Method Article

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

DOI:

10.3791/56474

⸱

November 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1St. Jude Proteomics Facility, St. Jude Children's Research Hospital, 2Departments of Structural Biology and Developmental Neurobiology, St. Jude Children's Research Hospital, 3Heilongjiang University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות חריגים רבים נעשו ספקטרומטריית (MS)-מבוסס פרוטאומיקס, עם התקדמות טכני מסוים כרומטוגרפיה נוזלית (LC) מצמידים טנדם ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS), קיבולת ריבוב תיוג isobaric. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול פרופיל עמוק-פרוטאומיקס, המשלבת 10-פלקס טנדם המוני תג (תורה מציון) תיוג עם נרחבת בפלטפורמות LC/LC-MS/MS, ו הפרעות חישובית MS שלאחר התיקון במדויק quantitate כל proteomes. פרוטוקול זה כולל את השלבים העיקריים הבאים: חלבון החילוץ, עיכול תורה מציון תיוג, LC (2D) 2-ממדי, ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה, עיבוד נתונים חישובית. בקרת איכות צעדים כלולים עבור פתרון בעיות והערכת וריאציה ניסיוני. יותר מ-10,000 חלבונים בדגימות יונקים יכול להיות quantitated בביטחון עם פרוטוקול זה. פרוטוקול זה ניתן גם ליישם את כימות של שינויים פוסט translational עם שינויים קלים. שיטה זו מרובבת, חסון, מספקת כלי רב עוצמה לניתוח פרוטיאומיה מבנית במגוון דוגמאות מורכבות, לרבות תרבית תאים, רקמות חיות האדם דגימות קליניות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות בטכנולוגיית הדור הבא רצפי הובילו נוף חדש ללמוד מערכות ביולוגיות, מחלות אנושיות. זה מותר מספר גדול של מדידות של הגנום, transcriptome, פרוטאום, metabolome ומערכות אחרות מולקולרית להיות מוחשית. ספקטרומטר מסה (MS) היא אחת השיטות הרגישים ביותר ב כימיה אנליטית, היישום שלה ב פרוטאומיקס התרחב במהירות לאחר רצף הגנום האנושי. בשטח פרוטאומיקס, בשנים האחרונות הניבו הגדולות ההתקדמות הטכנית של מבוססי MS כמותני, כולל isobaric תיוג ריבוב יכולת בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית נרחב, בנוסף אינסטרומנטציה למתקדמים, ומאפשר למדידות מהר יותר, מדויק יותר עם פחות חומר מדגם הנדרש. פרוטאומיקס כמותיים הפכו בגישה הרגילה עבור פרופיל של עשרות אלפי חלבונים ושינויים posttranslational דגימות ביולוגיות מורכבות מאוד1,2,3,4 , 5 , 6.

מרובבת שיטות תיוג isobaric כמו תג isobaric עבור כימות יחסיים ומוחלטים (קרי, iTRAQ) ותג המוני טנדם (תורה מציון) MS מאוד יש שיפור תפוקה של הדוגמה, הגדילה את מספר הדגימות מסוגל לנתח יחיד ניסוי1,-6,-7,-8. יחד עם שיטות אחרות מבוססות MS כימות, כגון כימות ללא תווית איזוטופ יציב תיוג עם חומצות אמינו בתרבות תא (קרי, SILAC), את הפוטנציאל של טכניקות אלה פרוטאומיקס השדה הוא ניכר9 ,10,11. לדוגמה, שיטת תורה מציון מאפשרת 10 דגימות חלבון כדי להיות מנותח יחד בניסוי 1 באמצעות ריאגנטים 10-פלקס. תגים זהים מבחינה מבנית אלה תורה מציון המסה הכוללת זהה, אך איזוטופים כבדים מופצים באופן שונה אטומי פחמן או חנקן, וכתוצאה מכך יון כתב ייחודי במהלך פיצול MS/MS של כל תג, ובעקבותיו כימות היחסי בין הדגימות 10. האסטרטגיה תורה מציון מוחל באופן שגרתי ללמוד מסלולים ביולוגיים, התקדמות המחלה, תהליכים תאיים12,13,14.

שיפורים טכניים ניכר לשיפור משמעותי כרומטוגרפיה נוזלית (LC) – MS/MS מערכות, הן מבחינת LC הפרדות ופרמטרים MS, כדי למקסם את זיהוי חלבונים מבלי להתפשר על כימות דיוק. הראשון-ממד ההפרדה של פפטידים על ידי הטכניקה ההפרדה עם אורתוגונליות גבוהה למימד השני הוא קריטי בסוג זה של רובה פרוטאומיקס שיטה להשגת תוצאות מיטביות20. גבוהה pH הפוך-פאזי כרומטוגרפיה נוזלית (RPLC) מספק ביצועים טובים יותר מאשר קונבנציונאלי חזק-קטיון כרומטוגרפיה20. כאשר גבוהה pH RPLC משולב עם מימד נוסף של RPLC pH נמוך, טווח דינמי אנליטי וגם חלבון כיסוי משופרות, והתוצאה היא היכולת לזהות את עיקר החלבונים ביטוי בעת ביצוע ניתוחים כל-פרוטאום15 ,16,17,18. ההתקדמות הטכנית אחרים כוללים חלקיקים סי18 קטנים (1.9 מיקרומטר), מורחב זמן עמודה (~ 1 ז)19. יתר על כן, שיפורים בולטים אחרים כוללים גרסאות חדשות של ספקטרומטרים המוני עם המחירים סריקה מהירה, רגישות משופרת, רזולוציה20צינורות ביואינפורמטיקה מתוחכמים עבור כריית נתונים MS21.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט אשר משלבת את מתודולוגיות האחרונה עם שינויים לשיפור הרגישות והן תפוקת, תוך התמקדות במנגנוני בקרת איכות לאורך כל הניסוי. הפרוטוקול כולל מיצוי חלבונים, עיכול, תורה מציון 10-פלקס תיוג, pH בסיסי, חומצה pH RPLC fractionation, זיהוי MS ברזולוציה גבוהה עיבוד נתונים MS (איור 1). יתר על כן, אנו מיישמים מספר צעדים בקרת איכות על פתרון בעיות והערכת וריאציה ניסיוני. פרוטוקול מפורט זה נועד לסייע חוקרים חדשים לשדה באופן שגרתי לזהות במדויק quantitate אלפי חלבונים מן lysate או רקמות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אזהרה: נא עיין גליונות נתונים בטיחות רלוונטי כל (קרי, MSDS) לפני השימוש. נא להשתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע פרוטוקול זה.

הערה: ערכה ריאגנט תורה מציון תווית isobaric 10-פלקס ב פרוטוקול זה משמש את כימות פרוטאום 10 דוגמאות של.

1. הכנה של תאים/רקמות

הערה: חשוב לאסוף דגימות בזמן מינימלי בטמפרטורה נמוכה כדי לשמור חלבונים במצבם המקורי ביולוגי.

  1. שטיפת תאים חסיד (למשל, תאים HEK 293) על צלחת 10 ס מ פעמיים עם 10 מ"ל של קרח קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). לגרד ולאסוף בתאים 1 מ"ל ל- PBS (~ 2 x 10 6 תאים). להעביר צינורות 1.5 mL ולהסיר PBS לאחר צנטריפוגה ב g x 600 דקות 5-4 ° C. חנות תא כדורי ב-80 מעלות צלזיוס עד פירוק.
    הערה: ניסוי הפיילוט מבוצע לעתים קרובות כדי לבחון את התשואה חלבון. כ- 1 מ ג של חלבונים ניתן לחילוץ תאים בתרבית של 6 10x10 או צלחת 15 ס מ עם זרימה 80%.
    2. לחלופין,
  2. lyse תאים חסיד בצלחת שלהם על-ידי הוספת פירוק מאגר ישירות לצלחת לאחר הרחצה. לאסוף lysates לתוך צינורות 1.5 mL ולהשתמש התיאור פרוטוקול בשלב 2.5.
  3. לאסוף תאי ההשעיה 15 מ"ל צינורות, לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS קר קרח, להעביר לתוך צינורות 1.5 mL, ואת צנטריפוגה ב 600 x g כדי להסיר PBS. הסר PBS השלבים שטיפת לחלוטין כדי לשמור על הריכוז הרצויה של פירוק מאגר החומרים. לאחסן תא כדורי ב-80 מעלות צלזיוס עד פירוק.
  4. לאסוף ולשקול רקמות במהירות. לשמור רקמות חנקן נוזלי מיד לאחר ניתוח וחנות ב-80 מעלות צלזיוס
    הערה: התשואה חלבון של רקמות היא כ 5% עד 10% ממשקל רקמת
  5. להשתמש גדלים רקמות הומוגנית ואזורים אנטומי על הדגימות 10 כדי להפחית מדגם הטרוגניות. להסיר זיהום הדם על ידי שטיפה דגימות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS קר קרח כדי להימנע חלבוני דם שופע מאוד להשפיע על כימות חלבון וניתוח נתונים במורד הזרם.

2. חלבון החילוץ, בקרת איכות המערבי סופג, בפתרון העיכול ו פפטיד Desalting

הערה: הטיפול בכל אחד 10 דוגמאות באותו האופן במהלך כל שלב לפני איגום של דגימות התווית על-ידי תורה מציון חיוני כדי להפחית וריאציה.

  1. לעשות פירוק מאגר (50 מ מ HEPES [pH 8.5], אוריאה 8 מ', ו 0.5% נתרן deoxycholate) היום של הניסוי-
    הערה: דנטורציה של חלבונים חלקית במהלך פירוק המדגם משפיע על יעילות עיכול חלבון.
  2. הוסף פירוק מאגר כך היחס של מאגר אחסון הדגימה היא 10:1 ל- ~ 20% נפח סופי של חרוזי זכוכית (0.5 מ מ קוטר) כדורי תאים או רקמות (למשל, כרך 10: 1 יחס בין מאגר דגימות) כדי להשיג ריכוז החלבון הסופי של 5 כדי 10 מ"ג/מ"ל. לשמור את כל הדגימות 10 ריכוז זהה על ידי בהתחשב מספר התאים המשמש או רקמות המשקל של כל דגימה.
  3. שמור על ריכוז אוריאה בגובה 8 מ' על-ידי הוספת אוריאה מוצקה המדגם. זכור לשקול את עוצמת הקול של גלולה תאים או רקמות בעת חישוב הסכום של אוריאה מוצקה כדי להוסיף הדגימה כדי להשיג את הריכוז שמונה מ'.
    הערה: אוריאה לא נקי מאגר ניתן להציג שינוי כימי מלאכותי (קרי, חלבון carbamylation), להשפיע לרעה על המספר של פפטידים מזוהה. אוריאה תופס נפח ניכר (100 מ ג של אוריאה תופסת ~ 73 µL בתמיסה).
  4. לשמור את הלכלוך לא מסיסים lysate כדי לאפשר עיכול חלבונים לא מסיסים 23.
  5. Lyse הדגימות בבלנדר ב 4 ° C במהירות 8 במשך 30 s, לנוח 5 s, וחזור 5 פעמים או ובודקים הדגימות. הדגימות גם יכול להיות lysed על ידי vortexing ב-30 s בטמפרטורת החדר (RT) עם בן 30 + s קירור תקופה על קרח ~ 10 מחזורים. להתאים את התנאים פירוק לפי הצורך, בהתאם לסוג הדגימה.
  6. לערבב היטב lysate ללא צנטריפוגה ולעשות aliquots קטן 2 (~ 15 µL כל אחד). השתמש aliquot 1 כדי למדוד ריכוז חלבון 1 aliquot לבצע בקרה חיובית אימות על-ידי ביצוע ניתוח תספיג חלבון. לשמור את aliquot גדול הנותרים לניתוח פרוטאומיקס.
  7. מידה חלבון ריכוז על ידי assay כימות של חלבון סטנדרטית או מוכתם Coomassie נתרן קצר dodecyl סולפט לזיהוי ג'ל (10%) 22 עם אלבומין שור (BSA) כסטנדרט. השתמש תקן BSA עם רמה גבוהה של דיוק הריכוז הידוע. כדי להשיג רמה גבוהה של דיוק, לבצע ניתוח חומצת אמינו של תקן BSA.
    הערה: תקנים מדויק נוספים יהיו זמינים. ריכוז חלבון יכול גם להיות מוערך לפי מספרי הטלפון הנייד או רקמות משקולות. למרות 1 מ ג של חלבון (µg 100/דוגמה) מומלץ, ניתן לבצע את הניתוח עם מעט ככל 100 µg של חלבון (µg 10/דוגמה).
  8. הוסף 100% acetonitrile (לחצן מצוקה) כדי להשיג ריכוז סופי של פרוטאז לחצן מצוקה ו- LysC 10%-יחס סובסטרט בטחונות (w/w) כדי לעכל חלבונים תחת מאוד denaturing תנאים-RT 2 h 1. להוסיף dithiothreitol (DTT) ריכוז סופי של 1 מ מ כדי להפחית דיסולפידי חוב בחלבונים תקופת דגירה של ח' 1 לבצע LysC עיכול-ריכוז סופי של שתנן 7.2 M.
  9. לדלל אוריאה 2 מ' עם 50 מ מ HEPES (pH 8.5) ודוגמאות נוספות תקציר דגימות עם טריפסין-RT עבור 3 שעות או למשך הלילה בבית טריפסין חלבון יחס של 1:50 (w/w). השתמש בערך 2 µg של טריפסין µg 100 של חלבון, ריכוז טריפסין של 10 ng/µL.
    הערה: גורמים שיכולים להוביל טריפסין לא יעיל לעיכול הם נושאים pH, טריפסין לא פעיל או השימוש של יחס לא הולם של אנזים מצע.
  10. להוסיף DTT תשואות 1 מ מ, לצמצם עוד יותר את פפטידים עבור 2 h-RT.
  11. הוסף iodoacetamide (רשות העתיקות) כדי להשיג 10 מ מ. דגירה-RT למשך 30 דקות בחושך כדי alkylate פפטידים המכילים Cys.
  12. להרוות את רשות העתיקות unreacted על-ידי הוספת DTT להשיג 30 מ מ, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
  13. לבדוק את היעילות של טריפסין לעיכול על ידי בחינת של aliquot קטן של כל דגימה. Desalt באמצעות טיפ פיפטה 10 µL עם כרומטוגרפיה המדיה המוטבע בשטח מת, על פי היצרן ' פרוטוקול s. לנתח כל דגימה על-ידי LC-MS/גב' LC-MS/MS. הם פרמטרים כמו שלב 5, למעט כי מעבר הצבע הוא 10 דקות 23.
  14. לבצע חיפוש מסד נתונים MS נתונים גולמיים (ראה פרטים נוספים בשלב 6) באמצעות 4 אדמירל החמיץ כפרמטר חיפוש.
    הערה: אם המספר מפספסת אדמירל הוא > 10%, זה עשוי להצביע על עיכול טריפסין לא שלם. זה תהיה השפעה שלילית על תוצאות במורד הזרם. זהו צעד קריטי בקרת איכות (QC).
  15. לעכל דגימות שוב אם המחשוף שלא נענתה > 10% על-ידי הוספת של µL 10 נוספים של טריפסין הדגימות.
  16. Acidify את הדוגמאות על-ידי הוספת חומצה trifluoroacetic (TFA) כדי להיכנס לריכוז 1%. למדוד את ה-pH באמצעות רצועה pH. ודא כי ה-pH הוא להמרween 2 ו- 3. להוסיף עוד TFA טיפה חכם (1 µL) לפי הצורך עד ה-pH נכונה מושגת.
  17. צנטריפוגה ב g x 20,000-RT במשך 10 דקות ולאסוף תגובת שיקוע.
  18. לרחוץ 0.5 עד 60 µg קיבולת ספין עמודות המכילות סי18 שרף הפוכה-פאזי עם 0.25 mL של מתנול, אם באמצעות דגימות µg 100. לשטוף 0.03 עד 30 µg קיבולת ספין עמודות עם 0.25 mL של 60% ACN/0.1% TFA אם באמצעות דגימות µg 10. צנטריפוגה ספין עמודות ב- g x 500 עבור 30 ס
  19. Equilibrate עמודות עם 0.5 מ"ל של 0.1% TFA ולהסיר מאת צריך שתוציאו ב 500 x g ב-30 ס
  20. דוגמיות בעמודות, לאגד דגימות עמודות על-ידי צנטריפוגה ב g x 100 למשך 3 דקות או עד כל המדגם עבר דרך העמודה.
  21. להוסיף 0.5 מ של 0.1% TFA עמודות, צנטריפוגה ב 500 x g ל 30 ס
  22. µL 125 להוסיף 60% ACN/0.1% TFA כדי כל עמודה, elute על ידי צריך שתוציאו ב 100 x g עבור 3 מינימלית ודא כל הפתרון עבר דרך העמודה.
  23. יבש את eluents ב concentrator ואקום. ודא הדגימות נשאר יבש לחלוטין, לא נוזלי בתוך הצינורות. חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.

3. תורה מציון תיוג של פפטידים

הערה: חיוני כדי להבטיח כי כל דוגמאות מסומנות באופן מלא על ידי ריאגנטים תורה מציון. מספר גורמים (למשל, כמות של תורה מציון ריאגנטים בשימוש, ערך ה-pH, והדיוק של חלבון כימות) יכול להשפיע על תורה מציון תיוג היעילות, תשנה לרעה כל התוצאות במורד הזרם.

  1. לשקם כל פפטיד desalted מדגם µL 50 50 מ מ HEPES מאגר (pH 8.5). בדוק את ה-pH ולהבטיח כי זה בין 7 ו- 8-
    הערה: מדגם עשוי להיות חומצי אם לא התייבש לחלוטין לאחר השלב desalting, אשר ישפיעו על היעילות תיוג.
  2. תמשיך ~ 1 µg של כל דגימה ללא תווית עבור הבאים תורה מציון תיוג יעילות מבחן, כפי שמתואר בשלב 3.3.
  3. לפזר תורה מציון ריאגנטים, לחצן מצוקה נטול מים עם מדבקה פפטיד דוגמאות לפי היצרן ' s הוראות. דגירה ריאגנטים ב RT עבור ה 1
  4. לבצע בדיקה יעילות תיוג QC בכולל מאת desalting µg ~ 1 של כל מדגם התווית על-ידי תורה מציון וללא תווית באמצעות טיפים פיפטה של 10 µL עם המדיה המוטבע כרומטוגרפיה על פי היצרן ' פרוטוקול s. לנתח דגימות התווית על-ידי תורה מציון, ללא תווית על ידי LC-MS/גב'
    הערה: LC-MS/MS הפרמטרים הם כמו סעיף 5, למעט כי מעבר הצבע הוא 10 דקות
  5. לבחון את הנתונים הגולמיים על מנת להבטיח כי פפטידים ללא תווית לא מזוהים הדגימות שכותרתו, המבטיח יעילות labelling מלאה ( איור 2). לעשות את זה במשך 6 עד 10 פפטידים נפרד לוודא את יעילות תיוג.
  6. להרוות את התגובה על-ידי הוספת 4 µL של 5% hydroxylamine ו תקופת דגירה של 15 דקות
  7. לערבב עם aliquot אחסון קטנים ושווים (2 µL) של כל מדגם התווית על-ידי תורה מציון. Desalt באמצעות טיפים פיפטה של 10 µL עם המדיה המוטבע כרומטוגרפיה. לנתח את הדגימות מאת LC-MS/MS, כפי שמתואר בשלב 3.4. להשתמש לקפוץ התוכנה (מסד נתונים פתוח החיפוש אלגוריתם אשר ממירה קבצי raw של MS טנדם לרשימה של פפטידים וחלבונים) כדי לקבוע את היחס הריכוז היחסי של כל הדגימות 10 על ידי עוצמות תג תורה מציון מכל מזוהה פפטידים-
    הערה: QC premix יחס המבחן הוא מועיל לקבוע את היחס הנכון לערבוב שווה לפני איגום הסופית, כפי pipetting שגיאות יכולות להתרחש זה ישתנה ריכוזים השלב כימות חלבון אינו מדוייק תמיד. זו גם הדרך הטובה ביותר כדי להבטיח כי הסכום של כל הדגימות 10 המשמש את המיקס הסופי-יחס שווה, כפי שמתואר בשלב 3.5.
  8. חוזר פעמים רבות ככל הדרוש כדי להשיג יחס של 1:1 בכל הדוגמאות 10.
  9. לערבב באותה מידה הדגימות 10 על פי ממצאי הבדיקה יחס premix. להשתמש את הדגימה עם הריכוז הנמוך ביותר כקו הבסיס כדי להתאים את נפחי דגימות 9 אחרים.
  10. להסיר את תוצרי לוואי של התגובה quenching המדגם התווית על-ידי תורה מציון במאגר על-ידי desalting.
    11. תרמילי מיצוי
  11. שטיפת 1 מ"ל מוצק-שלב המכיל 50 מ"ג sorbent בכל עמודה עם 1 מ"ל/0.25 mL של מתנול, אם באמצעות דגימות µg 100. לשטוף 0.5 - ל 60-µg קיבולת סי18 ספין עמודות עם 1 מ"ל/0.25 mL של 60% ACN/0.1% TFA אם באמצעות דגימות µg 10. צנטריפוגה עמודות ב- g x 500 עבור 30 ס
  12. Equilibrate עמודות עם 0.5 מ"ל של 0.1% TFA ולהסיר מאת צריך שתוציאו ב 500 x g ב-30 ס
  13. דוגמיות בעמודות ונאגד באמצעות צנטריפוגה ב g 100 x למשך 3 דקות או עד כל המדגם עבר דרך העמודה.
  14. להוסיף 0.5 מ של 0.1% TFA עמודות, צנטריפוגה ב 500 x g ל 30 ס
  15. µL 125 להוסיף 60% ACN/0.1% TFA כדי כל עמודה, elute על ידי צריך שתוציאו ב g x 100 עבור 3 מינימלית ודא כל הפתרון עבר דרך העמודה.
  16. יבש את eluents ב concentrator ואקום. ודא הדגימות נשאר יבש לחלוטין, לא נוזלי בתוך הצינורות. חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.

4. PH ברזולוציה גבוהה, בסיסי מקיף LC Prefractionation

  1. סט למעלה 2 עמודות סי18 מחוברים המכיל חלקיקים היברידיים אתילן גישור (4.6 מ מ x 25 ס מ, בהיקף של 50 ס מ; 3.5 גודל החלקיקים מיקרומטר) ולהשתמש משאבה LC ביצועים גבוהים של זרימה microliter עבור fractionation.
    הערה: השימוש 2 עמודות מגביר את העומס פפטיד ולשפר לא בהכרח כרומטוגרפיה. לקבלת דוגמאות המכיל ≤ µg 200 של פפטידים, עמודה 1 מספיקה.
  2. לשטוף את הלולאה 100-µL עם תוספות עוקבות של 300 µL כל מתנול, מים, ואת מאגר A (formate אמוניום 10 מ מ, pH 8.0).
  3. לשטוף את העמודות עם 100 µL של אלכוהול איזופרופיל באותה המידה מעורב, מתנול, לחצן מצוקה, ומים, equilibrate את העמודה במאגר 95% עבור 2 ח'
  4. Solubilize הדגימה desalted במאגר פפטיד התווית על-ידי תורה מציון ב 65 µL מאגר א ודא כי ה-pH הדגימה היא ~ 8.0. אם עדיין חומצי, השתמש אמוניה מימית כדי להתאים את ה-pH ל 8.0.
  5. Fractionate מדגם באמצעות מעבר הצבע הבאים עם מאגר B (מאגר של % 90 פלוס לחצן מצוקה): 15% עד 20% למשך 15 דקות 20% עד 35% עבור 100 דקות, 35% כדי 50% במשך 30 דקות להגדיר אספן החלקיקים כדי לאסוף את השברים כל 2 דקות כולל זמן טעינה. הגדר את קצב הזרימה 0.4 mL/min. ראה התייחסות 29 ו איור 1 נציג chromatogram.
  6. לאסוף סכום כולל של 80 שברים ויבשה 40 שברים (כל שאר שבר) עם רכז ואקום אל יובש מוחלט.
  7. השתמש הדגימות מיובשים 40 לניתוח LC-MS/MS-
  8. לנתח כל 80 שברים על ידי LC-MS/MS כדי להשיג כיסוי פרוטאום עמוקה במיוחד.

5. LC-MS/MS הכנה ופרמטרים

הערה: מבוסס ב תורה מציון כימות, פפטיד יונים isobaric, מופיעים מסה 1 בעוד בסריקה MS1. עם זאת, הם הם quantitated עם כמות יונים כתב (יונים כתב ייחודי 10) במהלך הסריקה MS/MS אחרי יונים פפטיד יש כבר מפוצל עם אנרגיה גבוהה יותר התנגשות דיסוציאציה (HCD). היחס של יון כתב תורה מציון עשוי להיחסם של שיתוף • תנאי של יונים התווית על-ידי תורה מציון 24. היצרות יון בידוד חלון 25, טיהור גז-פאזי 26, MultiNotch MS3 שיטת 27 או fractionation נרחב עם רב-ממדי LC ומעברי זמן (4-8 שעות) 28 הן גישות אלטרנטיביות.

  1. Pack 75 מיקרומטר הקוטר הפנימי (ID) לרוקן עמודות עם 1.9 מיקרומטר של שרף סי18 עד 30 עד 40 ס"מ אורך (~1.3 µL מיטה נפח).
  2. לחמם את העמודות ב 65 ° C עם תנור תיק פרפר להפחית backpressure ולמנוע מעל לוחץ אולטרא-גבוה-לחץ מערכת כרומטוגרפיה נוזלית (UPLC). סליל העמודה 2 כדי 3 פעמים בתוך התנור פרפר כדי להבטיח כי אורך המיטה כל הטור מחומם. קלטת את העמודה הפנימי של התנור נזהר שלא קלטת על החיישן החום בתוך התנור.
    הערה: החימום תיק פרפר הוא רכוב והדביקו על חתיכת פלקסיגלס צמוד לבמה XYZ של המכשיר בהזמנה אישית.
  3. הכנת מאגר של (3% דימתיל סולפוקסיד ו- 0.2% חומצה פורמית) ואת החיץ B (מאגר של 67% פלוס לחצן מצוקה) ולשטוף את העמודות ביסודיות עם 95% מאגר B. ואז, באופן מלא equilibrate עמודות ב- 95% מאגר A (עמודה לפחות 3 כרכים). קצב זרימה של ~0.25 µL/min ולהשתמש backpressure של 280 עד 320 אנחנו חיים
  4. לבחון את איכות מערכת LC-MS/MS על-ידי הפעלת 100 ננוגרם של עכברוש המוח פפטידים (או תקן של הבחירה שלנו) פעמיים לפני ניתוח הדגימות התווית על-ידי תורה מציון. בדוק את הפרמטרים הבאים בתדירות גבוהה כדי להבטיח איסוף נתונים באיכות גבוהה: סקר MS עוצמת האות (בין e8 e9 עבור עוצמת שיא הבסיס), איכות של MS/MS ספקטרה (ייצוג טוב של יונים y ו- b), שיא רוחב (12-22 s), משך הזמן הכולל, לחץ המערכת LC (עליית הלחץ > ברים 50 מציין עמודה מלוכלך או עצה פולט סתומות), ולשינויים לרוץ--לרוץ (פסגות זהה צריך להיות < 30 s בין פועל).
    הערה: כדי לפתור היונים כתב יד-isobaric של ריאגנטים תורה מציון 10-פלקס (ההבדל מד א 6.32), הרזולוציה MS/MS חייב להיות מוגדר לפחות 30,000 על 400 מ'/z. HCD משמשת בדרך כלל עבור TMT10-פלקס כתב יון פיצול, כאשר הוא אינו כפוף הכלל שליש זה חל על התנגשות המושרה דיסוציאציה (CID) בתוך מלכודת יונים מכשירים.
  5. נקיים, לכייל את המכשיר MS באופן קבוע ולהשתמש מאגרי LC טריים כדי לשפר את ביצועי המערכת.
  6. לשקם את פפטידים מיובשים מן ההפרדה pH בסיסי ב- 5% TFA.
  7. לטעון ~0.2 µg על העמודה תוך 5% זורמים מאגר א
  8. Elute עם 15% עד 45% של מאגר B ב- 150 דקות. כנקודת התחלה, השתמש במעבר הצבע הבאים: בזמן 0, מאגר B 5%; זמן 2, מאגר B 15%; הגיע הזמן 135, מאגר B 45%, זמן 145, מאגר B 70%; וזמן 150, מאגר B 95%. להתאים את ההדרגה מעט לשברים RPLC pH בסיסי מוקדם ומאוחר לאחר סקירת הבסיס שיא chromatograms.
  9. מפעילים את ספקטרומטר מסה במצב תלויי-נתונים באמצעות סריקה סקר במנתח המוני מלכודת יונים (400-1600 מ/z; 60,000 רזולוציה; 1 x 10 6 הגברה אוטומטית שליטה (קובי) היעד; 50 מילישניות יון מרבית זמן; ומצב centroid). לבצע סריקות ברזולוציה גבוהה 20 MS/MS (רזולוציה 60,000, עונה 1 פרק 10 5 AGC היעד, ms ~ 100 יון מרבית הזמן, אנרגיית התנגשות HCD מנורמל 35, 0.4 מ/z בידוד חלון, להדרה 20 s דינאמיים).
    הערה: דיסוציאציה העברת אלקטרונים (משוערת) אינה מומלצת TMT10-פלקס ריאגנטים מכיוון משוערת. המחשוף אתרים שונים מ HCD, וכתוצאה מכך כתב יון חפיפה. בנוסף, משוערת. הוא לא יעיל כמו HCD פפטידים tryptic בדרך כלל לייצר מצבים טעונים +2, משוערת. יעיל יותר בהברית תשלום גבוה יותר.

6. ניתוח נתונים MS

הערה: נתאר ניתוח נתונים עם התוכנה לקפוץ. עם זאת, ניתן לבצע ניתוח נתונים עם תוכניות אחרות זמינים מסחרית או בחינם.

  1. תהליך קבצי raw ספקטרומטר מסה עם היברידית המבוססת על תגים חפש מנוע הקפיצה 21, אשר משלב חיפוש מסד נתונים מבוסס תבנית ורצף המבוססת על תגים דה נובו לשפר רגישות.
  2. המרת נתונים גולמיים mzXML לעצב ולחפש MS2 ספקטרה נגד המאגר האנושי של UniProt היעד-דמה (או מסד נתונים תלויי מין מתאים אחר) כדי לחשב את שיעור הגילוי שווא (פד).
  3. לבצע חיפושים באמצעות סובלנות המונים 10 עמודים לדקה עבור יונים קודמן וגם שבר. הגדר את פרמטרי החיפוש אחר הגבלת tryptic באופן מלא עם אדמירל החמיץ מקסימום 2, 3 אתרי השינוי המרבי לכל פפטיד ההקצאה של , b ו- y יונים להבקיע את פפטידים. להגדיר שינויים סטטי תורה מציון תגים על שאריות Lys ו N טרמיני (+229.162 Da) ו- carbamidomethylation של Cys משקעים (+57.021 Da). להגדיר שינויים דינמיים כדי לכלול Met חמצון (+15.994 Da), אשר הוא חפץ פפטיד נפוצות הנובע לדוגמה הטיפול.
    4. קריטריונים
  4. לסנן נתונים על-ידי הבאות: 7 אורך מינימלי פפטיד חומצת אמינו, דיוק מ/z (למשל, 5 ppm), התאמת ציונים (הציון J ו- deltaCn). לקבץ פפטידים לפי אורך פפטיד, trypticity, וכן לחייב את המדינה-
  5. השתמש רמה נוספת של סינון על ידי התאמת תוצאות חלבון רוזוולט כדי מתחת 1%. חלבונים המזוהה על-ידי ספירת ספקטרלי בודדת דורשים ציון התאמה גבוה.
  6. עבור פפטידים משותף על ידי מספר חברי משפחה חלבון, אשכול חברי חלבונים מתאימים לתוך קבוצה 1-
    הערה: על פי העיקרון בהססנות, הקבוצה מיוצג על ידי החלבון עם המספר הגבוה ביותר של פפטידים שהוקצו וחלבונים אחרים מתאימים לפי פפטידים ייחודי 1.
  7. Quantitate חלבונים על-ידי סיכום ספירות יון כתב על פני פפטיד תואמים כל ספקטרום גפרורים (PSMs) באמצעות תוכנית מובנה בתוך חבילת התוכנות לקפוץ.
  8. עבור כל אחד קיבל PSM, לחלץ ולתקן את עוצמות יון כתב תורה מציון לפי התפלגות איזוטרופי של ריאגנטים תיוג ו הטיה הטעינה, אשר מחושב לפי הנתונים העולמי של כימות PSM. סינון PSMs עם בעצימות נמוכה ורמת רעש גבוהה עם ספי על-ידי המשתמש במהלך כימות.
  9. לחשב אות היחסי בין כל יון כתב את הממוצע של כל כתב 10 יונים. לסכם את האותות היחסי של PSMs של החלבונים שזוהה. להמיר אותות יחסית אלה אותות מוחלט על-ידי הכפלת את עוצמת יון בממוצע כתב PSMs top 3 בחלבונים המתאים.
  10. להשתמש בגישה חישובית MS שלאחר לתיקון הפרעות. בהנחה כי עוצמת איאון y 1 הוא יחסי העוצמה יון כתב, לחשב את הקשר הליניארי מהסריקות נקי, שואבים את רמת התערבות עוצמת y1ion מזוהמים סריקות רועש 23.
    הערה: עבור התווית על-ידי תורה מציון פפטידים tryptic, שאריות K-תורה מציון ו- R הם 2 סוגים של y 1 יונים (376.27574 Da ו- 175.11895 דא, בהתאמה) MS2 סריקות. אם רק 1 y 1 יון מזוהה, והוא תואם פפטיד מזוהה, MS2 נחשבת הסריקה נקייה ( איור 3 א). אם y1ions הן מזוהות, MS2 נחשבת סריקה רועש.
  11. לייצא את הערכים כימות חלבון תוכנית גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נוסף. השתמש pairwise להשוואות או של השונות כדי לזהות חלבונים אשר באה לידי ביטוי באופן שונה.

7. אימות נתונים MS

הערה: כדי להעריך את איכות הנתונים MS, לפחות 1 שיטת אימות צריכה להתבצע לפני שתמשיך עם ניסויים ביולוגיים גוזלת זמן.

  1. באופן ידני לבחון את ספקטרום MS/MS של חלבונים עניין כדי לאמת את תורה מציון כתב יון כימות והערכה פפטיד רצף.
  2. שימוש ידוע חלבון כימות הנתונים כדי לאשר את התוצאות MS-
  3. אימות שינויים חלבון עם נוגדן מבוססי גישות (למשל, westeכתם rn וניתוח אימונוהיסטוכימיה).
  4. כימית לסנתז את פפטידים עניין ולהשתמש בהם סטנדרטים פנימיים כמו כדי לאשר את הזיהוי של פפטידים מקורי.
    הערה: MS/MS דפוסי ושעת השמירה שלהם במהלך LC-MS/MS צריכים להיות זהים.
  5. לאמת חלבון שינויים בגישה רב-MS יישוב.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו שילוב פפטיד קרוס-מינים שתואר לעיל לנתח באופן שיטתי את השפעת יחס דחיסה ב- 3 צעדים פרוטוקול העיקריים, כולל pre-MS fractionation, MS הגדרות תיקון post-MS23. pre-MS Fractionation היה להעריך, ממוטב באמצעות שילוב של pH בסיסי RPLC בעלת pH חומצי RPLC. לניתוח post-MS, נחשבו רק תלויי מין פפטידים. השתמשנו מודל התערבות זה לבחון מספר פרמטרים ב- LC/LC-MS/MS, לרבות MS2 בידוד חלון, רזולוציה LC באינטרנט, כמות הטעינה של pH חומצי מקוון RPLC, ברזולוציה של RPLC גבוהה pH מנותק (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור כימות של חלבונים עם 10-פלקס isobaric תיוג אסטרטגיה, אשר יושמה בהצלחה מספר פרסומים12,13,14,32 . ב פרוטוקול זה, אנחנו ניתן לנתח דגימות חלבון ביולוגיים שונים עד 10 בניסוי 1. אנחנו באופן שגרתי ניתן לזהות, quantitate מעל 10,000 חלבונים עם ביטחון עצמי גבוה. למרות תיוג isobaric היא טכנולוגיה יעילה כדי quantitate חלבונים, זה מוגבל על ידי דחיסה יחס זה יכול להוביל דיו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים תודה לכל החברים מעבדה ומתקני אחרים על דיון מועיל. עבודה זו מומן בחלקו על ידי ני H מעניקה R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 ו- ALSAC. הניתוח MS בוצעה ב חולים פרוטאומיקס למחקר הילדים סנט ג'וד, חלקית נתמך על ידי מענק NIH סרטן מרכז תמיכה P30CA021765. המחברים מודים Badders נישה על לעזור עם עריכת כתב היד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מערכת 1220 LCAgilentG4288B
50% הידרוקסילאמיןתרמו סיינטיפיק90115
אצטוניטרילבורדיק & JacksonAH015-4
בלנדר כדוריםNext AdvanceBB24-AU
מחמם תיק פרפריםPhoenix S& TPST-BPH-20
C18 טיפיםהרווארד מכשיר74-4607
Dithiothreitol (DTT)SigmaD5545
DMSOSigma41648
חומצה פורמיתסיגמא94318
אספן שבריםגילסוןFC203B
חרוזי זכוכיתNext AdvanceGB05
HEPESSigmaH3375
יודואצטמיד (IAA)SigmaI6125
Lys-CWako125-05061
מתנולבורדיק & JacksonAH230-4
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבוןThermo Scientific23225
ספקטרומטר מסהThermo ScientificQ Exactive HF
nanoflow UPLCThermo ScientificUltimate 3000
ReproSil-Pur C18 שרף, 1.9umDr. Maisch GmbHr119.aq.0003
עמודות Pckעצמיות מטרה חדשהPF360-75-15-N-5
נתרן דאוקסיכולאטסיגמא30970
SpeedvaThermo ScientificSPD11V
TMT 10plex מגיב תווית איזובריThermo Scientific90110
חומצה טריפלואורואצטית (TFA)Applied Biosystems400003
טריפסיןפרומגהV511C
אוריאהSigmaU5378
Xbridge Column C18עמודה Waters186003943
Ziptips C18MilliporeZTC18S096
SepPak 1cc 50mgWatersWAT054960

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pagala, V. R., et al. Quantitative protein analysis by mass spectrometry. Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).
  2. Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics. Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).
  3. Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).
  4. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  6. Bai, B., et al. Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling. Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).
  7. McAlister, G. C., et al. Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses. Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  8. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run. Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  9. Bai, B., et al. Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease. J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).
  10. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  11. Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. Recent advances of proteomics applied to human diseases. J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).
  12. Churchman, M. L., et al. Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia. Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).
  13. Wang, X., et al. Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk. Nat Commun. 7, 10464(2016).
  14. Mertz, J. L., et al. Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth. Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).
  15. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  16. Wang, H., et al. An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).
  17. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  18. Song, C., et al. Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides. Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).
  19. Wang, H., et al. Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome. J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).
  20. Hebert, A. S., et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).
  21. Wang, X., et al. JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).
  22. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  23. Niu, M., et al. Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry. Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).
  24. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).
  25. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  26. Wenger, C. D., et al. Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging. Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).
  27. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes. Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).
  28. Zhou, F., et al. Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry. Nat Commun. 4, 2171(2013).
  29. Savitski, M. M., et al. Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers. Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).
  30. Ahrne, E., et al. Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments. J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).
  31. Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics. J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).
  32. Tan, H., et al. Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation. Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).
  33. Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells. Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).
  34. Tan, H., et al. Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome. Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).
  35. Li, Y., et al. JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells. J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).
  36. Yuan, Y., et al. Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types. Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).
  37. Nesvizhskii, A. I. Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies. Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).
  38. Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Proteome ProfilingIsobaric LabelingLiquid ChromatographyMass SpectrometryTMT Labeling2D LCHigh Resolution Mass SpectrometryComputational Data ProcessingProtein QuantitationPost Translational Modifications

Related Articles