מאמר שיטה

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56401

⸱

20 בדצמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, Loma Linda University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.

תקציר

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצת 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי מולקולות (MHC-ליברות). נתונים עדכניים מראים כי מולקולות Qa-1 לשחק תפקידים חשובים ב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית, ויסות מערכת החיסון וגורם והגבלת תגובות החיסונית זיהומים וירליים. בנוסף, הגדלת פונקציונלי של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באמצעות epitope התחסנות הראו השפעות טיפוליות במספר מחלות אוטואימוניות בעלי חיים דגמים, למשל ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה, קולגן-induced דלקת מפרקים, סוכרת ולא שמנים. לכן, יש צורך דחוף שיטה ביעילות ובמהירות לזיהוי פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל CD8 Qa-1-מוגבל+ תא T שורות ספציפיות עבור ספריה פפטיד (OLP) חופפים לקביעת Qa-1 epitopes של חלבון. ספריית OLP זו מכילה 15-מר פפטידים חופפים המכסות לכל האורך של חלבון, פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו לאחרונה epitope Qa-1 9-מר בגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (ש א). זה epitope ש א Qa-1 ממופה לאחרונה הוצגה לזירוז CD8 ספציפית epitope, Qa-1-מוגבלת+ T תאים תקנה המערכת החיסונית משופרת הזה ספציפית מיאלין. לכן, פרוטוקול זה שימושי בעתיד לפתוח בחקירה של הרומן יעדים ופונקציות של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים.

מבוא

Qa-1 שייך לקבוצה של 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי (MHC-ליברות) מולקולות בעכברים. Homolog האנושי שלה הוא הלע-אי ראיות קודמות הוכיחה כי מולקולות Qa-1 יש תפקודים ביולוגיים חשובים. ראשית, מולקולות Qa-1 משחק תפקיד חשוב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית. בהקשר זה, Qa-1 מולקולות התפתחו מספר אסטרטגיות כדי לנטר את התיפקוד הרגיל של תא. אסטרטגיה אחת כזו מאפשרת מולקולות Qa-1 ל קומפלקסי טופס עם מנהיג מעובד פפטיד (epitope), כלומר ה-Qa-1 הקובע צירוף (אותה לא ישכחו במהרה) המעובדים של מולקולות MHC-Ia קלאסית רשתית תוך-פלזמית1. אלה של Qa-1/אותה לא ישכחו במהרה מתחמי מאוחר יותר להציג על פני השטח של התא, להיקשר לקולטנים NKG2A מעכבות בתאי NK לעכב NK הורג פעילות2. אם הביטוי של מולקולות MHC-Ia אובד, תא (למשל תא ממאיר) הופך רגיש NK להרוגשניים. האסטרטגיה אחרים מאפשר Qa-1 מולקולות להקים מתחמי Qa-1/epitope חדשים על פני התא בנכונותם ברז (טרנספורטר המשויך עיבוד אנטיגן)3 ו/או ERAAP (aminopeptidase רשתית תוך-פלזמית המשויך עיבוד אנטיגן)4 (שני ליקויים לעיתים קרובות להתרחש בתאים ממאירים). התא המבטאת אלה מתחמי Qa-1/epitope חדש יכול להיות מזוהה ואז חוסל על ידי epitope ספציפיים CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים. שנית, Qa-1 מולקולות זירוז מערכת החיסון תקנה5. בהקשר זה, מתחמי Qa-1/epitope הוכחו לעורר CD8+ הרגולציה ותאי T (Treg) חשובים למניעת נזקי בתיווך החיסון העצמי-רקמות6,7,8 ,9,10. שלישית, CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים הוכחו להגביל את תגובות מערכת החיסון נגד זיהום ויראלי11.

לכן, הגדלת ספציפי של CD8 Qa-1-restrictred epitope ספציפי+ T תאים היא אסטרטגיה פוטנציאל מבטיח עבור חיסול של תאים חריגים, על השיפור של ויסות מערכת החיסון ועל לפקד על המשמעות של תגובות חיסוניות הנוצרות על-ידי וירוס. בזמן זה טרם נקבע אם תוספת ספציפית epitope CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באפשרותך לשפר את המערכת החיסונית מעקב ולהגביל הנוצרות על-ידי וירוס תגובות חיסוניות, מעבדות שלנו ואחרים בבירור הוכיחו את זה חיסון epitopes Qa-1 יכול להגדיל את הפונקציה של CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים ספציפיים עבור פתוגניים CD4 אוטואימוניות+ T תאים, שמוביל שליטה יעילה של CD4+ T תאית מחלות אוטואימוניות ב מגוון רחב של החיות מודלים כגון6,ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה (במודל חיה של טרשת נפוצה אנושי)10, דלקת מפרקים הנגרמת קולגן (במודל חיה של דלקת מפרקים שגרונית אנושי)7, ו סוכרת שאינו שמנים (במודל חיה של האדם סוג 1 סוכרת)8. בנוסף, גילינו כי חיסון epitope Qa-1 רקמות ספציפיות מוביל פקד מסוים של דלקת החיסונית בתיווך תפולס דרך הגדלת של CD8+ Treg תאים12. ההצלחות לעיל של מחקרים פרה להצביע על הערכה מלאה התחסנות epitope Qa-1 לטיפול של רקמות ספציפיות בתיווך החיסונית מחלות ואפשרות עבור הטיפול במחלות אחרות המשויכות ליקויים ברז, ERAAP.

בהתאם לכך, יש ביקוש טכנולוגיה ניתן באמינות ובמהירות לנתח Qa-1 epitopes של חלבון. בהקשר זה, תואר מספר מוגבל של epitopes Qa-1 חשוב מבחינה ביולוגית. רוב epitopes Qa-1 אלה זוהו serendipitously במהלך המחקר של CD8+ T תא התגובות חיידקים13, לקוי ברז3תאים, התאים לקויה ERAAP4ותאים הגורמות EAE6, 9. לכן, טכניקה תפוקה גבוהה רצוי לצורך זיהוי ביולוגית חשובה epitopes Qa-1 בחלבון מוגדר. בחלק זה, אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד (OLP) חופפים הממפה פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון באמצעות CD8 Qa-1-resrticted+ תא T שורות ספציפיות עבור הבריכה OLP (OLP_pool) של חלבון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נעשו בהתאם, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש בפרוטוקול שאושרו על-ידי חיה אכפת והוועדה שימוש ב אוניברסיטת טקסס El Paso ובאוניברסיטה לומה לינדה.

1. דור של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון

  1. עיצוב ספריה OLP שבו כל פפטידים 15-מר אורך הינם פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו.
    הערה: במחקר OLP ש א, רצף למבשר ש א [ס. מאסכאלאס] אוחזר ממסד חלבון NCBI דרך לינק זו: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. מבשר ש א (247 חומצות אמינו), אשר הכיל אות וגם פפטידים בוגרת, שימש כי רוב epitopes Qa-1 (הלע-E) שדווח אותרו אות פפטידים (למשל אותה לא ישכחו במהרה1). החל שלה אמיני, הרצפים של פפטידים 15-מר אותרו כך שני פפטידים סמוכים חפפו ידי חומצות אמינו 11 (איור 1). לפיכך, OLPs 59 בדיוק אותרו בחומצת אמינו 247 ש א מבשר. עם זאת, OLP האחרון יכול לנוע בין 12 עד 15-מר בהתאם לאורך של החלבון. בנוסף, אנו בוחרים ספריית 15-מר כי אנחנו ואחרים הראו כי 15-מר פפטידים, בעת הוספת תאים דנדריטים (Dc) או מקרופאגים, יכול להיות יעיל מעובד epitopes להכרה על ידי CD8+ T תאים14,15 .
  2. לרכוש כל פפטיד בודדים מסחרית. 5 מ"ג לכל פפטיד צריך להיות מספיק להקרנה. OLPs קטום פפטידים (6.1 שלב) יכול להיות desalted פפטידים (טוהר הוא כ- 50-70%). הטוהר של פפטיד אופטימלית (שלב 6.2) ייעשה שימוש עבור הדור של tetramer, שניתוח ביולוגי צריך להיות > 90%. לשקם את פפטידים בתנאי סטרילי.
  3. להפוך 50 מ"ג/מ"ל מניות בודדות פפטיד דימתיל סולפוקסיד 100%. עבור 5 מ"ג של כל פפטיד, להוסיף 100 μL של דימתיל סולפוקסיד לתוך כל שפופרת, לערבב, ולאחסן את פפטידים ב-20 ° C. מניות אלה ישמש כדי להפוך את המניות של OLP_pool עבור הדור של CD8+ תא T קווים תגובתי ל OLP_pool. בנוסף, מניות אלה יהיו אף הן בשימוש כדי להפוך 10 מ"ג/מ"ל מניות בודדות פפטיד בקביעת היכולת של כל פפטיד בודדים כדי לעורר תגובה Qa-1-מוגבלת ב- CD8 תגובתי OLP_pool+ תא T קו.
  4. יצירת מלאי OLP_pool על-ידי הוספת אמצעי שווה של כל פפטיד לתוך צינור טריים. מלאי OLP_pool זה מכיל דימתיל סולפוקסיד 100%. במחקר OLP ש א, היו 59 OLPs12 לכן, ריכוז של כל פפטיד ב OLP_pool היה 847.46 μg/mL (50 מ"ג/מ"ל ÷ 59).
  5. להפוך את 10 מ"ג/מ"ל מניות פפטיד בודדים על-ידי המדללת (x 5) המניה 50 מ"ג/מ"ל סטרילי H2O בצלחת התחתונה V 96-ובכן (מלאי זה מכיל 20% דימתיל סולפוקסיד). להפוך את המניות האלה צלחת 96-ובכן כי הקביעה של התגובה Qa-1-מוגבלת של כל פפטיד בודדים יבוצעו בצלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי של 8 או 12-ערוץ.
    הערה: כל פפטידים, כולל OLPs ופפטידים קטום, יש לדלל בצלחת או V-התחתון 96-ובכן או ארון מדגם 96-ובכן מלא עם צינורות 1 מ"ל מאז ההקרנה ספריית פפטיד מתבצע ב 96-ובכן צלחות באמצעות פיפטה רב-ערוצי. אם קשה לדלל פפטיד, להוסיף טיפה N NaOH 1 חכם לעזור לפזר את פפטיד.

2. לקרקע של Kb-/- Db-/- CD8+ תאי T עם K פעמו OLP_poolb-/- Db-/- תאים דנדריטים (Dc).

הערה: ישנם שני אללים Qa-1 העיקריים: אחת היא Qa-1, והשני הוא Qa-1b. מאז בעלי החיים הנפוץ עבור מחקר אקדמי, למשל C57BL/6 ועכברים Balb/c, לשאת Qa-1b, פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור מיפוי Qa-1b epitopes של חלבון. CD8+ T תאים המשמשים פרוטוקול זה כבר טהור מ Kb-/-Db-/- עכברים (רקע C57BL/6) ב- CD8 אילו+ T תאים מוגבלים בעיקר על ידי מולקולות MHC-ליברות-קלאסי כולל Qa-1.

  1. לייצר DCs הנגזרות מח עצם כמו שתואר לעיל12.
    1. בקצרה, תרבות מח עצם תא בודד המתלים (1 x 106 תאים/mL) RPMI-10 בינוני (RPMI 1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית, 5.5 x 10-5 מ' מרקפטואתנול 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצת אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ) המכילה 10 U/mL IL-4 ו- 100 U/mL GM-CSF בצלחת 6-טוב (4 מ ל/טוב) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    2. יומיים לאחר מכן, להסיר תאים שאינם מחסידי היטב ולהוסיף מדיה טריים ציטוקינים.
    3. לאחר culturing התאים ביומיים, העברה שאינם מחסידי תאים המכילים ציטוקינים ומדיה חדשה לתוך צלחת 6-באר חדשה.
    4. התרבות התאים ביומיים, מתחדש עם ציטוקינים המכיל LPS ומדיה טריים (0.1 µg/mL) כדי להפעיל את בקרי התחום.
    5. 24 שעות לאחר מכן, לאסוף Dc לניסויים.
  2. . להאיר את בקרי התחום עם 3000 ראד...
    1. לחלופין, מתייחסים Dc (5 x 107 תא/mL) עם מיטומיצין C (50 μg/מ"ל) ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דק להוסיף RPMI-0 (RPMI 1640 ללא סרום) כדי למלא את הצינור (~ 12 mL), לסובב את התאים עבור 10 דקות ומפרידה שולחני 300 ג' להשליך supernatants ו- repea t ההליך כביסה עוד פעמיים. אלה שלושה שוטף הן קריטיות כי כל הסכום שמץ של מיטומיצין C עלול לעכב את התגובה של CD8+ T תאים במהלך התרבות שיתוף של התא DC-T.
  3. התאם את הריכוז DC ל 5 x 106 תאים למ"ל במדיום נטול סרום (AIM-V ללא סרום בינוני בתוספת 5.5 x 10-5 מ' מרקפטואתנול 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצת אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ).
  4. הוסף את הפתרון מניות OLP_pool, אשר מכיל 100% דימתיל סולפוקסיד, אוגי כזה ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי יהיה 0.5% (200 x). במחקר OLP ש א, היה הריכוז של כל OLP, OLP_pool 847.46 μg/mL; לכן הריכוז הסופי של כל OLP בתרבות DC היה 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
עם זאת, וניתן לשנותם הריכוז הזה עד 100 μg/mL כל עוד הריכוז דימתיל סולפוקסיד בתרבות תא נשאר פחות מ 1%.
  • דגירה Dc בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות, לנער את התאים בעדינות כל 15 דקות.
  • במהלך תקופת הדגירה לטהר CD8+ T תאים מן הטחול שנקטפו או הלימפה של Kb-/-Db-/- עכברים באמצעות CD8 מסחרי של+ T תא ערכת טיהור, להתאים את הריכוז תא ל 10 x 106 תאים/מ ל המדיום ללא סרום המכיל U/mL 50 אינטרלוקין 2 (il-2) ו- U/mL 100 של IL-7.
  • כעת, הוסף את CD8+ T תאים לתוך צלחת 48-טוב כמו 0.5 mL/טוב (לאחר התוספת של 0.5 mL/טוב של בקרי התחום פעמו OLP_pool ב שלב 2.8, הריכוז הסופי של CD8+ T תאים יהיה 5 x 106 תאים/מ ל...).
    הערה: CD8+ T תאים מן העכבר הטחול ובלוטות הלימפה יכול להיטהר באמצעות ערכת בידוד חיובי CD8 על-ידי ביצוע ההוראה המסופקים על ידי היצרן. CD8+ T תאים שהושג חופשיים של חרוזים.
  • ספין למטה פעמו OLP_pool Dc (x 300 גרם, 10 דקות)-RT. לשקם Dc פעמו OLP_pool 2 x 106 תאים/מ ל מדיום נטול סרום ולהוסיף 0.5 mL/טוב המשקולת 48-ובכן המכיל את CD8+ T תאים (הריכוז הסופי של OLP DCs פעמו _pool הוא עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל, הריכוז הסופי של CD8+ T תאים הוא 5 x 106 תאים למ"ל, הריכוז הסופי של il-2 הוא 25 U/mL והריכוז הסופי של IL-7 הוא 50 U/mL). התרבות התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
  • יום 4, להסיר, למחוק כ-400 μL של המדיום תרבות ולהוסיף 500 μL של המדיום ללא סרום טריים המכילים 100 U/mL il-2 ו- 100U/mL של IL-7 כדי מכל קידוח. דגירה התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
  • ביום 7 או 8, לעורר מחדש את CD8 OLP_pool-איפה זה מונח+ T תאים עם OLP_pool.

    • 3. לרסטימולציה של CD8 להתקפת+ T תאים מקרופאגים פעמו עם OLP_pool

    1. ארבעה ימים לפני גירוי מחדש של CD8 טענתי OLP_pool+ T תאים, להכין 2% (v/v) לזיהוי חרוז פתרון: לשטוף 2 גר' לזיהוי חרוזים פעמיים ב- 20 mL ללא אנדוטוקסין H2O או PBS. גלולה את החרוזים לזיהוי על ידי צנטריפוגה (400 x גרם) במשך 5 דקות, resuspend ב 100 מ של PBS. אוטוקלב-15 ליברות/m עבור 20 דקות החנות בטמפרטורת החדר.
    2. מזריקים עכברים intraperitoneally 1 mL/עכבר של הפתרון חרוז לזיהוי 2% סטרילי כדי למשוך את ההעברה של monocytes/מקרופאגים חלל הצפק ה-16.
    3. ארבעה ימים לאחר מכן, להקריב את החיות כתוצאה ממנת יתר של2 CO.
      1. תחת תנאים סטריליים, לחתוך פתיחה קטנה במרכז הבטן כך הפתיחה הוא מספיק על העברת פיפטה העברה של 5 מ"ל. למלא את פיפטה העברה עם RPMI-0 והכנס את פיפטה לתוך חלל הבטן דרך הפתח.
      2. יש לשטוף את חלל הבטן על ידי pipetting. פיפטה החוצה כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מתוך חלל הבטן לתוך צינור סטרילי (אלו מקרופאגים הצפק). חזור על השלב שטיפה 4 - 5 פעמים.
    4. . להאיר את המקרופאגים הצפק עם 3000 ראד...
      1. לחלופין, פנקו את המקרופאגים הצפק עם מיטומיצין C (בצע ההליך המתואר בסעיף 2.2 שלב).
    5. התאם את ריכוז מקרופאגים הצפק 5 x 106 תאים/מ ל מדיום נטול סרום. הוסף מלאי OLP_pool (ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי הוא פחות מ 1%) ו- M-CSF (ריכוז סופי = 100 U/mL).
      הערה: במחקר זה ש א OLP ', השתמשנו דימתיל סולפוקסיד 0.5%. לפיכך, ש א OLP_pool המניה היה מדולל 200 x (למשל 1 μL של OLP_Pool ש א מניות נוספה לתוך 199 μL של מקרופאגים הצפק). לפיכך, הריכוז הסופי של כל OLP היה 4.2 μg/mL).
    6. הוסף μL 200 / (1 x 106 תאים/טוב) טוב בצלחת תרביות רקמה 48-ובכן, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    7. הסר את התאים שאינם מחסידי וחרוזים לזיהוי על ידי שטיפה עדין עם μL 200/טוב של ומחוממת מראש RPMI-0.
    8. לאסוף ובריכת OLP_pool טענתי CD8+ T תאים מ- 2.10 שלב. להתאים OLP_pool בשלה CD8+ תא T ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל במדיום נטול סרום המכיל 25 U/mL il-2 ו- 50 U/mL של IL-7. להוסיף 1 mL/היטב הצלחת 48-ובכן זה מכיל מקרופאגים הצפק פעמו OLP_pool.
    9. כעבור ארבעה ימים לחדש המדיום בצלחת 48-. טוב. להסיר ולמחוק כ-400 μL של המדיום תרבות לוחית התרבות 48-. טוב. להוסיף 500 μL של טרי בינוני ללא סרום המכיל 100 U/mL il-2 ו- U/mL 100 של IL-7 כל טוב. התרבות התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
    10. שלושה או ארבעה ימים מאוחר יותר, לבחון את CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ T תאים עבור תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת על ידי assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT). לאחר הנקודה הזו מחדש להמריץ את CD8+ T תאים כל 7-10 ימים.
      הערה: המקרופאגים עדיפים גירוי מחדש של CD8 טענתי OLP_pool+ T תאים. שמנו לב CD8+ T תאים מחדש מגורה על ידי מקרופאג גדל יותר DCs בתוך חוץ גופית.

    4. קביעת OLP_pool ספציפיים, התגובה Qa-1-מוגבלת CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ תא T קו

    הערה: תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ תא T קו נקבעת על-ידי הפרשת IFNγ בעקבות גירוי OLP_pool בנוכחות C1R או C1R. Qa-1b תאים באמצעות וזמינותו של IFNγ ELISPOT. תאים C1R ניתן להשיג באופן מסחרי. C1R. Qa-1b תאים יכולים להיווצר על-ידי transducing תאי C1R עם וקטור lentiviral Qa-1.

    1. להוסיף 100 μL/טוב של נוגדן anti-IFN-γ לכידת מדולל במאגר ציפוי (PBS) הבארות של צלחת ELISPOT.
    חותם, דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  • ביום השני, לבטל את המאגר ציפוי המכיל נוגדן anti-IFN-γ לכידת להוסיף 200 μL/היטב-blocking פתרון (ללא סרום בינוני), דגירה את הצלחת. בשביל 2 h בטמפרטורת החדר.
  • להאיר את C1R ואת C1R. Qa-1b תאים עם 9,600 ראד.
    1. לחלופין, לפנק את C1R ואת C1R. Qa-1b תאים עם מיטומיצין C כפי שמתואר על 2.2 שלב חוץ מזה זמן הטיפול יהיה 30 דקות.
  • להתאים את C1R ואת C1R. Qa-1b תאים במדיום נטול סרום 4 x 106 תאים/מ.
  • למחוק את הפתרון חסימה בצלחת ומוסיפים את C1R ואת C1R. תאים Qa-1b -50 μL/טוב (200,000 התאים היטב), לערבב.
  • מוסיפים μL 50/טוב של 100 x מדולל OLP_pool מניות (של המדיום ללא סרום) ומערבבים היטב. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 2-3 h.
  • התאם את CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ T תאים 1-2 x 106 תאים למ"ל במדיום נטול סרום המכיל 150 U/mL של IL-7 ולהוסיף μL 50/טוב (50,000-100,000 תאים/טוב) לצלחת. Centrifuge את הצלחת (58 x g) במשך 5 דקות.
  • דגירה לצלחת-CO של 37 ° C ו- 5%-2 בלילה.
  • האחות תא ההשעיה. רחץ בארות 2 פעמים עם מים (DI) יונים (250 μL טוב). לאפשר בארות כדי משרים למשך 5 דקות בכל שלב שטיפה.
  • תשטוף בארות 3 פעמים עם מאגר לשטוף אני (PBS המכילה 0.05% Tween20). לאפשר בארות להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה. מאגר השטיפה השלך.
  • להוסיף 100 μL של זיהוי נוגדנים מדולל במאגר דילול (PBS המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS)).
  • דגירה הלוחות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  • לבטל את זיהוי נוגדנים פתרון. רחץ בארות 3 פעמים עם 250 µL/טוב לשטוף את מאגר א לאפשר וולס להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה.
  • להוסיף 100 μL/טוב של אנזים המספר המשלים (Streptavidin-HRP) מדולל במאגר דילול-מטריים דילול.
  • דגירה הלוחות לשעה בטמפרטורת החדר.
  • למחוק פתרון תרכיב אנזים. רחץ בארות 4 פעמים עם 250 µL/טוב לשטוף את מאגר א לאפשר וולס להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה.
  • רחץ בארות 2 פעמים עם µL 250/II מאגר לשטוף (PBS) טוב.
  • להוסיף 100 µL של פתרון המצע (לערבב טיפה 1 = 20 µL של AEC Chromogen עם 1 מ"ל של מצע AEC) כל טוב. לפקח על פיתוח ספוט למשך 5 עד 60 דקות.
  • כאשר התוצאות הרצויות מתחילים להופיע, להפסיק את התגובה המצע ע י שטיפת וולס עם מים מזוקקים.
  • מילה נהדרת הלוחות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או למשך הלילה עד שהכל יבש לחלוטין. הסרה של מגש פלסטיק תחת לוחיות הרישוי יקל על ייבוש. חנות צלחות בשקית ניילון אטומה בחושך עד זה ניתוח.
  • לספור נקודות באופן ידני על-ידי בדיקת במיקרוסקופ ויבתר או שימוש בקורא צלחת ELISPOT. לראות את התוצאה נציג באיור2.

    • 5. קביעת פפטידים OLP_pool הפרט אשר לעורר את הפרשת IFN-γ מוגבלת Qa-1 ב- CD8 OLP_pool ספציפיים+ קו תא T

    1. לקבוע את פפטידים בודדים כי לעורר את ספציפי OLP_pool, הפרשת IFN Qa-1-restrictred-γ ב- CD8 OLP_pool הספציפיים+ קו תא T באמצעות לעיל תיאר IFN-γ ELISPOT assay (הריכוז הסופי של כל פפטיד בודדים בשימוש ELISOPT assay היא μg/מ"ל). ראה תוצאות נציג באיור3.
      הערה: ספציפי OLP, Qa-1-restircted תגובה מוגדרת כתגובה זה לפחות שלוש פעמים של התגובה בנוכחות C1R. Qa-1b תאים אבל בלי את OLP. מחקר ש א OLP, OLP68, OLP96 ו OLP105 כל הקריטריונים הללו. לכן, כל OLPs שלוש העלולים להכיל Qa-1 epitopes12 (איור 3). עם זאת, OLP105 בעקביות התפללתי התגובה החזקה; לפיכך ביצענו ניתוח מפורט של OLP105 (איור 4 , איור 5)12.

    6. זיהוי של Epitope Qa-1 אופטימלי ב- OLP 15-מר אשר מעוררת את התגובה Epitope ספציפיים, Qa-1-מוגבלת CD8 ספציפי OLP_pool+ קו תא T

    1. לסנתז C - ו N-סופני נחתך פפטידים של OLP 15-mer כפי שמוצג באיור4.
    2. לבחון את הפרשת IFN-γ ב CD8 ספציפי OLP+ תא T קו על ידי גירוי של CD8+ T תאים עם כל אחד של פפטידים קטום, כמו גם את OLP 15 הורים-מר בנוכחות C1R או C1R. Qa-1b תאים באמצעות לעיל תיאר assay IFN-γ ELISPOT. הריכוז הסופי של כל פפטיד בודדים המשמשים את הבדיקה ELISPOT היא μg/מ"ל. פפטיד מוגדר של האופטימלית epitope Qa-1 אם פפטיד: 1) בעקביות נותן תגובה IFN-γ דומים או חזקה יותר, לעומת 15-מר פפטיד המקורי, בנוכחות C1R. Qa-1b תאים; 2) הוא בין 8 - 10-mer (פפטיד 9-מר העדיף) אשר הם המרחק פפטיד מאוגדים MHC-אני מולקולות15,17. ראה התוצאות נציג באיור5.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    העיצוב של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון

    החל קצה אמיני של חלבון, כל פפטיד הוא 15 חומצות אמינו (15-mer). לפיכך, פפטיד הראשון מתפרשת על עמדה 1 לעמדה 15. N-הסופית של פפטיד השני חופף קצה קרבוקסילי של פפטיד הראשון החומצה אמינית 11. לפיכך, פפטיד השני מתפרשת על המיקום 5 למיקום 19. לעצב את שארית פפטידים לסוף קרבוקסילי של החלבון (איור 1). בחרנו את ספריית 15-מר כי אנחנו ואחרים הראו כי 15-מר פפטידים, בעת הוס...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    . הנה, תארנו פרוטוקול לניתוח Qa-1 epitopes של חלבון. ביחס פרוטוקול זה, מספר אסטרטגיות אחרות גם דווחו בעבר. ראשית, allogeneic CD8+ תא T קווים שיבוטים שימשו לצורך זיהוי ה1-אותה לא ישכחו במהרה. שנית, מוטיב Qa-1-איגוד בשם מניתוח המצב אותה לא ישכחו במהרה שימש לצורך הזיהוי של HSP60p216-224,9,epitope TCRBV8.118. שלישית, בודדים פפטידים חופפים של חלבון שימשו כדי לחסן את בעלי החיים. לאחר מכן, CD8+ T תאים מבודדים מן החיות immuni...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

    תודות

    אנו מודים פנלופה גרסיה על הכנת כתב היד הזה וסיוע טכני שלה. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר וחדשנות גרנט (מעטה) מ במחלקה לרפואה באוניברסיטת לומה לינדה (681205-2967), מענק פיילוט מהחברה טרשת הלאומי (PP1685) XT.

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    ניתן לקבל את החלבון שיש לנתחN/AN/Aרצף של החלבון מ-NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichCat#: D2650 SIGMADMSO צריך להיות סטרילי ולבדוק תרבית תאים.
    Kb-/-Db-/- עכברימעבדת לקסון#: 019995השתמשנו בעכברי נוקאאוט של Taconic H2-KbH2-Db doube (Cat#: 4215-F ו-4215-M) שעם זאת אינם זמינים יותר.
    AIM V ללא סרוםThermoFisher ScientificCat#: 12055091
    2-mercaptoethanolThermoFisher ScientificCat#: 21985023
    נתרן פירובטThermoFisher ScientificCat#: 11360070
    חומצות אמינו לא חיוניותThermoFisher ScientificCat#: ערכת
    Dynabeads CD8ThermoFisher ScientificCat#: 11333D
    Bio-Gel P-100Bio-RadCat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS)ThermoFisher ScientificCat#: 20012027
    Trasfer pipetteGlobe ScientificMfg#: 137238
    עכברים M-CSFPeproTechCat#: 315-02
    צלחות תרבית רקמות 48 בארותUSAScientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC מטופל צלחות בארות מרובות, 96 בארות, תחתון בצורת VSigma-AldrichCat#: Z372129 Sigma
    1 מ"ל צלחת PP עמוקה 06 בארות, סטריליתUSA ScientificItem#: 1896-1110
    עכבר רקומביננטי IL-2PeproTechCat#: 212-12
    עכבר רקומביננטי IL-7PeproTechCat#L: 217-17
    לכידת אנטי-IFN-&גמא; נוגדןBD BiosciencesCat#: 551881
    ELISPOT plateSigma-AldrichCat#: S2EM004M99
    C1RATCCCat#: ATCC CRL-1993
    C1R. Qa-1bמותאם אישית (גישה ל-GenBank#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviralvector GeneCopoeiaProduct#: Mm02955
    זיהוי אנטי-IFN-γ נוגדןBD BiosciencesCat#: 551881
    Tween20Sigma-AldrichCat#: P9416
    Streptavidin-HRPBD BiosciencesCat#: BD557630
    מצע AECBD BiosciencesCat#: 551951
    ImmunoSpot AnalyzerImmunoSpotכל מנתח ImmunoSpot צריך לעבוד למטרה זו.
    בינוני בידוד חיובי של 11140076

    מקורות

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064(2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210(2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457(2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    CD8 T Qa 1ELISPOTMHC Ib

    מאמרים קשורים