Method Article

Microstructured מכשירי Microinjection אופטימיזציה והדימות של הזחלים דג זברה

DOI:

10.3791/56498

⸱

December 8th, 2017

 , 
1BioMEMS Resource Center, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection של דג זברה עוברי וזחלים היא טכניקה חיונית ומאתגרת המשמשים דגמים רבים של דג זברה. כאן, אנו מציגים מגוון רחב של כלים microscale כדי לסייע ייצוב והכיוון של דג זברה הן microinjection והן הדמיה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה של מחלות אנושיות שונות, כלי שימושי עבור טווח גדל והולך של מחקרים ניסיוניים, פורש יסוד ביולוגיה התפתחותית דרך מסכי גנטי וכימיים בקנה מידה גדול. עם זאת, ניסויים רבים, במיוחד אלה הקשורים לזיהום, מודלים xenograft, לסמוך על microinjection הדמיה של עוברי וזחלים, אשר מפרך טכניקות הדורשות מיומנות ומומחיות. כדי לשפר את הדיוק ואת התפוקה של טכניקות microinjection הנוכחי, פיתחנו סדרה של התקנים microstructured אוריינט ולייצב את העוברים דג זברה-2 ימים שלאחר ההפריה (dpf) בכיוון הגחון, הגבי או לרוחב לפני נוהל. כדי לסייע ההדמיה של העוברים, עיצבנו גם מכשיר פשוט עם ערוצים אוריינט דג זברה 4 רוחבית במקביל נגד החלקה כיסוי זכוכית. יחד, בכלים אותם אנו מציגים כאן להדגים את היעילות של גישות photolithographic כדי ליצור התקנים שימושי עבור אופטימיזציה של טכניקות דג זברה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג זברה הופיעו כמודל עוצמה עבור שדות רבים, מחקרים של יסוד ביולוגיה התפתחותית כדי בקנה מידה גדול גנטי, כימית מסכי1,2. שינויים גנטיים שגרתיות, כגון ביטוי גנים, נוקאאוט, מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9 transgenesis לסמוך על microinjection של חומר גנטי לתוך הזיגוטה מתא בודד, אשר הובילה להתפתחות של פשוט, קל לשימוש, מסחרית כלים זמינים עבור המכוונת וייצוב ביצים הזרקת3. גישות אחרות, כגון השתלת זיהום, דורשים לעיתים קרובות microinjection לתוך העוברים בשלב מאוחר יותר, הזחלים באמצעות מד גדול מחטים נימי4. עם זאת, השימוש מחטים מד גדול מציג אתגרים טכניים משמעותיים, כמו זה יותר קשה ל....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microinjection של הזחלים אושרה על ידי הוועדה חולים כללי מסצ'וסטס-אכפת לי חיה מחקר תחת פרוטוקול 2011N000127.

1. התקן פבריקציה נוספת

הערה: כל בסיוע מחשב (CAD) קבצי ציור המשמש עיצוב מסכות פוטוליתוגרפיה המתוארים כאן (איור 1) זמינים להורדה. ראה טבלה של חומרים עבור קישורים.

  1. לפברק כשהפחד מאסטר עובש בחדר נקי Class 1,000 באמצעות טכניקות photolithographic סטנדרטי7. עבור מערכים מיקרו ו ערוצים, דפוס את photoresist על בסיס אפוקסי שלילי ברצף ב 3 שכבות באמצעות 3 מסכות נפרדים, בהתאם להוראות היצרן: 100 מיקרומטר עבור התכונות רדוד, מיקרומטר 200 עבור התכונות בינונית ו- ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגישה המתוארת כאן מדגים את העיצוב (איור 1) ועל פבריקציה נוספת של התקנים לשימוש עם דג זברה 2 dpf, באמצעות photolithographic (איור 2) וטכניקות רך-ליטוגרפיה (איור 3). שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה של איטראציות עיצוב ושינויים רבים, שינויים ואופטימיזציה של מיקרו מידות לשימוש עם דג זברה אחרים שלבי ההתפתחות רשאי להאריך את היישום שלהם.

נדגים שימוש של .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את השימוש של ההתקנים שפיתחנו לאחרונה להקל על 2 dpf דג זברה microinjection5, ולהציג את התקן הרכבה פשוטה ללא agarose עבור הדמיה נוח של העוברים. כלים אלה מדגישים את התועלת של טכניקות photolithographic להרכבת התקנים שימושי עבור דג זברה טכניקות.

מצאנו למתקן התקנים שימושי במיוחד עבור הזרקה של תאים או חלקיקים נוטה צבירת בתוך המחט microinjection, כגון conidia פטרייתי או תאים סרטניים אנושיים, אשר דורשים את השימוש מחט שיעמום גדול יותר עבור משלוח. הזרקה לתוך שלפוחי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות לאנגנאו דוד למתן בנדיבות שטח האקווריום; אריק אבן, ג'ון ג. מור, צ'ין טאנג בשביל לעזור עם דג זברה תחזוקה, ריאגנטים, ו אן רוברטסון, אליוט Hagedorn מהמעבדה של לאונרד Zon עבור ברכישת המתח דג זברה המשמש כאן. הם גם רוצה להודות אוקטביו הורטדו לקבלת ייעוץ על טכניקות photolithographic. FE מומן על ידי מלגות מבית החולים של שריינר לילדים, האגודה האמריקאית אוסטרלי. עבודה זו מומן על ידי NIH הענק GM92804.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhsives184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"גליציקת המכשירים. הערכה כוללת מונומר ויוזם PDMS
טמפרטורת ג'ל נמוכה אגרוזסיגמא אולדריץ'A9414-10Gליציקת מכשירי אגרוז
PFDTS סילאןסיגמא אולדריץ'448931-10Gליציקת תבניות PDMS שליליות
טריקאין (MS-222)סיגמא אולדריץ'E10521-10Gלהרדמת דג זברה
רודמין דקסטרן 70,000 DaThermoFisherD1818כדי לעקוב אחר מיקרו-הזרקות
לויקוטריאן B4 (LTB4)קיימן כימיקלים20110נויטרופיל כימואטרקטורנט
N-פורמיל מתיונין-לאוציל-פנילאלנין (fMLP)סיגמא אולדריץ'F3506-50MGנויטרופיל כימואטרקנטנט
15 ס"מ צלחת פטריפישר מדעי08-757-148ליציקה מהפרוסה הראשית
צלחות זכוכית תחתונות 6 בארותMatTekP06G-0-20-Fלמכשירי הדמיה
מיקרו-נימי זכוכית בורוסיליקטמכשירים מדעיים עולמייםTW-100-4למחטי מיקרו-הזרקה
העברת פיפטותסיגמא אולדריץ'Z350796להעברת עוברי דג זברה
טיפים למיקרו-מעמיספישר E5242956003 מדעילהעמסת מחטי המיקרו-הזרקה
האריס Uni-Core אגרוף 1.5 מ"מטד פלה בע"מ15111-15לנקב יציאות במכשירי הדמיה PDMS
מס' 11 אזמלכלי מדע עדינים10011-00לחיתוך PDMS
Dumont מס' 5 מלקחייםכלי מדע עדינים11252-10לפירוק עוברים ושבירת קצות מחט מיקרו-הזרקה
Marzhauser מיקרומניפולטורASIMM33-Rלמניפולציה של מחט מיקרו-הזרקה
מעמדמגנטיMSCSPI - 87242624להרכבת מיקרומניפולטור
MPPI-3 בקר PicopumpASIMPPI-3לשליטה בנפח ותזמון מיקרו-הזרקה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך EVOSThermoFisherEVOS FLלהדמיית עוברים מוזרקים
מיקרוסקופ ניתוחניקוןSMZ745להדמיית מיקרו-אינג'סיון
תוכנת AutoCADAutodeskהורד קבצי AutoCAD מ: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 ובדף הוויקי של פרוטוקולי הקהילה של ZFIN: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki  

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  2. Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zebrafish MicroinjectionMicrostructured DevicesEmbryo OrientationImaging ChannelsPDMS BlockHair Loop ManipulationPICO PumpFluorescent MicroscopyOtic VesicleNeutrophil Recruitment

Related Articles