מאמר שיטה

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

DOI:

10.3791/56497

⸱

24 בנובמבר 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת תפקידה של תהליכים חיוניים של חיידקים הוא מאתגר. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ עם צבעי במטרה יכול לספק תובנות מפתח לתוך התא מיקרוביאלי התקדמות וצמיחה של מחזור התא. כאן, Agrobacterium tumefaciens משמש חיידק דגם כדי לסמן שיטות הדמיה תא חי פלואורסנציה לאפיון תהליכים חיוניים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליכים תאיים ליבה כגון שכפול ה-DNA וסגרגציה, סינתזה של חלבון, ביוסינטזה דופן התא, חלוקת התא להסתמך על תפקידו של חלבונים, המהווה מרכיב חיוני להישרדות החיידק. ניתן להשתמש סדרת צבעי במטרה כפי הגששים טוב יותר להבין תהליכים אלה. צביעת עם צבעי lipophilic מאפשר התבוננות מבנה הממברנה, ויזואליזציה של השומנים microdomains, גילוי של קרום מגדלים פורחים. השימוש של חומצות אמינו פלורסנט-d (FDAAs) כדי לחקור את האתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה ניתן לציין פגמים פוטנציאליים להן קיר התא או המתבנת צמיחת תאים. לבסוף, חומצת גרעין כתמי ניתן לציין ליקויים אפשריים-סגרגציה שכפול או כרומוזום ה-DNA. Cyanine DNA כתמי תווית לחיות תאים ומתאימים ל זמן לשגות מיקרוסקופ שמאפשר מתצפיות נוקלאואיד מורפולוגיה של במהלך גדילת התאים. ניתן להחיל פרוטוקולים עבור תיוג התא חלבון המוטנטים דלדול לזהות פגמים מבנה הממברנה, דופן התא להן או כרומוזום סגרגציה. יתר על כן, זמן לשגות מיקרוסקופ ניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים כמו חלבון חיוני יוסר ולא יכולה לספק תובנות פונקציה של חלבונים נוספים. לדוגמה, דלדול של חלבונים חיוניים חלוקת התא תוצאות filamentation או הסתעפות, ואילו דלדול של התא צמיחה חלבונים עלול לגרום לתאים להפוך קצר יותר או עגולות. כאן, פרוטוקולים צמיחת תאים, במטרה תיוג של מיקרוסקופיית זמן לשגות ניתנים עבור המחלה חיידקי צמח Agrobacterium tumefaciens. יחד, במטרה צבעי ומיקרוסקופיה זמן לשגות מאפשרים אפיון תהליכים חיוניים ב א tumefaciens. לבסוף, הפרוטוקולים הניתנים ניתן לשנות בקלות כדי לחקור חיוני בתהליכי חיידקים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התקדמות דרך מחזור התא חיידקית מחייבת התיאום של תהליכים רבים כולל ביוסינטזה ממברנה, דופן התא, שכפול ה-DNA, סגרגציה של חלוקת התא. כדי להבין באופן מלא את המורכבות של ביולוגיה של התא חיידקי, זה הכרחי לחקור אירועים אלה חיוניים; עם זאת, זוהי משימה לא טריוויאלי שכן הכדאיות תא בסכנה כאשר רכיבי מפתח של המסלולים הללו הם mutagenized. מיקרוסקופ Epifluorescence יחד עם צבעי במטרה היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור תהליכים חיוניים אלה wildtype, זני חיידקים מוטנטים.

צבע ספציפי פפטידוגליקן לכלול אנטיביוטיקה פלורסנט (ואנקומיצין-FL, bocillin-FL) וחומצות אמינו פלורסנט-d (לדוגמה: 7-hydroxycoumarin-3-קרבוקסילית חומצה-3-אמינו-d-אלנין, HADA; d 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino--אלנין , נדא; tetramethylrhodamine-3-אמינו-d-אלנין; ג'אר). חיידקים גראם חיוביים, השימוש של ריכוזים לא קטלני של פלורסנט תחליפי אנטיביוטיקה כדי לחקור אתרים של פפטידוגליקן ביוסינטזה כבר אסטרטגיית יעיל כדי לחשוף פפטידוגליקן ההכנסה דפוסי1,2, 3,4. בעוד תיוג פלורסנט ואנקומיצין שימש כדי לקבל תובנות פפטידוגליקן ההכנסה דפוסים קבועים חיידקים גראם שליליים5, הממברנה החיצונית בדרך כלל מספק מחסום חדירות שמונעת שימוש פלורסנט אנטיביוטיקה כמו בדיקה של הביוסינתזה פפטידוגליקן בתאים חיים. לעומת זאת, בפולסים של חומצות אמינו פלורסנט-d או חומצות אמינו d עם קבוצות פונקציונליות biorthogonal תווית covalently מחוזות ההכנסה פפטידוגליקן האחרונות במגוון רחב של חיים תאים חיידקיים6,7. דפוסי פפטידוגליקן ההכנסה שנצפו עם חומצות אמינו d סינתטי כוללים punctate במחיצה הבין-פרוזדורית (Escherichia coli ו- Bacillus subtilis), קוטב ו במחיצה הבין-פרוזדורית (Agrobacterium tumefaciens , ליסטריה), במחיצה הבין-פרוזדורית היחידה (Staphylococcus aureus), הפסגה (Streptomyces venezuelae)6,7. מקרים אלה מצביעים על חיידקים מפגינים דפוסי מגוונות של דופן התא להן כי השימוש של חומצות אמינו d סינתטיים כמו הגששים לבחינת המתבנת הצמיחה היא אסטרטגיה יקר בחיידקים רבים.

צובעים את תווית כרומוזומים חיידקי כוללים חומצה deoxyribonucleic (DNA) ספציפיים groove קטין הקלסר (4, 6-diamidino-2-phenylindole; דאפי) צובעת cyanine זיקה גבוהה (ירוק וכתום; ראה רשימת חומרים). דאפי צביעת תאים קבוע מסייע ספירה של חיידקים מן הסביבה דגימות8, ואילו דאפי מכתים של תאים חיים משמש לציון הכדאיות חיידקי9. לעומת זאת, cyanine צבענים כמו כתום וירוק מתוארים לעתים קרובות כמו קרום התא "מת" impermeant כתמי לספור תאים כלכלית9. למרבה הפלא, כאשר נוגדנים אלה משמשים כדי לחקור את המורפולוגיה של נוקלאואיד חיידקי במהלך צמיחת תאים, דאפי, כתום וירוק כל הוצגו להיות קרום permeant, ובעל יכולת תיוג תאים חיים10. E. coli תאים חיים, דאפי צביעה של DNA מופיע ' מאטום לשקוף ' עקב אוטומטי-זריחה של הציטופלסמה, חשיפות חוזרות ונשנות של תאים שהוכתמו דאפי אור אולטרה סגול (UV) perturbs את מבנה נוקלאואיד10. E. coli מכתימים או B. subtilis עם תפוז מגלה כי זה צבע ממברנה permeant ומספק לאורך זמן זריחה על הכריכה ל- DNA בתאים חיים מבלי להשפיע על צמיחת תאים, שכפול ה-DNA או סגרגציה כרומוזום10 . מקרים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש cyanine DNA צבעי לפקח המורפולוגיה של nucleoids במהלך גידול תאים של חיידקים רבים.

Phospholipid-specific stryl צבענים כמו N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrienyl) dibromide pyridinium (4-64; ראה רשימה) הם תרכובות cationic ולשייך מעדיפים אניון פוספוליפידים כגון cardiolipin ו- phosphatidylglycerol11. דפוסים ברורים הם נצפו כאשר 4-64 משמש להוספת תווית הקרום של חיידקים שונים. Escherichia coli, 4-64 מועשר בתמציות הפולנים, בלהקות לאורך החומה לרוחב, ולאחר12תאים האתרים חטיבת pre-divisional של המנוח. ב. Bacillus subtilis, 4-64 תיוג מאפשר את החזיית השומנים ספירלות13. Agrobacterium tumefaciens, 4-64 תוויות הממברנה החיצונית, הוא ציין תבנית אופיינית "פרסה" שבו הקוטב צמיחה נטול תיוג14,15. תצפיות אלה מציינים כי חיידקים אלו שהפגינו הפצות השומנים הטרוגנית בשל נוכחותם של השומנים תחומים אשר תורמים אסימטריה הסלולר. שינויים בדפוסי תיוג 4-64, כגון הנוכחות של תיוג ' מאטום לשקוף ', מגדלים פורחים או שלפוחית, invaginations או הצטמקות קרום יכול להיות אינפורמטיבי באפיון מוטציות להשפיע על ההפצה או ביוסינטזה של ליפידים.

מעבר צביעת תאים, הקובע את הפונקציה של חלבונים המשתתפים בתהליכים חיוניים הכרחי. האפיון של חלבונים חיוניים היא טכנית מאתגר כי זה בלתי אפשרי למחוק גנים חיוניים וללמוד את ההשלכות פנוטיפי. לפיכך, גישות אלטרנטיביות המדלדלים החלבון הופיעו. לדוגמה, ניתן לשים על גנים חיוניים תחת השליטה של יזם inducible ולא יזם מקורי שלה. היזמים inducible הם מגיבים מולקולות קטנות כגון; אבץ vanillate17,23, אראבינוז22, איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21,16 xylose23, ובכך שעתוק של הגן היעד מפסיק, החלבון עניין תיגמר כאשר משרן מוסר. גישות חלופיות עבור depleting חלבונים חיוניים עניין כוללים riboswitches סינתטי24 אשר השתמש מולקולה קטנה-RNA אינטראקציות לעכב שעתוק של גנים היעד, CRISPR הפרעות25,26 כדי לחסום שעתוק של גנים היעד, חלבון inducible השפלה27,28 אשר משתמש בתגי פפטיד חלבונים היעד עבור השפלה על ידי פרוטאז ClpXP. דלדול זנים לספק זמן קצר בלבד עבור אפיון לפני התאים מאבד הכדאיות, לכן, הדמיה מיקרוסקופי של תאים לאורך זמן במהלך דלדול חלבון היא גישה רב-עוצמה עבור אפיון. אכן, מיקרוסקופיה של תאים חיידקיים חי איפשר לחוקרים לקבל תובנות לגבי התהליכים הביולוגיים הבסיסיים, כולל את המנגנונים של תחזוקה צורת התא, הפרשת מידור29.

Tumefaciens א הוא פתוגן חיידקי הצמח30 ,31,טבעי המהנדס הגנטי32. לפיכך, מנגנונים הקשורים פתוגניות, לרבות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות33,34,35, הפרשת36מארח טרנספורמציה30,31, 37 נחקרו בהרחבה. לתכנן אסטרטגיות במניעת מחלות tumefaciens א מתווכת או לשפר את הצמח טרנספורמציה, תהליכים חיוניים להישרדות tumefaciens א צריך להיות מובן יותר. השימוש של צבעי במטרה ופיתוח אסטרטגיה דלדול חלבון tumefaciens א18 האחרונות מספק אמצעים כדי לחקור תהליכים חיוניים.

. הנה, פרוטוקולים מפורט לבדיקה מיקרוסקופית wildtype מוטציה, חלבון דלדול זנים של tumefaciens א הינם מסופקים. הפרוטוקולים שני הראשונים מתארים כיצד להכין תאים, התווית אותם עם צבע במטרה. הפרוטוקול השלישי מספק הנחיות צעד אחר צעד עבור הכנת agarose רפידות (איור 1) והדמיה של תאים חיידקיים (איור 2, איור 3, איור 4). פרוטוקולים אלה יכול להיות גם מתאים חיידקים אחרים עם עיבודים נוספים לקחת בחשבון תנאים מדיה שונים, שיעורי צמיחה, דרישות החמצן של מבנה התא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צמיחה של זנים tumefaciens א

  1. Culturing זנים tumefaciens א
    1. השתמש עצה מקל או pipet עץ סטרילי כדי לחסן 1 מ"ל של צמיחה ATGN מדיה (ראה רשימת חומרים על המתכון) עם מושבה בודדת של המתח הרצוי.
      הערה: עבור זנים דלדול א tumefaciens , ATGN צריכה להכיל 1 מ"מ IPTG כמו משרן כדי לשמור על ביוסינטזה של החלבון חיוני.
    2. גדלים זנים tumefaciens א לילה ב- ATGN ב- 28 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד.
    3. למדוד את הצפיפות האופטית של התאים על 600 nm (OD600) באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את התרבות התא כדי OD600 = ~0.2 ולהמשיך לגדול עד OD600 = ~0.6 מתמלאת. עבור זנים דלדול, להמשיך לגדול עם משרן עד OD600 = ~0.6 מתמלאת.
    4. השתמש wildtype ו מוטנטים זני tumefaciens א -OD600 = ~0.6 במטרה להכתים ו/או מיקרוסקופ בצילום מואץ (ראו סעיפים 2 ו- 3.1). עבור זנים דלדול, לשטוף משרן (ראו סעיף 1.2.)
  2. הסרה של משרן פלואורסנציה זנים דלדול חלבון tumefaciens א
    1. גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית בטמפרטורת החדר.
    2. לשטוף, להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר בתקשורת טריים ללא משרן ו הצניפה התאים כפי שתואר לעיל (1.2.1). לשטוף התאים סך של 3 פעמים בתקשורת טריים.
    3. Resuspend בגדר הסופי בתקשורת טריים ותתרכזו לתאים יתר600 = ~0.8 עבור צביעת מיידית עם יעד ספציפיות צבע (סעיף 2 ו- 4B איור-D) או מיקרוסקופ בצילום מואץ (סעיף 3.2 ואיור 4A) . לחלופין, מראש לרוקן את התאים עבור משך הזמן הרצוי על ידי גידול התאים בתקשורת ללא משרן לפני צביעת והדמיה של התאים.

2. במטרה להכתים של תאים tumefaciens א

  1. תיוג פלורסנט דופן התא חומצה אמינו d
    הערה: FDAAs הן רעיל חומצות אמינו d פלורסנט אשר משולבים ברצון פפטידוגליקן tumefaciens א . הליך זה תיוג פשוטות רגשים צמיחה תכנים תאים חיים6. פרוטוקולים של סינתזה של ארבעה FDAAs הינם זמינים38.
    1. גלולה 500 µL של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית. Resuspend בגדר תא ב- 100 µL של התקשורת טריים.
    2. להוסיף 5 µL של 5 מ מ FDAA כדי לשטוף מרוכז התאים ואת תקופת דגירה של 2 דקות בחושך.
      הערה: להגביל FDAA חשיפה לאור. תקופת הדגירה משתנה בהתאם אחוז הצמיחה של המתח. בדרך כלל, דגירה פעמים צריך להיות 5-10% של זמן ההכפלה6.
    3. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף תא כדורי בתמיסת פוספט buffered (PBS) שלוש פעמים.
    4. Resuspend צנפה ב- PBS µL ~ 50.
      הערה: הנפח של PBS משמש resuspension עשויים להשתנות בהתבסס על גודל גלולה.
    5. החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד (ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2).
      1. לחלופין, לעצור עוד תווית התאגדות על ידי תיקון התאים עם אתנול 70% קר כקרח. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח, דגירה על קרח למשך 15 דקות.
      2. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה, resuspend, נפח קטן של PBS עבור הדמיה במועד מאוחר יותר. חנות תא המתלים ב 4 ° C ו תמונה בתוך 48 שעות.
  2. DNA מכתים עם דאפי או כתם כתום
    הערה: כדי לצפות דנ א מבנה תאים מסומנים עם דאפי או כתום (הכתם תאים מתים). למרות בסגנון קלאסי מתואר "כתם תאים מתים", כתום הוא permeant, photostable, ואינו משפיע על הצמיחה של תאים חיידקיים, המאפשרים לחיות תאים DNA הדמיה10. ב א tumefaciens, יצירות תיוג תפוזים טוב בתאים חיים ומתאים לכל זמן לשגות מיקרוסקופ (איור 3). לעומת זאת, אולטרה סגול (UV) אור החשיפה הכרחי עבור תאים שהוכתמו דאפי הדמיה הוא פוטוטוקסי (איור 3) והוא ובכך דאפי מכתים המתאימה ביותר עבור צביעת תאים חיים מיידית הדמיה או צביעת תאים קבוע.
    1. דאפי צביעת תאים
      1. גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית.
      2. לחלופין, כדי לתקן תאים לפני צביעת, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל אתנול 70% קר כקרח. דגירה על קרח במשך 10-15 דקות לאסוף התאים על ידי צנטריפוגה כפי שמתואר 2.2.1.1.
      3. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של PBS המכיל 1 µL של דאפי מניות פתרון (1 מ"ג/מ"ל; ראה טבלת חומרים). לערבב בעדינות על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.
      4. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב g x כ-7,000 במשך 5 דקות, resuspend ב 1 מ"ל של PBS כדי להסיר עודפי דאפי. רוחצים את התאים עוד פעמיים את resuspend בגדר PBS 50 µL או מדיה.
      5. החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד. ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2.
        הערה: פרוטוקול זה אינה אופטימלית עבור זמן לשגות מיקרוסקופ להתבונן כרומוזום דינמיקה (איור 3). שקול להשתמש מכתים כתום כחלופה (ראו סעיף 2.2.2).
    2. כתמים כתומים של תאים חיים
    3. גלולה 1 מ"ל של תרבות מעריכית (OD600 = ~0.4-0.6) על ידי צנטריפוגה-7,000 g x עבור 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל של PBS המכיל 1 µL של תפוז פתרון מניות (ראה רשימה). לערבב בעדינות על-ידי pipetting, תקופת דגירה של 5 דקות בחושך.
    4. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה, resuspend ב 1 מ"ל של PBS כדי להסיר עודפי כתום. רוחצים את התאים עוד פעמיים את resuspend בגדר ב- 50 µL PBS.
    5. החלת 0.8-1 µL תאים agarose pad ולאחר התמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מיד. ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2.
      הערה: פרוטוקול זה עובד היטב עם תאים חיים ומתאים לכל זמן לשגות מיקרוסקופ להתבונן כרומוזום דינמיקה (איור 3). אם זה לא נוח ליצור תמונה מיד, ניתן לתקן תאים ב- 70% קר כקרח אתנול (ראו סעיף 2.2.1.2).
  3. ממברנה תיוג
    הערה: הפלורסנט יפה lipophilic styryl 4-64 כבר בשימוש נרחב להתבונן הקרום של תאים חיידקיים. בניגוד חיידקים רבים, 4-64 הנקרא tumefaciens א תאים לא תווית בצורה אחידה, אבל מעדיף לעתים קרובות להציג "פרסה" דפוס14,15. למרבה הפלא, הקוטב הצמיחה היא כמעט ריק הכתם בעוד הקוטב הישן תוצמד באופן אינטנסיבי. לפיכך, 4-64 מאפשר הדמיה של דפוסי הצמיחה התא והן מבנה הממברנה tumefaciens א.
    1. להוסיף FM 4-64 ריכוז הסופי של µg/mL 8 ב- 1 מ"ל של תרבית תאים שלב מעריכית, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בחושך.
    2. גלולה תאים עם תוויות על ידי צנטריפוגה ב g x כ-7,000 במשך 5 דקות ב צנטריפוגה שולחנית, resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל ל- PBS. לשטוף התאים בסך הכל שלוש פעמים כדי להסיר צבע עודף.
    3. Resuspend בתאים נפח קטן של PBS, כתם על רכיב pad agarose לשיקוף מיד. (ראה סעיפים 3.1 ו- 3.2)
      התראה: תאים חייב לדימות מיד לבחון דפוסי תיוג אופיינית.

3. הדמיה של תאים tumefaciens א

  1. הכנת משטח Agarose
    הערה: איור 1 כולל, רצף תמונות (לוח א') ו סכמטית כרית agarose טיפוסי מוכן מיקרוסקופ בצילום מואץ (לוח ב'). רפידות Agarose מוכנים בדרך כלל לפי הצורך.
    1. 3.1.1. השתמש coverslip מדריך, חתך 22 מ מ x 22 מ מ מרובע של מעבדה סרט (ראה רשימה) על-ידי הפעלת אזמל בקצוות.
    2. לגזור ריבוע במרכז הסרט מעבדה עוזב ~ 2-5 מ מ הגבול כדי לשמש אטם עבור משטח agarose. למחוק את מרכז אזור החיתוך.
    3. מקם את האטם הסרט לשקופית זכוכית (75 מ"מ x 25 מ"מ) ניקיתי עם אמוניה, מנקה ללא אלכוהול (ראה רשימה) וחום עד הסרט מעט נמס על גבי זכוכית (תמונה עליונה באיור 1A). להמיס הסרט מעבדה, להשתמש בקצה ערכה גוש חום עד 70 ° C או להמיס בקלילות מעל להבה.
    4. הכן agarose פתרון על ידי ערבוב ~0.075 g agarose (ראה רשימה) ב 5 מ של התקשורת בקבוקון קטן. מחממים את הפתרון במיקרוגל עם מתערבל תקופתיים לערבב עד התפרקה agarose הפתרון ברור. לשמור את הפתרון agarose 55-70 ° C ולהשתמש לבנייה של רפידות agarose מרובים תוך 48 שעות.
    5. פיפטה המדיה המכילה 1.2-1.5% agarose אל מרכז האטם.
      הערה: הנפח של המדיה הוא בדרך כלל 50-60 µL אך ישתנו בהתבסס על גודל האטם. הוספת מדיה לשקופית קר יכולה לגרום agarose שבמהלכו מהר מדי, כך לשקופית יש לשמור על משטח חם. הקצה של גוש חום מוגדר 70 ° C עובד טוב. מים agarose או agarose במאגר פתרונות כגון פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) יכול לשמש במקום המדיה המכילה agarose עבור יישומים שבהם תא המשך הצמיחה אינה נדרשת. עבור הדמיה דלדול זנים, משרן ניתן להציג או נעדר בתקשורת. נוכחות של משרן יכול לשמש בתור פקד ואילו היעדר משרן תחשוף את דלדול פנוטיפ.
    6. המקום coverslip מעל האטם לפיזור אחיד של agarose.
    7. במקום שקופיות על משטח קריר, רמת שבמהלכו עבור ~ 2 מינימלית להימנע overdrying של משטח agarose כמו התוצאה תהיה משטח קמטים על משטח agarose ואיגום של התליה תא כאשר מוחל על פני השטח.
    8. החלק בזהירות את coverslip את משטח agarose.
      התראה: אל תאיץ שלב זה. משטח agarose יכול לקרוע בקלות, רכיב pad agarose לא אחידה עלולה להקשות הדמיה.
    9. לאפשר משטח agarose מהאוויר להתייבש במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר להופעת המשטח יבש. באמצעות אזמל, להסיר רצועה קטנה של agarose כדי ליצור כיס אוויר (האמצעי תמונה, איור 1A); לכיס אוויר בדרך כלל ~ 2 מ"מ x 7-10 מ"מ, tumefaciens א התאים נוטים לגדול ביותר ליד לכיס אוויר (איור 1C).
      הערה: עבור הדמיה של תאים קבוע או בתנאים שבו הצמיחה שאינו מפוקח, כיס אוויר אינו הכרחי.
    10. ספוט 0.8-1 µL של תאים על משטח agarose, לכסות עם coverslip החדש. הנח בעדינות את coverslip מעל משטח agarose להפיץ את התאים על פני משטח agarose.
    11. לאטום את הקצוות של coverslip באמצעות VALAP נמס (ראה את הטבלה חומרים למתכון; איור 1A, בתחתית התמונה). כשל לאטום לאורך כל בקצוות ובפינות של coverslip יכולה לגרום התייבשות משטח agarose, אשר יוביל נסחף של תאים במהלך דימות. הערה: איטום coverslip נדרשת רק עבור הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך.

figure-protocol-1
איור 1: הכנת משטח Agarose. (א) תמונה רצף פרוטוקול הכנה agarose pad. תמונה 1 הוא שקופית עם gasket הסרט מעבדה. בתמונה 2, הם דמיינו את משטח agarose ואת כיס אוויר. בסופו של דבר, התמונה 3 מראה את משטח agarose מלאה עם התאים תחת coverglass ואטום עם VALAP. (B) A תרשים סכמטי של רכיב pad agarose עבור זמן לשגות מיקרוסקופ מסופק. תכונות מפתח של משטח agarose מסומנות על התרשים. (ג) לכיס אוויר לקדם צמיחה של tumefaciens א -agarose רפידות. מוצגות תמונות של תאים tumefaciens א wildtype גדל על רכיב pad agarose במשך 20 שעות. התמונות צולמו ב עמדות יותר ויותר רחוק לכיס אוויר. המרחק מהקצה הקרוב ביותר של התמונה לכיס אוויר מוצג מעל כל תמונה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

  1. הדמיה
    הערה: התערבות דיפרנציאלית ניגודיות, חדות שלב ו epifluorescence הדמיה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצויד autofocusing שותק מבוססי חומרה, שלב אוטומטיות, מסננים רגיל, מקור אור LED, טבילה שמן X 60 מטרות (1.4 NA) עבור שלב חדות או התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC), מצלמה 1 ג הכפלת אלקטרון תשלום מצמידים-התקן (EMCCD). המיקרוסקופ יוצב בחדר מבוקרת טמפרטורה. לחלופין, הבמה החמים או קאמרית יכול לשמש כדי לשמור על טמפרטורה עקבית במהלך דימות.
    1. מיקרוסקופ Epifluorescence
      הערה: עבור קרינה פלואורסצנטית הדמיה של תאים חיים, זה הכרחי להגביל את מספר התמונה רכישות ולמטב את זמן החשיפה כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity. עבור הדמיה של כל צבע, מומלץ למצוא זמן חשיפה אופטימלית בלתי מספקת זיהוי קרינה פלואורסצנטית מספיק אך לא תוביל photobleaching או phototoxicity. דמויות 2-4פעמים חשיפה של 200 ms שימשו לכל התמונות זריחה. עבור רצפי זמן לשגות בתרשים 3, תמונות נרכשו בכל 10 דקות במשך 3 שעות.
      1. במקום שמן טבילה על המטרה הרצויה ומניחים את השקופית הפוך לתוך מחזיק שקופיות על הבמה. השימוש בידית התמקדות להביא את התאים להתמקד.
      2. לרכוש תמונות שלב (או DIC) ומסנן קרינה פלואורסצנטית הרצוי.
        הערה: מקסימלי עירור, פליטה אורכי הגל עבור שהכתמים בשימוש איור 2, איור 3ו- 4 איור הם כדלקמן: HADA (405/460), נאדה (450/555), ג'אר (555/570), 4-64 (515/640), דאפי (360/460), כתום (547/570).
    2. מיקרוסקופ בצילום מואץ
      הערה: במהלך זמן לשגות מיקרוסקופ התכונות הבאות הן מחשב הנשלט: x, y ו- z עמדה, תריסים, קרינה פלואורסצנטית ומסננים. מערכת פוקוס אוטומטי המבוסס על חומרה היא אופטימלית כדי לשמור על ריכוז במהלך דימות זמן לשגות. לחלופין, ניתן להשתמש הלולאה-מבוססות תוכנה מיקוד אוטומטי.
      1. במקום שמן טבילה על המטרה הרצויה ומניחים את השקופית הפוך לתוך מחזיק שקופיות על הבמה. השימוש בידית התמקדות להביא את התאים להתמקד.
      2. אופציונלי: לרכוש מרובים (x, y) עמדות. לבחור באקראי 10 שדות של תאים בסמיכות לכיס אוויר של הידיות agarose.
      3. הגדרת זמן רצף רכישת תמונת שלב או DIC במרווח הזמן הרצויים.
        הערה: את הרצף זמן לשגות המוצג באיור 4, DIC תמונות נרכשו עם 30 ms חשיפה בכל 10 דקות במשך 14 שעות. בעת שימוש פלורסצנטיות דימות במהלך זמן לשגות מיקרוסקופ, להתאים את רכישת מרווח וחשיפה הזמן כדי למזער את photobleaching ואת phototoxicity.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במטרה תיוג של wildtype א tumefaciens תאים
כדי להמחיש את המורפולוגיה תא לא מושפע על ידי שטיפת מדרגות או טיפול עם 1% דימתיל סולפוקסיד (אשר נמצא בשימוש כדי לדלל את צבעי פלורסנט), התאים היו עם תמונה ישירות מתרבות (איור 2 א, לוח השמאלי), לאחר שטיפת התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר ב- 1.2 (איור 2 א, פאנל שמאלי), או לאחר המקננת התאים עם דימתיל סולפוקסיד 1% 10 דקות ולשטוף את הת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מכיל סדרה של הליכי החקירה של זנים wildtype מוטציה, דלדול tumefaciens א . ראוי לציין כי כל הנהלים המפורטים בסעיף פרוטוקול יכול להיות מותאם בקלות זני חיידקים אחרים עם שינויים נוספים חשבון צמיחה מדיה, טמפרטורות של שיעורי צמיחה.

השימוש של צבעי במטרה הוא כלי רב ערך עבור מתן אפיון מפורט של אירועים מחזור התא בתאי חיידקים. כאן, דפוסי ההכנסה פפטידוגליקן נצפו באמצעות חומצות אמינו פלורסנט-d, השומנים תחומים היו דמיינו 4-64, ומוענקת nucleoids היו דאפי או כתום. כל אחד מהפרוטוקולים ניתן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים מיכאל VanNieuwenhze (אוניברסיטת אינדיאנה) על המתנה של FDAAs בשימוש איור 2 באיור 4. אנו מודים חברי המעבדה חום לקבלת משוב במהלך הכנת כתב היד הזה. המחקר במעבדה חום על צמיחת תאים tumefaciens א וחילוק נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע (IOS1557806).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<זנים חזקים>חיידקים
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. פלסמיד נדרש לאלימות של Agrobacterium tumefaciens. J בקטריול 123: 255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::מיני-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ודלתא; ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. החדרת Mini-Tn7 באתר attTn7 מלאכותי מאפשרת פיזור של הרגולטור הראשי של essentail CtrA בפיטופתגן Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NameCompanyCatalog NumberComments/strong<>
Media Components
ATGN מינימלי בינוניל-1 ליטר מים מעוקרים מוסיפים 50 מ"ל 20X Buffer, 50 מ"ל 20X מלחים, 12.5 מ"ל 40% גלוקוז. לצלחות, הוסף 15 גרם בקטו אגר ל -1 ליטר מים וחיטוי. מצננים ל-55 מעלות; C ולהוסיף 50 מ"ל 20X Buffer, 50 מ"ל 20X מלחים, 12.5 מ"ל 40% גלוקוז.
20X ATהוסף 214 גרם/ליטר KH2PO4 למים והתאם את ה-pH ל-7.0 עם נתרן הידרוקסיד. חיטוי.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT מלחיםמוסיפים 40 גרם/ליטר (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4• 7H2O, 0.2 g/L CaCl2• 2H2O, ו-0.024 g/L MnSO4• H2O למים. חיטוי.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2• 2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlucoseFisher ChemicalD16הכינו 40% מלאי במים. מסננים לעקר.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423הוסף 15 גרם ל -1 ליטר מים בעת הכנת צלחות.
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>תוספי מדיה אופציונליים
קנמיציןGoldBioK-120הכן כתמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל במים ולעקר מסנן. יש להשתמש בריכוז סופי של 200 ומיקרו; גרם/מ"ל.
IPTGGoldBioI2481C5הכן כתמיסת מלאי של 1 מיליון במים ועיקור מסננים. השתמש בריכוז סופי של 1 מ"מ לפי הצורך לאינדוקציה.
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>מיקרוסקופ חומרים
מיקרוסקופ שקופיותפישרברנד12-550D25 X 75 X 1.0 מ"מ. נקה עם מנקה זכוכית נוצץ.
כיסוי מיקרוסקופ זכוכיתפישרברנד12-541-B22 X 22 מ"מ. מס' 1.5. נקה עם מנקה זכוכית נוצץ.
מנקה זכוכית נוצצתהום דיפו203261385אמוניה ואלכוהול ללא אלכוהול.
Ultra Pure AgaroseInvitrogen16500-100להוסיף למים, PBS או מדיה לריכוז סופי של 1 - 1.5%. ממיסים במיקרוגל ומניחים על 70
C PBSFisher BioReagentsBP399500תמיסה 10X לדילול ל-1X במים סטריליים.
ParafilmBemisPM-999סרט מעבדה המשמש כאטם בהכנת כריות אגרוז.
VALAPהוסף משקלים שווים של לנולין, שעוות פרפין וג'לי נפט לצינור חרוטי. צינור חום ב-70 מעלות; C אמבט יבש, חרוזים או מים להמסה ולערבוב. יש למרוח VALAP בעודו מותך.
חמאת לנוליןSAAQINSQ-LAB-R1
ג'לי נפטTarget Corp.06-17644
שעוות פרפיןנרות ערמומיים263012
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>צבעים ספציפיים למטרה
DMSOפישר ביוריאגנטיםBP231-1השתמש כדי לדלל תמיסות מלאי של צבעים לפי הצורך.
FDAAs (NADA, HADA, TADA)ניתן לסנתז או לרכוש FDAAs באמצעות הסכם עם Mike VanNieuwenhze (אוניברסיטת אינדיאנה). הכן פתרון מלאי של 100 מ"מ ב-DMSO. יש להשתמש בריכוז סופי של 5 מ"מ.
DAPIThermoFisher Scientific62247הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. יש להשתמש בריכוז סופי של 1 ומיקרו; גרם/מ"ל.
של SYTOX Orange Nucleic Acid StainInvitrogenS11368הוא 5 מ"מ ב-DMSO. יש להשתמש בריכוז סופי של 5 &M.
FM4-64InvitrogenT3166הכן תמיסת מלאי של 8 מ"ג/מ"ל ב-DMSO. יש להשתמש בריכוז סופי של 8 ומיקרו; גרם/מ"ל.
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>תגובות
<חזק>ציוד
אמבטיה יבשהשלדון ייצור בע"מ.52120-200
חרוזים תרמיים מתכתייםשריון מעבדה42370-002
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמתNikon Eclipse TiE המצויד במצלמת QImaging Rolera em-c2 1K מכפיל אלקטרונים (EMCCD) משמש בעבודה זו.
מאגר ריכוז המלאי EMCDD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daniel, R. A., Errington, J. Control of cell morphogenesis in bacteria: two distinct ways to make a rod-shaped cell. Cell. 113 (6), 767-776 (2003).
  2. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  3. Turner, R. D., et al. Peptidoglycan architecture can specify division planes in Staphylococcus aureus. Nat Commun. 1, 26(2010).
  4. Wheeler, R., Mesnage, S., Boneca, I. G., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Super-resolution microscopy reveals cell wall dynamics and peptidoglycan architecture in ovococcal bacteria. Mol Microbiol. 82 (5), 1096-1109 (2011).
  5. Turner, R. D., Hurd, A. F., Cadby, A., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall elongation mode in Gram-negative bacteria is determined by peptidoglycan architecture. Nat Commun. 4, 1496(2013).
  6. Kuru, E., et al. In Situ probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  7. Siegrist, M. S., et al. (D)-Amino acid chemical reporters reveal peptidoglycan dynamics of an intracellular pathogen. ACS Chem Biol. 8 (3), 500-505 (2013).
  8. Kepner, R. L., Pratt, J. R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: past and present. Microbiol Rev. 58 (4), 603-615 (1994).
  9. Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. J Vis Exp. (79), (2013).
  10. Bakshi, S., et al. Nonperturbative imaging of nucleoid morphology in live bacterial cells during an antimicrobial peptide attack. Appl Environ Microbiol. 80 (16), 4977-4986 (2014).
  11. Barak, I., Muchova, K. The role of lipid domains in bacterial cell processes. Int J Mol Sci. 14 (2), 4050-4065 (2013).
  12. Fishov, I., Woldringh, C. L. Visualization of membrane domains in Escherichia coli. Mol Microbiol. 32 (6), 1166-1172 (1999).
  13. Barak, I., Muchova, K., Wilkinson, A. J., O'Toole, P. J., Pavlendova, N. Lipid spirals in Bacillus subtilis and their role in cell division. Mol Microbiol. 68 (5), 1315-1327 (2008).
  14. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. MBio. 5 (3), e01219(2014).
  15. Zupan, J. R., Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zambryski, P. C. Dynamic FtsA and FtsZ localization and outer membrane alterations during polar growth and cell division in Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 9060-9065 (2013).
  16. Eberhardt, A., Wu, L. J., Errington, J., Vollmer, W., Veening, J. W. Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems. Mol Microbiol. 74 (2), 395-408 (2009).
  17. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  18. Figueroa-Cuilan, W., Daniel, J. J., Howell, M., Sulaiman, A., Brown, P. J. Mini-Tn7 Insertion in an Artificial attTn7 Site Enables Depletion of the Essential Master Regulator CtrA in the Phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82 (16), 5015-5025 (2016).
  19. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  20. Khan, S. R., Gaines, J., Roop, R. M. 2nd, Farrand, S. K. Broad-host-range expression vectors with tightly regulated promoters and their use to examine the influence of TraR and TraM expression on Ti plasmid quorum sensing. Appl Environ Microbiol. 74 (16), 5053-5062 (2008).
  21. Yansura, D. G., Henner, D. J. Use of the Escherichia coli lac repressor and operator to control gene expression in Bacillus subtilis. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (2), 439-443 (1984).
  22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  23. Thanbichler, M., Iniesta, A. A., Shapiro, L. A comprehensive set of plasmids for vanillate- and xylose-inducible gene expression in Caulobacter crescentus. Nucleic Acids Res. 35 (20), e137(2007).
  24. Topp, S., et al. Synthetic riboswitches that induce gene expression in diverse bacterial species. Appl Environ Microbiol. 76 (23), 7881-7884 (2010).
  25. Peters, J. M., et al. A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. Cell. 165 (6), 1493-1506 (2016).
  26. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  27. Griffith, K. L., Grossman, A. D. Inducible protein degradation in Bacillus subtilis using heterologous peptide tags and adaptor proteins to target substrates to the protease ClpXP. Mol Microbiol. 70 (4), 1012-1025 (2008).
  28. McGinness, K. E., Baker, T. A., Sauer, R. T. Engineering controllable protein degradation. Mol Cell. 22 (5), 701-707 (2006).
  29. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 371 (1707), (2016).
  30. Escobar, M. A., Dandekar, A. M. Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci. 8 (8), 380-386 (2003).
  31. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), table of contents 16-37 (2003).
  32. Nester, E. W. Agrobacterium: nature's genetic engineer. Front Plant Sci. 5, 730(2014).
  33. Imam, J., Singh, P. K., Shukla, P. Plant Microbe Interactions in Post Genomic Era: Perspectives and Applications. Front Microbiol. 7, 1488(2016).
  34. Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front Plant Sci. 5, 322(2014).
  35. Yuan, Z. C., Williams, M. A really useful pathogen, Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell. 24 (10), (2012).
  36. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  37. Pitzschke, A. Agrobacterium infection and plant defense-transformation success hangs by a thread. Front Plant Sci. 4, 519(2013).
  38. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat Protoc. 10 (1), 33-52 (2015).
  39. Curtis, P. D., Brun, Y. V. Identification of essential alphaproteobacterial genes reveals operational variability in conserved developmental and cell cycle systems. Mol Microbiol. 93 (4), 713-735 (2014).
  40. Kim, J., Heindl, J. E., Fuqua, C. Coordination of division and development influences complex multicellular behavior in Agrobacterium tumefaciens. PLoS One. 8 (2), e56682(2013).
  41. Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), (2011).
  42. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  43. Zeng, L., Golding, I. Following cell-fate in E. coli after infection by phage lambda. J Vis Exp. (56), e3363(2011).
  44. Brown, P. J., et al. Polar growth in the Alphaproteobacterial order Rhizobiales. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (5), 1697-1701 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Time lapseDNAAgrobacterium Tumefaciens

מאמרים קשורים