הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli

6.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/56430

⸱

3 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Physiology and Pharmacology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Department of Ophthalmology, Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 4Tel Aviv Sourasky Medical Center, affiliated to the Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול פשוט overexpression וטיהור של קודון אופטימיזציה, CIS- perrenyltransferase אדם, בתנאים שאינם denaturing, מ Escherichia Coli , מתואר, יחד עם assay פעילות אנזימטית. פרוטוקול זה ניתן להכליל לייצור של חלבונים אחרים cis- prenyltransferase בכמות ואיכות מתאים ללימודי מכניסטית.

תקציר

Prenyltransferases (PT) הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות dophosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים. DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוכי שרשרת איקריוטיים (להרכיב קשרים כפולים cis מן תגובת דחיסה) המזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations מרובים עם דיפוספט isopentenyl (IPP). DHDDS הוא בעל חשיבות ביו רפואית, כמו מוטציה לא שמרנית (K42E) בתוצאות האנזים ב רטיניטיס pigmentosa , ובסופו של דבר מוביל לעיוורון. לכן, פרוטוקול זה פותח על מנת לרכוש כמויות גדולות של DHDDS מטוהרים, מתאים ללימודי מכניסטית. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית CIS -PT בין מינים שונים מצביעה על כך שפרוטוקול זה עשוי להיות מיושם גם עבור CIS- eukaryotic אחרים, כמו אלה, כגון אלה המעורבים בסינתזה של גומי טבעי.

מבוא

Prenyltransferases הם קבוצה של אנזימים כי להאיץ שרשרת הארכה של diphosphate allylic באמצעות diphosphate isopentenyl (IPP) באמצעות תגובות עיבוי מרובים 1 , 2 . אנזימים מסוג Z לזרז את ההיווצרות של קשרים כפולים cis מן תגובת הדחיסה, בעוד אנזימי E-סוג מזרזי היווצרות קשר כפול טרנס 3. Cis- perrenyltransferases ( CIS -PT, Z- סוג אנזימים) מסווגים באופן קלאסי על פי אורך שרשרת המוצר שלהם לתוך שרשרת קצר (C 15 ), שרשרת בינונית (C 50-55 ), שרשרת ארוכה (C 70-120 ) 4 . DHDDS (synthase דיפוספט dehydrodolichyl) הוא -PT cis ארוך שרשרת איקריוטיים מזרז התארכות שרשרת של דיפוספט farnesyl (FPP, גידול דיפוספט allylic) באמצעות condensations המרובה עם דיפוספט isopentenyl (IPP) 1, 5 , 6 . התוצאה היא היווצרות של dhydosphate dehydrodolichyl, C 55-100 poliprenyl diphosphate המשמש מבשר עבור dolichylpyrophosphate, המולקולה המוביל glycosyl מעורב N- חלבון glycosylation 1 . בקרב היהודים האשכנזים, מוטציה שאינה שמרנית (K42E) ב- DHDDS גורמת לרטוסניטיס רסיסיבי pigmentosa 7 , 8 . לכן, הפרוטוקול הנוכחי פותח על מנת לרכוש מטוהרים DHDDS מתאים ללימודי מכניסטית.

Escherichia coli נחשב המארח הנוח ביותר וחסכוני עבור ביטוי חלבון רקומביננטי, ולכן הוא גם המארח הנפוץ ביותר. עם זאת, כאשר אחד מנסה heterologously overexpress חלבונים E. coli , חלבון ספציפי שיקולים צריך להיעשות. קבלת מקופל כראוי, פעילE חלבונים רקומביננטי מ E. coli , הוא לא עניין פשוט בשל תכונות שונות של חלבונים שונים. גישות רבות פותחו כדי להתגבר על משוכות אלה. כאן, השימוש של היתוך חלבון, אופטימיזציה התנאים התרבות אופטימיזציה קודון שימשו כדי לאפשר overexpression וטיהור של DHDDS האדם פעיל מבחינה תפקודית E. קולי . ראוי לציין, ניסיון קודם overexpress שמרים cis- PT ללא היתוך חלבון לא הצליח בשל חוסר מסיסות מלאה אפילו בנוכחות של חומר ניקוי 12 . הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, חסכוני, זמן חוסך ומאפשר אחד כדי לקבל DHDDS ההכנות מתאים ללימודי מכניסטית. בהינתן ההומולוגיה של CIS -PT בין המינים השונים, אנו מציעים כי פרוטוקול זה עשוי להיות מיושם עבור אחרים cis- eukaryotic גם כן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיבוט של CIS -PT עבור Overexpression ב E. coli

  1. השגת וקטור ביטוי pet-32b, המיועד שיבוט ביטוי ברמה גבוהה של רצפי חלבון התמזגו עם 109 thaoedoxin (TRX) חלבון 17 , ו E. coli קידון אופטימיזציה 18 רצף קידוד של אורך מלא CIS -PT.
  2. תשמור על עצמך כדי להיות אתר מחשוף TEV-פרוטאז (טבק לחרוט וירוס פרוטאז) (ENLYFQ / G, שבו "/" מציין את הנקודה מהחשוף) 9 ואחריו ומקשר גמיש קצר (SGSGSG, כדי לשפר את האתר מחשוף נגישות) במעלה זרם של CIS רצף -PT ( איור 1 א ). כמו כן, הוסף מתאים 5 'ו 3' אתרי הגבלה לשיבוט.
  3. לשכפל את הדנ"א מסונתז לבנות לתוך וקטור pET-32b באמצעות טכניקות קשירת תקן 10 .

2. OverexpreSsion של האדם DHDDS ב E. coli

  1. המרה E. coli T7 להביע תאים המוסמכת עם DXDS TRX- היתוך לבנות בהתאם להוראות היצרן.
  2. פלייט התאים השתנו בהתאם להוראות היצרן על LB אגר בתנאים סלקטיבי ampicillin (200 מ"ג / L).
  3. לחסן מושבות שנבחרו לתוך 100 מ"ל של מדיום LB ב 250 מ"ל צלוחיות Starter תרבויות עם 100 מ"ג / L אמפיצילין ו דגירה לילה ב 37 ° C עם רועד מתמיד בסל"ד 200.
  4. לחסן 80 מ"ל של התרבות לתוך שתי 5 צלוחיות L (40 מ"ל לכל בקבוק), כל אחד המכיל 1.5 ליטר בינוני YT 2x (16 גרם / L טריפטון, 10 גרם / l תמצית שמרים, 5 גרם / L NaCl) עם 100 מ"ג / L אמפיצילין.
  5. דגירה התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד מתמיד ב 180 סל"ד עד להגיע OD 600 ננומטר = 0.5.
  6. מנמיכים את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס וגורמים לתאים על ידי הוספת 0.5 מ"מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). ConTinue דוגרים תחת אותו מצב עבור 16-20 שעות עבור ביטוי חלבון.
  7. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (10,000 x גרם במשך 10 דקות).
    הערה: ניתן להפסיק את הפרוטוקול כאן; התאים גלולה צריך להישמר ב -80 מעלות צלזיוס עד טיהור.

3. טיהור האדם DHDDS

  1. Resuspend התאים במאגר A (25 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 מ"מ β-mercaptoethanol), 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNase אני, תערובת מעכב פרוטאז.
  2. Homogenize התאים באמצעות homogenizer זכוכית טפלון.
  3. לשבש את התאים באמצעות microfluidizer או שווה ערך ב 12,000 - 15,000 psi 11 .
  4. צנטריפוגה lysate התא ב XG 40,000 במשך 45 דקות ב 4 ° C. לשחזר את supernatant, המכיל את החלק המסיס.
  5. טען את supernatant על 5-10 מ"ל קובלט משותקת מתכת כרומטוגרפיה זיקה (Co 2 + -IMAC) 12 טור עם 10MM imidazole, ואחריו כביסה יסודית עם חיץ ו 10 מ"מ imidazole כדי להפחית מחייב חלבון לא ספציפי.
  6. Elute את חלבונים overexpressed עם חיץ בתוספת של 250 מ"מ imidazole.
  7. הסר imidazole באמצעות טור 53 מ"ל desalting prepal equilibrated עם חיץ א.
  8. הוסף 6xHis- מתויג פרוטאז TEV (1 מ"ג TEV פרוטאז לכל 50 מ"ג חלבון) כדי חלבונים eluted להסיר 6xHis שלהם מתויג TRX היתוך חלבון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. טען את החלבונים שנקטפו על עמודה Co + 2 -IMAC, equilibrated עם חיץ בתוספת 5 imidazole מ"מ, כדי להסיר את 6x מתויג שלו מתויג TRX חלבון היתוך פרוטאז TEV.
  10. לאסוף את הזרימה דרך ולהתרכז 3 - 4 מ"ל באמצעות 30 kDa משקל מולקולרי לחתוך מסנן צנטריפוגלי.
  11. טען את החלבון מרוכזים על גבי סופרדקס-200 גודל-הטור כרומטוגרפיה עמודה equilibrated עם חיץ A לטיהור הסופי. חלבון elutes כמו דימר (~ 76 kDa).
  12. בחר שברים רלוונטיים על ידי השוואת פרופיל elution לעקומת כיול עמודה.
  13. להעריך את טוהר ההכנה באמצעות SDS-PAGE.
  14. קביעת ריכוז החלבון הדרוש לניסוי במורד הזרם ואת aliquots פלאש להקפיא של חלבונים מטוהרים מרוכזים בחנקן נוזלי בחנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

4. אנליזה אנליטית של גודל כרומטוגרפיה (SEC)

  1. כדי להבטיח את היכולת של החלבון לסבול להקפיא להפשיר מחזורי, להפשיר aliquot של חלבונים קפואים צנטריפוגות ב 21,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר אגרגטים מסיסים. לאסוף את supernatant.
  2. טען את החלבונים על עמודה אנליטית superdex-200 מראש equilibrated עם 25 מ"מ טריס HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 0.02% Triton X-100, 10 מ"מ β- mercaptoethanol, באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה 13 , 14 .
  3. צג פלואורס טריפטופן(Λ ex = 280 nm, λ em = 350 ננומטר) כדי לזהות את פרופיל elution eluting חלבונים. הקפד להיות עקומת כיול תקף להערכת משקל מולקולרי - עקומות כאלה זמינים דרך היצרנים טור ה- SEC.

5. אנזים קינטיקה - פעילות תלויית זמן 15 , 16 , 17

  1. כדי להבטיח את פעילות החלבון מטוהרים, לערבב 5 מיקרומטר של DHDDS מטוהרים עם 10 מיקרומטר FPP ו 50 מיקרומטר 14 C-IPP ליזום את התגובה במאגר עם 0.5 מ"מ MgCl 2 ב 22-30 מעלות צלזיוס.
    הערה: תנאי התגובה המדויקים עשויים להשתנות עם ההכנות של CIS -PTs שונים מ DHDDS. יתר על כן, הפעילות של DHDDS גם תלוי בטמפרטורה [Mg 2 + ].
    זהירות: 14 C-IPP הוא רדיואקטיבי ויש להשתמש בו בהתאם לתקנות הבטיחות המקומיות.
  2. משיכה 15 דגימות μL מהתגובה ב 0, 2, 4 ו 6 שעות, לאחר מרווה מיידית של התגובה על ידי תוספת של 15 חיץ μL 20 מ"ל EDTA בתוספת (לריכוז סופי של 10 מ"מ EDTA).
  3. הוסף 1 מ"ל H 2 O- רווי 1-butanol ו מערבולת ביסודיות כדי לחלץ את מוצרי התגובה.
    הערה: פרוטוקול ניתן לעצור כאן את דגימות ניתן לשמור לקריאה מאוחר יותר.
  4. הוסף קוקטייל scintillation על דגימות, באמצעות מונה נצנץ, לכמת מוצרים התגובה בשלב butanol המקיף 14 C, יחד עם רדיואקטיביות של 15 μL מתערובת התגובה, המייצג את הרדיואקטיביות הכוללת.
  5. הפחת את הקריאות רקע נמדד באמצעות 0 ד דוגמאות מכל נקודת זמן לחשב את אחוז 14 C-IPP מנוצל.
  6. חישוב נטו 14 C-IPP שילוב בכל נקודת זמן על ידי חישוב אחוז מנוצל בסך הכל 14 C-IPP ריכוזים, ואת העלילה את התוצאות כפונקציה של זמן. עלייה של 14 נטו C-IPP שילוב עם הזמן צפוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סקירה כללית של מבנה המשמש כאן תהליך טיהור מוצגים באיור 1 . הדגימות המתקבלות בכל שלב טיהור מוצגות באיור 2 . זה ניתוח SDS-PAGE מראה טיהור בשלבים של DHDDS, וכתוצאה מכך מוצר מטוהרים מאוד. איור 3 מציג את התוצאות של ה- SEC האנליטי של האנזים מטוהרים, חושפים כי החלבון הוא ציין רק כ homodimer. איור 4 מציג assay פעילות זמן תלוי מייצג. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן לטיהור של DHDDS תפקודית האדם בתאי coli הוא פשוט ויעיל, המאפשר אחד overexpress ולטהר את החלבון ב 3 - 4 ימים לאחר מבנה מתאים זמין. פרוטוקולים כאלה עבור טיהור חלבון הם בעלי משמעות מיוחדת בהתחשב פריצות דרך ברצף הגנום, אשר סיפקה שפע של מידע לגבי הגנטיקה של מחלות רבות 18 , ובכך מחייב את הפיתוח של שיטות תפוקה גבוהה לאפיין מנגנונים פתוגניים ברמת החלבון 19 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי המרכז למצוינות מחקר של מכון המדעים הישראלי (I-CORE) בביולוגיה תאית מבנית (1775/12) והקרן למדע ישראל מעניקה 1721/16 ו - 2338/16 (YH) ו - 825/14 (DK ). התמיכה של הקרן נכסי פילדס DK הוא מוערך מאוד. עבודה זו בוצעה על ידי אילן אדרי ומיכל גולדנברג בהגשמה חלקית של דרישות התזה של הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר, אוניברסיטת תל-אביב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pET-32bNovagen69016-3
T7 Express  lysY  מוכשרים  E. coli  (יעילות גבוהה)NEBC3010I
cOmplete, קוקטייל מעכב פרוטאז נטול EDTA רוש11873580001
שרף TALON-superflow GEHealthcare28-9574-99
HiPrep 26/10 עמוד התפלה GE Healthcare17508701
HiLoad 16/60 superdex-200 GE Healthcare28989335
superdex-200 עולה ב-5/150 GL GE Healthcare28990945
14C-איזופנטניל פירופוספטפרקין-אלמרNEC773050UC 
טראנס, טראנס-פרנזיל פירופוספטסיגמא44270-10MG

מקורות

  1. Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
  2. Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
  3. Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
  4. Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
  5. Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
  6. Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
  7. Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
  8. Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
  9. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
  10. Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
  11. Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
  12. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
  13. Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
  14. Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457(2011).
  15. Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
  16. Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
  17. Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
  18. Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
  19. Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
  20. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  21. Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21(2014).
  22. Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DHDDSSDS PAGE
Overexpression וטיהור האדם Cis פרנליטרונפרפרז ב Escherichia coli
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.