בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוביקוויטין דמוי קטן משנה (סומו) השינוי הוא שינוי post-translational חשוב (PTM) המעביר אותות בעיקר דרך להתכוונן אינטראקציות חלבון חלבון. בדומה אוביקוויטין השינוי, SUMOylation הוא בבימויו של מפל אנזים רציפים לרבות E1-מפעיל אנזים (SAE1/SAE2), E2-ההטיה אנזים (Ubc9) ו- E3 ליגאז (קרי, משפחת PIAS, RanBP2, ו- Pc2). לעומת זאת, שונה ubiquitination, E3 ליגאז הוא שאינם חיוניים עבור התגובה אך האם לספק הדיוק והיעילות סומו ההטיה. חלבונים שונה על-ידי SUMOylation יכול להיות מזוהה על ידי ויוו assay ויה immunoprecipitation עם נוגדנים ספציפיים המצע, immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים סומו. עם זאת, ההדגמה של פעילות החלבון סומו E3 ליגאז דורש במבחנה הכינון של מבחני SUMOylation באמצעות אנזימים מטוהרים, המצע סומו חלבונים. מאז בתגובות במבחנה , בדרך כלל SAE1/SAE2, Ubc9, לבד מספיק עבור סומו ההטיה, שיפור של SUMOylation על ידי ליגאז E3 בשם לא תמיד קל לזהות. כאן, אנו מתארים יישום ששונה במבחנה פרוטוקול SUMOylation שמזהה באופן עקבי סומו שינוי באמצעות מערכת במבחנה מחדש. פרוטוקול צעד אחר צעד לטהר פעיל catalytically K-bZIP, ליגאז ויראלי E3 סומו-2/3, מוצג גם. הפעילות SUMOylation של K-bZIP מטוהרים מוצגים ב- p53, מטרה ידועה של סומו. פרוטוקול זה יכול לא רק להיות מועסק שחקרתי הרומן ligases סומו E3, אלא גם חשיפת שלהם ירידה לפרטים paralog סומו.
מבוא
סומו השינוי זוהה בתחילה כמו שינוי post-translational הפיך (PTM) המסדירה את יציבות חלבון1. בנוסף נטיה ישירה, סומו ניתן גם לחבר חלבון תוך אינטראקציה אי-קוולנטיות על-ידי סומו אינטראקציה עם מוטיבים (סימס)2. דומה קשירה של tyrosyl-זרחון על ידי מולקולות מחסה Src הומולוגיה 2 (SH2) או איגוד phosphotyrosine (PTB) תחומים3,4, סומו שינוי מספק פלטפורמה אינטראקציה נוספת עבור סלקטיבית גיוס של ה-SIM המכיל אפקטור חלבונים5,6. בנוסף רגולציה של אותות, לשרת SUMOylation של כרומטין שיפוץ מולקולות וגורמי תעתיק לווסת את ג'ין-ביטוי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת בונה הביטויים Baculovirus
-
לטהר סומו E3 ליגאז K-bZIP על-ידי שיבוט של cDNA של K-bZIP19 לתוך וקטור baculovirus ביטוי כפול (ראה טבלה של חומרים) עם epitope-תג N-מסוף. . היו לנו הצלחה באמצעות תג octapeptide (מסומן לאורך כל הפרוטוקול כמו וקטור-תג-K-bZIP).
הערה: תבנית ה-DNA של K-bZIP פולימראז תגובת שרשרת (PCR) שיבוט זה cDNA הפוכה עיבד מ- RNA מבודד מתאי TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 בעקבות טיפול דוקסילין20.- העברה של cDNA באורך מלא K-bZIP19 לתוך הווקטור ביטוי כפול עם Cpoאני שיבוט אתרים. Cpo מעכל את המוצר PCR ו- µg 1 של וקטור ביטוי כפול ב 37 ° C 3 h
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
על פי המידע שנמסר על ידי היצרן, כמות האנזים E1, E2 ב וזמינותו SUMOylation רגיל הוא 50 ננומטר, 500 ננומטר, בהתאמה. כמות מינימלית של E2 conjugating אנזים Ubc9 כי הוא מסוגל SUMOylate p53 נקבע לראשונה על ידי assay SUMOylation במבחנה . נמוך ככל חמישית מכמות Ubc9 המשמשים את תקן במבחנה SUMOylation assay פרוטוקול הצליח ביעילות SUMOylate p53 (איור 1א'). לכן, חצי מכמות האנזים E1 בשילוב עם עשירית מהסכום של Ubc9 בשימוש הפרוטוקול הסטנדרט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במבחנה פרוטוקול SUMOylation המתוארים כאן באופן שגרתי משמש כדי לקבוע את מצב SUMOylation מזוהה Ubc9 סובסטרטים. המגבלה העיקרית באמצעות פרוטוקול סטנדרטי כדי לחקור את תפקוד SUMOylation סומו E3 ליגאז הוא השפע של הפעלת סומו E1, E2 conjugating אנזימים Ubc9 למקסם את ההטיה סומו במערכות במבחנה . בהתחשב באתגר זה, אנו מאמינים זה טיטור מהסכום של אנזימים סומו E1, E2 לשלב אחד בקושי יכול לזהות שאת הפעילות שלהם ב- SUMOylation זמין רק דרך לקבוע סומו E3 ליגאז קטליטי פעילויות באמצעות הזה חוץ גופית בתוך מערכת SUMOyl.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לחשוף אין פוטנציאל ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים את משרד המדע והטכנולוגיה (רוב, 105-2320-B-010-007-MY3 כדי PCC), מן המכון מחקר הבריאות הלאומי (NHRI-EX105-10215BC כדי PCC), את משרד המדע והטכנולוגיה (ביותר 105-2314-B-400-019 כדי HJK) מ מכון המחקר הבריאות הלאומי (NHRI MG-105-SP-10, NHRI מ"ג-106-SP-10 כדי HJK). עבודה זו נתמכה גם חלקית עם האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג על כתב היד את הפרסום PCC. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או ותכליתם של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | וקטור baculovirus ביטוי כפול |
| pCR2.1-TOPO וקטור | Invitrogen | PCR וקטור מוצר | |
| תא מוכשר E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | מוסמך E. coli תאים A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | תאים מוסמכים E. coli B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | מגיב טרנספקציה |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | מדיה מופחתת בסרום |
| T4 Ligase | ניו אינגלנד BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | מצע גלקטוזידאז |
| IPTG | סיגמא-אולדריץ' | I6758-1G | |
| גרייס' s חרקים בינוניים | Gibco | 11605094 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| גנטמיצין | Gibco | 15710-064 | |
| טטרציקלין | סיגמא-אולדריץ' | 87128-25G | |
| LB מרק | מרק | 1.10285.0500 | |
| HEPES | סיגמא-אולדריץ' | H4034-100G | |
| NaCl | סיגמא-אולדריץ' | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| נתרן דודציל סולפט | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (בסיס) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| חלב ללא שומן | פונטרה | ||
| גליצרול | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | חומר ניקוי A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | חומר ניקוי B |
| Poloxamer 188 תמיסת | סיגמא-אולדריץ' | P5556-100ML | חומר ניקוי C |
| מעכב פרוטאז טבלית קוקטייל | רוש | 04 693 132 001 | |
| 3x פפטיד דגל | סיגמא | F4799 | |
| anti-FLAG m2 חרוזים מגנטיים | Sigma-Aldrich | M8823 | נוגדן מתויג חרוזים מגנטיים |
| SUMOlink SUMO-1 ערכת | Active Motif | 40120 | פרוטוקול SUMOylation סטנדרטי |
| SUMOlink SUMO-2/3 ערכת | Active Motif | 40220 | פרוטוקול SUMOylation סטנדרטי |
| ערכת מיצוי ג'ל QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN פלסמיד מיני ערכת QIAGEN | 12123 | ערכת מיצוי פלסמיד | |
| צינורות פוליפרופילן | פלקון | 352059 | |
| פטרי צלחת | פלקון | 351029 | |
| מרים תאים | קורנינג | CNG3008 | |
| קצה טעינה | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| ספיגת נייר סינון | Bio-Rad | 1703932 | |
| מיני לוח ג'ל מנגנון (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD חצי יבש אלקטרופורטי העברה תא | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL |
| מערבל השעיית ריאגנטים | Digisystem laboratory instruments Inc. | שייקר מסלול SM-3000 | |
| Kansin Instruments Co. | OS701 | ||
| ImageQuant LAS 4000 הדמיה ביו-מולקולרית | GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| נוגדנים נגד p53 | איתות תאים | #9282 | |
| נוגדן נגד ארנב | GE Healthcare | NA934-1ML |
מקורות
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
