, ומאחסנים בטמפרטורה של -20° C 
מאגר מיצוי גרעיני (NEB)הכן טרי (20 מ"מ Hepes pH 7.2, 50 מ"מ NaCl, 3 מ"מ MgCl2, 300 מ"מ סוכרוז, 0.5% Igepal)
מגרד תאיםזכוכית Bellco7731-22000חיטוי לפני השימוש
תמיסה כחולה טריפאןSigma-AldrichT8154
PBS, pH 7.2 (10x)1.37 מ' NaCl, 27 מ"מ KCl, 100 מ"מ Na2HPO4, 18 מ"מ KH2PO4 (לדלל ל-1x במים סטריליים לפני השימוש)
נחושת (II) סולפט פנטהידראט (CuSO4-5H2O)Fisher ScientificC489הכן מלאי של 100 מ"מ ואחסן ב-4 מעלות; C עד חודש
(+) נתרן L-אסקורבטSigma-AldrichA4034הכן טרי מלאי 100 מ"מ ואחסן על קרח עד לשימוש
בביוטין אזידInvitrogenB10184הכן מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO, aliquot, ואחסן ב-20 מעלות; C לתקופה של עד שנה 
לחץ על תערובתהכן מיד לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים בסדר המצוין (10 מ"ל: 8.8 מ"ל 1x PBS, 200 מ"ל 100 מ"מ CuSO4, 25 מ"ל 10 מ"מ ביוטין אזיד, 1 מ"ל 100 מ"מ נתרן אסקורבט)   
קוקטייל מעכב פרוטאז שלםRoche11697498001ממיסים ב-1 מ"ל מים להכנת ציר פי 50, ניתן לאחסן ב-4 מעלות; C עד שבוע, או הוסף ישירות כדור אחד למאגר 50 מ"ל
מאגרהכן טרי (7 מ"ל 100% גליצרול, 3 מ"ל NEB, 200 μ מעכב פרוטאז L 50x)
בופר B1הכן טרי (25 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)
מאגר B2הכן טרי (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x מעכב פרוטאז)
מאגר B3הכן טרי (150 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, 50 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1x מעכב פרוטאז)
מעבד Vibra Cell Ultra Sonic מצויד בבדיקה 3 מ"מmicrotip SonicsVCX 130
מסננת תאיםFalcon352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Life Technologies65601
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
מיני צינור מסובבפישר סיינטיפיק260750F
2x Laemmli מאגרמערבבים 400 מ"ג SDS, 2 מ"ל 100% גליצרול, 1.25 מ"ל של 1 M Tris (pH 6.8) ו-10 מ"ג ברומופנול כחול ב-8 מ"ל מים. אחסן ב-4  ° C עד 6 חודשים. לפני השימוש הוסף 1 M DTT לריכוז סופי של 200 מ"מ.
מנעולי מכסה לצינור 1.5 מ"לפישר סיינטיפיקNC9679153
ריאגנטים
NOVEX ערכת צביעה כחולה קולואידיתInvitrogenLC6025
צלחת תרבית רקמות 12 בארותקורנינג3513
CoverslipsFisher Scientific12-545-100אוטוקלאב לפני השימוש
שקופיות מיקרוסקופפישר סיינטיפיק12-552-5
16% פרפורמלדהידאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי15710לדלל ל-3.7% ב-1x PBS לפני השימוש
אלבומין בסרום בקר (BSA)Fisher ScientificBP1605הכן 3% ב-1x PBS
מאגר פרמיביליזציה (0.5% טריטון-X 100)Sigma-AldrichT8787הכן 0.5% טריטון-X 100 ב-1x PBS
קוקטייל תגובת קליק - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 ערכת הדמיהבדיקות מולקולריותC10337הכן לפי פרוטוקול היצרן
Hoechst 33342Life TechnologiesH1399הכן 10 מ"ג/מ"ל במים, יכול לאחסן ב-4 מעלות; C למשך עד שנה
עכבר נגד ICP8 נוגדן ראשוניAbcamab20194השתמש בדילול של 1:200 בנוגדנים ראשוניים 1x PBS
Mouse anti-UL42 (2H4)Abcamab19311השתמש בדילול של 1:200 ב-1x PBS
עז נגד עכבר 594-מצומד נוגדן משניLife Technologiesa11005השתמש בדילול של 1:500 ב-1x PBS
Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
2x תמיסת2% SDS, 200 מ"מ NaHCO3
פנול: כלורופורם: אלכוהולמערבבים 25:24:1 לפחות יום אחד לפני השימוש, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C בכלורופורם הכהה
: אלכוהולמערבבים 24:1 לפחות יום אחד לפני השימוש, יש לאחסן בטמפרטורת החדר בחושך
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0100 מ"מ Tris, 10 מ"מ EDTA (לדלל ל-1x לפני השימוש)
ערכת טיהור Qiaquick PCR Qiagen28104
3 M נתרן אצטט pH 5.2
קיוביט 2.0 פלואורומטרInvitrogenQ32866
ערכת בדיקה של Qubit dsDNA HSInvitrogenQ32851
צינורות בדיקת QubitInvitrogenQ32856
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד בתוכנת
מיקרוצנטריפוגה לצינורות
צנטריפוגה שולחנית לצינורות
תא חממת
ארון
גושי65 מעלות; C ו-95 מעלות; ג
מלאי Tricine תגובה הקפאה דגימה מערביים סטנדרטיים SDS-bicarb איזואמיל איזואמיל הדמיה1.5 מ"ל15 ו-50 מ"לתרבותבטיחות ביולוגית חום

מקורות

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields virology. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).
  2. Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
  3. Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242(2013).
  4. Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
  5. Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
  6. Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
  7. Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
  8. Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
  9. Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
  10. Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
  11. Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
  12. Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
  13. Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
  14. Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
  15. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
  16. Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).
  17. Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
  18. Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
  19. Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
  20. Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).
  21. Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
  22. Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
  23. Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
  24. Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
  25. Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).
  26. Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).
  27. Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
  28. Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
  29. Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
  30. Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAClick ChemistryDNADNA

מאמרים קשורים