מאמר שיטה

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

DOI:

10.3791/56418

⸱

10 בנובמבר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Experimental Therapeutics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השימוש elutriation צנטריפוגלי כדי להפריד בין תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרי לשלבים שונים של מחזור התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לסנכרן את התאים כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה. טכניקות נפוצות המועסקים כוללים קיפוח סרום; כימיקלים אשר לעצור תאים בכל שלבי מחזור התא שונים; או השימוש mitotic לנער-off המנצלת שדבקו מופחת. אולם, כל אלה יש חסרונות. לדוגמה, סרום הרעבה עובד היטב עבור תאים נורמליים, אבל פחות טוב של תאים סרטניים עם מחזור התא פרוץ המחסומים בשל אובדן משתיק קול ההפעלה או גידול אונקוגן. באופן דומה, אוכלוסיות תאים טיפול כימי יכול הנמל נזק שיכרון ולהראות שינויים הקשורות במתח. טכניקה אשר עוקף בעיות אלה הוא counterflow elutriation צנטריפוגליות (להרדים), שבו תאים נחשפים שני הכוחות המנוגדים, כוח צנטריפוגלי, מהירות נוזלים, כשהתוצאה היא ההפרדה של תאים על בסיס גודל וצפיפות. מאז תאים לקדם באמצעות המחזור בדרך כלל להגדיל, להרדים יכול לשמש כדי להפריד בין תאים לשלבים שונים של מחזור התא. כאן אנו מיישמים את הטכניקה הזו לתאים העיקרי לוקמיה לימפובלסטית חריפה. בתנאים אופטימליים, אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M ניתן להשיג תשואה מעולה. אוכלוסיות תאים אלה מתאימים באופן אידיאלי עבור לימוד תלויי-מחזור התא מנגנוני הפעולה של תרופות נגד סרטן, יישומים אחרים. אנחנו גם להראות כיצד שינויים הליך סטנדרטי יכול לגרום בביצועים שיוצרת ולדון את המגבלות של הטכניקה. המתודולוגיה מפורט שהוצג צריך לאפשר יישום וחקירה של הטכניקה סוגים אחרים של תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאים בתרבית בדרך כלל לגדול באופן אסינכרוני, תאים בודדים נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. אורגניזמים מסוימים ייתקלו מחזורי תאים סינכרונית באופן טבעי או ניתן לסנכרן באמצעות ספציפית לגירויים פיזיולוגיים. לדוגמה, גרעינים בתוך plasmodia ענק התבנית רפש Physarum polycephalum לחלק אופנה מאוד סינכרונית1, וכן תאים של האצות הירוק שניתן לסנכרן Desmodesmus quadricauda , לסירוגין כהה תקופות2. בעוד אורגניזמים כגון מציעים תכונות ניסויית ייחודית, הם מודל כראוי המורכבות של תאי יונקים. היכולת לסנכרן באופן מלאכותי בתרבית של תאים אוכלוסיות כבר מרכזי לקידום ההבנה שלנו של מחזור התא רגולציה, הבסיס המולקולרי של מחזור התא מחסומ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,


הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור ראשי B-כל התאים אשר נע בקוטר של 8 מיקרומטר (שלב G1) 13 מיקרומטר (שלבים G2/M). לפיכך, מהירויות צנטריפוגה ספציפיים, משאבת זרימה המחירים לא ייתכן החלים על תאים בעלי גודל שונה טווחים. ובכל זאת, הפרמטרים elutriation המתאים יכול להיות מוערך באמצעות המשוואה קצב שקיעת. תאים מתורבתים במדיום מוגדר ללא סרום כפי שמתואר 16 ב צפיפות מיטבית של 1-3 x 10 6 תאים למ"ל. פרט לאוסף של שברים מתנהל ב 4 ° C באמצעות צינורות מקורר קרח, נערכים כל השלבים בטמפרטורת החדר, לצנטריפוגה להגדיר ב- 20 ° C עם מקסימום של 24 מעלות צלזיוס

1. הכנה של מאגר Elutriation וחומרים

  1. על מנת להפחית את הצליעה ש....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית כל התאים (3-4 x 108) היו נתון elutriation צנטריפוגלי ונאספים שני שברים שטיפת ושברים הראשי עשרים, כמפורט בפרוטוקול. טבלה 1 מציגה את הנתונים נציג איפה המספר הכולל של תאים כל שבר, כמו גם את מהירות הרוטור המתאימים מוצגים. בסך הכל התשואה היה בדרך כלל מעל 80%. מדידה של התא קוטר בחלקים בודדים אישר את קוטר תא גדל עם קידום elutriation (איור 2). תוצאות אלו מייצגים ממוצעים של שני האישושים עצמאית ומשקפים רמה גבוהה של נתונים הפארמצבטית. שברים הבא היו נתונ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תארנו שיטה להשגת ראשי כל התאים בשלבים שונים של מחזור התא באמצעות להרדים. בתנאים אופטימליים אוכלוסיה בעיקרו של דבר טהור של תאים בשלב G1 ואת אוכלוסיה מועשר של תאים בשלבים G2/M יכול בקלות להשיג תשואה מעולה, התאים מועשרים מאוד בשלב זה גם ניתן להשיג אם רצונך בכך. התוצאות המובאות כאן התקבלו באמצעות ראשי אחד שכל תרבות (ליתר דיוק, כל-5) ותוצאות במהותה זהה הושגו עם תרבות עצמאית, כל-215. בנוסף, כל שאר ראשי בכל התרבויות בדק את תאריך יש טווחים צפיפות דומה במהלך צמיחה אסינכרוני, צפויה לבצע באופן דומה כאשר נתון.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יעקב לוי Kothari נמצאת כרגע המחלקה של התא וביולוגיה מולקולרית בבית החולים סנט ג'וד לילדים מחקר.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH CA109821 (כדי TCC). אנו מודים Beckman Coulter בנדיבות תקציבים כדי לכסות את עלויות הפרסום, לקבלת סיוע טכני בארצות ותפעול של מערכת elutriation. אנו מודים ד ר פרד Falkenburg למתן הראשית הראשונית בכל התרבויות.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח מאוזנת של הנקסלונזה10-508Qבקבוק 1 ליטר
סרום בקר עוברי פלוסAtlas BiologicalsFP-0500-Aבקבוק 500 מ"ל
2-napthol-6,8-חומצה דיסולפונית מלח דיפוטסיוםAcros Organics212-672-4100 גרם אבקה
50 מ"ל צינורות קונציאלייםDenville ScientificsC1062-P500/מארז
PES ממברנה 0.22 ומיקרו; m יחידת סינוןMilliporeSLGP033RB250/חבילה
Avanti J-26S XPI עם Elut. ללא IVD - 50/60 הרץ, 200/208/240Vבקמן קולטרB14544תואמת למערכת אלוטריאציה
JE 5.0 ערכת רוטורבקמן קולטר356900ערכת רוטור הכוללת את הרוטור, מפתח משושה ידית T, מכלול השחרור המהיר (ללא תא הפליטה), כבל העיגון ותא מכלול ה-strobe
, סטנדרטי, 4 מ"ל, "A"Beckman Coulter356943תא אלוטריאציה סטנדרטי 
Masterflex L/S ראש משאבת עומס קלCole-ParmerEW-07518-10
Masterflex L/S כונן במהירות משתנהCole-ParmerEW-07528-10
Masterflex BioPharm צינורות משאבת סיליקון מרפא פלטינה, L/S 16Cole-ParmerEW-96420-16
25 G x 1.5 מחט Precision GlideBD305127סטריליות, מחטים חד פעמיות
10 מ"ל Luer-Lok מזרקBD309604מזרקים סטריליים לשימוש חד פעמי
Vi-Cell XRבקמן קולטר383556
PI/RNase מאגר צביעהBD Pharmingen550825propidium iodide/RNase מאגר צביעה
ציקלין B1 (GNS1) עכבר חד-שבטי נוגדן IgGסנטה קרוז ביוטכנולוגיהsc-245
cyclin D1 (DCS-6) נוגדן IgG חד-שבטיעכבר סנטה Cruz Biotechnologysc-20044
P-Rb (S807/811) (D20B12) XPR ארנב נוגדן חד שבטיטכנולוגיית איתות תאים8516s
GAPDH (14C10) נוגדן חד שבטי ארנבטכנולוגיית איתות תאים2118s עיזים
נגד עכבר IgG (H+L)-HRP מצומדBioRad170-6516
עיזים נגד ארנב IgG (H+L)-HRP מצומדBioRad170-6515
צנטריפוגה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beach, D., Piper, M., Shall, S. Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum. Exp cell res. 129, 211-221 (1980).
  2. Sevcikova, T., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western BlotG1G2 M

מאמרים קשורים