מאמר שיטה

פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים

DOI:

10.3791/56425

⸱

4 באוקטובר 2017

 ,  ,  , 
1Automation & Logistics Management, Screening Sciences & Novel Assay Technologies, Institut Pasteur Korea, 2School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, 3Technology Development Platform, Institut Pasteur Korea

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוירודגנרטיביות (ALS) היא מחלה קטלנית ניווניות יכול להיגרם על-ידי מוטציות בירושה ג'ין קידוד אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). את חוסר היציבות מבנית של SOD1, זיהוי תכלילים SOD1-חיוביות בחולי ALS משפחתית תומכת תפקיד סיבתי פוטנציאליים עבור SOD1 misfolded ו/או צבורים בפתולוגיה ALS. במחקר זה, אנו מתארים את התפתחות assay מבוססת תא שעיצב לכמת את הדינמיקה של צבירת SOD1 בתאים חיים תכולה גבוהה ההקרנה גישות. באמצעות וקטורים lentiviral, יצרנו שורות תאים יציב לבטא פראי-סוג של מוטציה SOD1 A4V עם חלבון פלואורסצנטי צהוב התגית ומצא כי שני חלבונים היו לידי ביטוי ציטוזול בלי שום סימן של מצבור. מעניין, רק SOD1 A4V stably לידי ביטוי HEK-293, אבל לא בשורות תאים U2OS או SH-SY5Y, יצרו אגרגטים על טיפול מעכבי פרוטאוזום. אנו מראים שאפשר לכמת צבירת מבוסס על ניתוח מנה-תגובה של מעכבי פרוטאוזום שונים, וכדי לעקוב אחר קינטיקה צבירה-היווצרות על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. הגישה שלנו מציג את האפשרות של לכימות ההשפעה של מוטציות ALS על עצמו את התפקיד של SOD1 במבנה הצבירה, כמו גם הקרנת עבור מולקולות קטנות למנוע צבירת SOD1 A4V.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבירת חלבון היא תהליך ביולוגי שבו misfolded קבוצת חלבונים את רשאית לפעול כסוכני סיבתי מחלות ניווניות (עמילואידוזיס). אפיון צבירת חלבון חיוני להבין את התפקיד של אגרגטים הסלולר בתפקוד לקוי גם הכוונה להקל על גילוי חדש גורמים המשפיעים על הופעת המחלה. הפריט החזותי של קרינה פלואורסצנטית מתויג חלבונים בתאים חיים היא שיטה חזקה אשר עשויים לסייע בפיתוח של מבחני החלים על תכולה גבוהה הקרנת3,2,1,(HCS)4.

נוירודגנרטיביות (ALS) נחשבת מחלה proteopathic הנגרמת על ידי נוכחותם של חלבונים misfolded עם נטיה לצבור ולצבור בנוירונים מנוע ALS משפחתית (fALS) והן סדיר ALS (sALS)5,6 . תת-קבוצה של ~ 20% מהמקרים fALS קשורים עם דומיננטי מוטציות בגן קידוד האנזים נוגד חמצון cytosolic אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז להקליד (SOD1) 17,8. הוצעו מספר סיבות פוטנציאליות בתפקוד נגזר גנטית זו, לרבות שינויים המבנה והתפקוד של SOD1 משתנים, כגון יציבות סוטה, קצב התגלגלות מוגבר נטיה לצבור9, 10. ראוי לציין, המאפיין היחידי מאומת, רעיל המשותפים לשני החלקים SOD1 מקושרים-ALS ופראי-סוג (WT) SOD1 היא נטיה מוגברת אגרגטים חלבון ממודר או הכללות proteinaceous11,12 . מוטציה misfolded SOD1, בהתמדה polyubiquitinated, מושפל על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כתוצאה מכך, רמה נמוכה של עיכוב פרוטאוזום הפעילות מוביל להצטברות של SOD1 אגרגטים13,14, מבנים אמורפיים איזה טופס המורכבת מרכיבים מסיסים שבו אפשר להחליף עם מוטציה מסיסים SOD1 המוטנט ציטוזול15. ב בפרט, SOD1 המוטנט A4V (אלנין-codon 4 שינתה ולין) המוטציה השכיחה ביותר הגורמים ALS, והוא מוביל הקשורים ניוון מוחיים מהירה עם מועד הישרדות ממוצע של פחות משנתיים לאחר התפרצות המחלה16. מבחינה ביוכימית, SOD1 A4V יש נטייה מוגברת monomerize, צבירה, ויוצרים נקבוביות עמילואיד; אגרגטים כמו נקבוביות שלה דומים נקבוביות עמילואיד מקושרים-מחלת מוטציה צורות אחרות, כגון חלבון α synuclein וβ-עמילואיד17. ללמוד את הדינמיקה של הצטברות SOD1 צבירה, שיטות לניטור מסיסים ובחלקם לא מסיסים SOD1 צבירה טפסים להישאר להיות מפותח.

הראינו בעבר, באמצעות הדמיה לחיות תאים, התאים HEK-293 transiently transfected עם פלורסנט SOD1 מתויג חלבון, כי מוטציות הקשורות ALS לפגום dimerization של צבירת SOD111. למרות מערכות ביטוי ארעי יכול לספק מידע שימושי על התוצאה הביולוגי של ביטוי גנים לטווח קצר, שיטות מתן יציב שילוב של גנים הרצוי עשוי להיות מועדפת לפיתוח וזמינותו. ככזה, וקטורים lentiviral מציעים את היכולת להתייעץ ביטוי גנים לטווח ארוך ומוסדרת על תאים בתרבית של 18. במחקר זה, התמקדנו הדור של שורות תאים יציב transduced עם lentivirus רקומביננטי הנושאת WT ו מתויג SOD1 המוטנט עם חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות תאים כימות אוטומטיות של צבירת SOD1, אנו מופעלות, לכמת SOD1 צבירת להתרחשויות עיכוב של פרוטאוזום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-הפקה lentivirus

הערה: הייצור ואת מניפולציה של וקטורים lentiviral בוצע על פי הנחיות הלאומית המכונים לבריאות (NIH) למחקר מעורבים רקומביננטי ה-DNA. פלסמיד קידוד פראי-סוג של מוטציה A4V SOD1 המתויגת YFP משופרת (SOD1WT-YFP ו SOD1A4V-YFP) מתוארים קים ואח. 11 שני המוצרים פיוז'ן ג'ין היו מוגבר באמצעות הזוג פריימר PCR 5 ′ - ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC - 3 ′, 5 ′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3 ′ ונוסף CMV U3 pTRIP-דלתא פלסמיד 19 בשימוש באתרים מגבלת XhoI ו- BsrGI. בניסויים קודמים, התאים HEK-293T נפרדו ביחס של 1:4 ל- 1:6 כל יומיים. הימנעות של יותר מ-20 קטעים ותחזוקה של תאים על פחות 60% confluency מסייעת להבטיח יעילות תרביות תאים טובה.

  1. -יום 1, לפצל תאים HEK-293T ב- 30-40% הנהרות בצלחת תרביות רקמה בקוטר 10 ס מ (3 x 10 6 תאים/תבשיל) ב- 10 מ"ל של תרבות תא בינוני (גלוקוז גבוהה DMEM עם 10% FBS ו- 4 מ מגלוטמין) לייצור וירוס.
  2. לשמור על התרבות רקמות 10-ס מ קוטר צלחת ב- CO 2 מיכלים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) בין לילה.
  3. -יום 2, להכין פתרון תרביות תאים DNA המכיל 10 µg של וקטורים lentiviral (pTRIP-דלתא U3 CMV - SOD1WT-YFP או - SOD1A4V-YFP) יחד עם lentiviral אריזה (פלסמידים (5 µg של pVSVg; 10 µg של pCMV-dR8.71) איור 2 א) 20. להוסיף µL 125 של 1 מ' CaCl 2 ולכוונן את העוצמה כדי 500 µL באמצעות מים מזוקקים. להוסיף 500 µL של 0.05 M HEPES לתוך התערובת בעדינות, תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. החלף HEK-293T תאים בינוני 10 מ"ל מראש ומחוממת טריים תרבות בינונית תרופתיים מעורבב עם 1 מ ל DNA תרביות תאים פתרון, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  5. ביום 3, להחליף את התא supernatant טריים תרבות בינונית.
  6. -4 יום, לקצור את תגובת שיקוע צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 500 g x כדי להסיר את תאים מתים ופסולת. בהמשך לטהר את תגובת שיקוע על ידי העברתו דרך מסנן מיקרומטר 0.45 באמצעות מזרק גדול 60 מ. מיד לוותר על תוך aliquots חד-פעמיים (300 µL), ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. כדי לשמור על פעילות מוצרי המרבי, להימנע מחזור הפשרת ההקפאה.

2. התמרה חושית lentiviral

  1. לפצל את שורת התאים להיות נגועים ב- 60% הנהרות (תאים HEK-293, SH-SY5Y; 5 x 10 5 תאים לכל טוב, U2OS; 1 x 10 5 תאים לכל טוב) בצלחת תרביות רקמה 6-ובכן ב 2 מ"ל של מדיה DMEM בתוספת 10% FBS.
  2. להשאיר את הצלחת תרביות רקמה 6-ובכן בחממה 37 ° C-5% CO 2 ללילה.
  3. להסיר את lentivirus קפוא מהמקפיא-80 ° C, להפשיר aliquot על הקרח לפני כל שימוש; לא להקפיא מחדש.
  4. בעוד הווירוס הוא מפשיר, חמים המדיום התרבות התא המכיל את הנסיוב תואם שורת התאים עניין. ברגע הווירוס מופשר הוא מלא, להכין מגוון של דילולים (1:3, 1:10, 1:30 ו- 1: 100) ב- DMEM בשפופרת טריים mL 1.5 microfuge.
  5. מעלה את עוצמת הקול של הצינורות 1 מ עם מדיה מופחת סרום.
  6. µL להוסיף 2 של Polybrene (בבית מלאי של 4 µg/µL) עד 1 מ"ל של וירוס/מדיה. מערבבים היטב בעזרת pipetting ומוסיפים 1 מ"ל של תערובת התאים. דגירה התאים בוירוס עבור ה 24
  7. מסיר את המדיה וירוס ולהחליף מדיה DMEM רגיל בתוספת 10% FBS. לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  8. לפקח על הגידול של התאים ושינוי תרבות התקשורת בכל יומיים. -זרימה, להרחיב את המנה 6-ובכן לתוך צלחת תרביות רקמה בקוטר 10 ס מ.
  9. ברגע התאים שהורחבו מספיק, תאי זרע 1.5 x 10 4 בעיר µL 50 DMEM מדיה על צלחות assay 384-טוב כדי לבדוק את רמת הביטוי YFP מתויגות חלבון באמצעות מיקרוסקופ. אם YFP מתויג חלבון תא ביטוי מראה יחס אות לרעש ≥ 3, להתכונן תא מניות הקו המקביל תא.

3. זמן ההשפעה תלויה של מעכב פרוטאזום על צבירת חלבון

הערה: לבצע ייבוא תמונות שימוש במיקרוסקופ אוטומטי (ראה חומרים).

  1. לוותר על µL 0.25 של מעכב דימתיל סולפוקסיד או פרוטאוזום מומס דימתיל סולפוקסיד 100% (ALLN, 2 מ מ) על לוחות שטוחים 384-ובכן.
  2. ידנית זרע 1.5 x 10 4 תאים לכל טוב ב- 50 µL של DMEM מדיה על אותו assay צלחת. פרוטאוזום מעכב (ALLN) הריכוז הסופי צריך להיות 10 מיקרומטר.
  3. להגדיר את יחידת הסביבתי של המערכת מיקרוסקופ CO 37 ° C ו-5% 2. צילום מסך של ההתקנה ניסיוני מוצג באיור 3.
  4. פועלים המיקרוסקופ במצב פלורסצנטיות שדה רחב באמצעות התוכנה עם ההגדרות הבאות: LWD 20 X אובייקטיבי, מצב שאינו-קונפוקלי, שדות 4/טוב, עם מרווח זמן הלכידה של שעה. בסוף כל הפעלה, תמונות שנתפסו מועלות באופן אוטומטי לשרת.

4. זמן לשגות הדמיה YFP ביטוי בתאים חיים, ניתוח (ערוץ יחיד) תמונה

הערה: השלבים הבאים מתארים יישום של התוכנה (למשל, קולומבוס).

אלגוריתם
  1. בחר המתאים לחלק האובייקטים העיקריים (ציטוזול ו אגרגטים). אם נדרש, להתאים את הפרמטרים ' סף ' ניגודיות רקע ( איור 4).
  2. ספירת תאים באמצעות ' למצוא תאים ' עם הסף בודדים של 0.1 עבור הערוץ בעוצמה YFP. לקבוע אגרגטים באמצעות ' למצוא כתמים ' אלגוריתם עם שהבוטות היחסית YFP ספוט > 0.2 ומקדם הפיצול של 1.0.

5. מנה ההשפעה התגובה של מעכבי פרוטאוזום על צבירת חלבונים בתאי חיה צבעונית בגרעין (שני ערוצים)

הערה: לבצע ייבוא תמונות שימוש במיקרוסקופ אוטומטי. לקבוע את טווח הריכוז של מעכבי פרוטאוזום (ALLN, Epoxomicin ו MG132) בהתבסס על הערך הצפוי של 50 IC כדי להבטיח התאמה אופטימלית עקומת של.

  1. הכן דילולים טורי של תרכובות על פוליפרופילן אחסון 384-ובכן צלחת על ידי התקן סדרת דילול 1:3. ודא לערבב את מתחם דילולים היטב כדי להבטיח כי ריכוז מתחם מדויק.
  2. לוותר על µL 0.25 של מעכבי פרוטאוזום על לוחות ריקים שטוח התחתונה שחור 384-ובכן וזמינותו. נוכל להשתמש במטפל נוזלי מצויד עם ראש 384-נים מסוגל להעביר את אמצעי האחסון.
  3. זרע 1.5 x 10 4 תאים לכל היטב ב-50 µL של התקשורת DMEM על צלחות וזמינותו. דגירה הלוחות assay-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עבור ה 24
  4. להוסיף 10 µL של התקשורת DMEM (להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס) עם צביעת פתרון (Hoechst 33342 בבית מלאי של 10 מ"ג/מ"ל), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות
  5. ההשקה למיקרוסקופלהתמודד הפעלת התוכנה. צילום מסך של ההתקנה ניסיוני מוצג באיור 6. בחר " תצורה " הכרטיסייה ובחר 20 X אובייקטיבית, הסוג הנכון צלחת. ודא " צווארון " מוגדר הערך הנכון על המטרה ומאפשר הריכוז עם סוגים שונים צלחת-
  6. בחר " מיקרוסקופ " בכרטיסיית הגדר חשיפה 1 כמו YFP (לייזר 488) וחשיפה 2 כמו Hoechst (לייזר 405). להפעיל את המסנן על שתי חשיפות ולהקצות חשיפה 1 מצלמה 1 ו- 2 חשיפה מצלמה 2 תשאר. הגדר פעמים חשיפה ~ 800 ms חשיפה 1 ו- ms ~ 40 חשיפה 2.
  7. בחר חשיפה 1. מוגדר גובה מיקוד 0 מיקרומטר. בחר " מיקוד ". ברגע מרוכז, חושפים את המצלמה 1. להתאים את גובה המוקד כדי למטב את המטוס חשיפה ולחץ על " לקחת את גובה ". שינוי טיימס חשיפה, לייזר הכוח לתת האינטנסיביות של פיקסלים מרבי של ~ 3000. שמור חשיפה פרמטרים. חזור על חשיפה 2.
  8. בחר " הגדרת הניסוי " בכרטיסיית ליצור פריסה sublayout. גרור ושחרר את הפריסה הרלוונטיים, חשיפה, תמונת ייחוס, קובץ skewcrop ועל sublayout. להציל את הניסוי.
  9. בחר " ניסוי אוטומטי " טאב ו לרכוש תמונות. בסוף כל הפעלה, תמונות שנתפסו מועלות באופן אוטומטי לשרת.

6. ניתוח של שתי תמונות ערוץ תמונה

  1. בחר את האלגוריתם תוכנה כדי לחלק האובייקטים העיקריים (גרעינים, ציטוזול ו אגרגטים) ( איור 7).
  2. בחר את שיטת מגזרים גרעינים במדויק על ידי בדיקה חזותית של האובייקטים מקוטע. Hoechst חפצים שהוכתמו בערוץ 1 (Ch1) ישמש כדי לקבוע את מספר התאים. ההכתמה YFP מן המוטציה SOD1-A4V בערוץ 2 (Ch2) ישמש כדי לקבוע את כמות אגרגטים.
  3. ספירת תאים באמצעות ' למצוא את הגרעינים ' אלגוריתם בתור מכתים Hoechst אזורים > 20 מיקרומטר 2, עם מקדם הפיצול של 7.0, סף בודדים של 0.40, ניגוד > 0.10.
  4. ליצור טבלת הנתונים ולקבוע EC 50 לכל אחד של תרכובות באמצעות ' רגרסיה ליניארית ' המשוואה בתוכנה graphing.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generating תא יציב קו באמצעות lentivirus: האסטרטגיה הכוללת עבור ניטור אגרגטים חלבון SOD1 מודגם באיור1. צעד ראשון, אנחנו שנוצר וקטור ביטוי lentiviral למסירה יציב הגן SOD1 לתוך שורות תאים (שלב 1). שני וקטורים lentiviral קידוד מתויג YFP SOD1 WT ו SOD1 A4V (SOD1WT-YFP ו- SOD1A4V-YFP, בהתאמה) עם אריזה, המעטפה פלסמידים הוכנו (איור 2 א). על lentiviral התמרה חושית (שלב 2) התא קווי בדוקות (HEK-293 U2OS, SH-SY5Y) נשאר בריא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן שתי גישות עיקריות ליצירת שורות תאים יציב. הראשון לוקח מספר שבועות ומחייב בחירה תרביות תאים והתנגדות ארעית של הווקטורים דנ א גנומי פלסמיד משולב. השני לוקח שעות באמצעות lentivirus, ביצוע פרוטוקול זה נוטה הביטוי יעיל של חלבון המטרה שורות תאים מרובים עם מאמץ מוגבל. הטיול-CMV וקטור19 היה וקטור מתמשכת לשימוש, עם יעילות התמרה חושית שנשמרת וביטוי transgene יציב. למרבה ההפתעה, הקווים שלושה תאים שנוצרו הראה אין צבירה גלוי של המוטציה SOD1, בניגוד פרוטוקול ניסיוני המבוסס על הביטוי ארעי תיאר קודמות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2014K1A4A7A01074642), והתוכנית הלאומית מחקר קרן של קוריאה (NRF) מדען בודדים תמיכה (ה-NRF-2013M3A9B5076486/ה-NRF-2015R1D1A1A09057239).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ALLN (C20H37N3O4)Millipore208719
MG132 (C26H41N3O5)Sigma-AldrichC2211
Epoxomicin (C 28H50N4O7)Sigma-AldrichE3652
Hoechst 33342InvitrogenH-3570
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
Opera EvoShell softwarePerkin Elmerver 1.8.1
OperettaPerkin ElmerOPRT1288
הרמוני הדמיהתוכנה Perkin ElmerVer 3.0.0
קולומבוס תוכנה לניתוח תמונהPerkin ElmerVer 2.3.2
CyBi Hummingwell טיפול בנוזליםCyBio AGOL 3387 3 0110

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).
  2. Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
  3. Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
  4. Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
  5. Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
  6. Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy? J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
  7. Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
  8. Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
  9. Vassall, K. a, et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
  10. Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
  11. Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
  12. Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
  13. Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
  14. Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
  15. Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
  16. Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
  17. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  18. de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
  19. Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
  20. Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
  21. Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
  22. Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
  23. Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
  24. Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SOD1High Content ScreeningHEK 293Time Lapse Microscopy

מאמרים קשורים