Method Article

מזהה מבוססי-רשת עצבית של Oocytes וחוה עכבר נכה כשיר או לא מוכשר

DOI:

10.3791/56668

⸱

March 3rd, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio di Biologia dello Sviluppo, Dipartimento di Biologia e Biotecnologie "Lazzaro Spallanzani", University of Pavia, 2Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 3Department of Reproductive Medicine, University of California San Diego, 4Dipartimento di Ingegneria Industriale e dell'Informazione, University of Pavia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים עבור הערכה בלתי פולשני של מיומנות התפתחותית oocyte שבוצעה במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal לשלב השני מפה של פרוטוקול. שיטה זו משלבת הדמיה בצילום מואץ עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV) וניתוחים רשת עצבית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מרפאות פוריות ירוויחו היכולת לבחור כשיר מבחינת לעומת oocytes כשירים באמצעות הליכים פולשנית, ובכך לשפר את התוצאה הכוללת של ההריון. לאחרונה פיתחנו שיטת סיווג המבוסס על תצפיות חיים מיקרוסקופיים של העכבר oocytes במהלך שלהם במבחנה ההבשלה של שלפוחית germinal (GV) ועד השלב השני מפה של, ואחריו הניתוח של התנועות cytoplasmic המתרחשים במהלך תקופה זו זמן לשגות. כאן, אנו מציגים נתונים היסטוריים הפרוטוקולים של הליך זה. Oocytes מבודד זקיקים antral וחוה, תרבותי עבור h 15 בתוך מיקרוסקופ מצויד לניתוח זמן לשגות-CO 37 ° C ו-5%2. תמונות נלקחים במרווחים של 8 דקות. התמונות ניתוח בשיטת Velocimetry תמונת החלקיקים (PIV) מחשבת, עבור כל oocyte, הפרופיל של מהירויות התנועה Cytoplasmic (CMVs) המתרחשים לאורך כל תקופת תרבות. בסופו של דבר, CMVs של כל יחיד oocyte מוזנים דרך סיווג מתמטית כלי (רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה, FANN), אשר מנבאת את ההסתברות של תא רבייה להיות נכה או לא מוכשר עם דיוק של 91.03%. פרוטוקול זה, להגדיר עבור העכבר, עכשיו נבדק על oocytes של מינים אחרים, כולל בני אדם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פוריות נשית היא מחלה המשפיעה על מספר גדל והולך של נשים. בסביבות על פי ארגון הבריאות העולמי, 20% של זוגות הם עקרים, עם 40% עקב בעיות פוריות נשית. בנוסף, שליש אחד של נשים שעברו טיפולים בסרטן (300,000 לשנה ו- 30,000 שנה בארצות הברית או איטליה, בהתאמה) לפתח שחלות מוקדמת.

אסטרטגיה כדי למנוע בעיות פוריות אצל חולי סרטן הוא בידוד הקפאה קריוגנית של זקיקי השחלה לפני הטיפול אונקולוגית, ואחריו במבחנה ההבשלה (IVM) של oocytes GV לבמה MII (GV-כדי-MII המעבר). הזמינות של סמנים לא פולשנית של מיומנות התפתחותית oocyte תשפר ההפריה, תהליכים התפתחותיים, הכוללת הריון הצלחה1,2.

בהתבסס על תצורת כרומטין שלהם נצפתה לאחר צביעת עם fluorochrome supravital Hoechst 33342, יונקים oocytes וחוה מסווגים מוקף גרעינון (SN) או לא מוקף גרעינון (NSN)3. מלבד ארגון כרומטין שונים שלהם, אלו שני סוגים של oocytes להציג הרבה הבדלים מורפולוגיים ופונקציונליים3,4,5,6,7,8 ,9, כולל את היכולות meiotic והפיתוחים שלהם. כאשר מבודד מן השחלה, התבגר במבחנה, הן סוג של oocytes להגיע לשלב MII, ולפתח הזרעה זרע, לשלב 2 תאים, אך רק אלו עם ארגון כרומטין SN עלולים לפתח המונח9. אמנם טוב כשיטה סיווג לבחירת המוסמכת נ' oocytes לא מוכשר, אולם החיסרון העיקרי הוא ההשפעה של ה מוטגני fluorochrome עצמה ו, ומעל לכל, את האור האולטרה סגול המשמש לצורך זיהוי שלו שאולי על התאים.

מכל הסיבות האלה, חיפשנו סמנים אחרים לא פולשנית המשויך קונפורמציה כרומטין SN או NSN יכול להחליף את השימוש Hoechst תוך שמירה על דיוק גבוהה סיווג אותו. התבוננות בצילום מואץ תנועה Cytoplasmic מהירויות (CMVs) מתגלה כמו תכונה ייחודית של מצב התא. לדוגמה, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו שהקשר בין CMVs להקליט בזמן ההפריה והיכולת של האדם מופרות של עכבר preimplantation מלאה, פיתוח מלא לטווח10,11.

בהתבסס על מחקרים אלה קודמות, נתאר כאן פלטפורמה עבור ההכרה של עכבר נכה כשיר או לא מוכשר oocytes לבגרות5,6,7,8. הפלטפורמה מבוססת על שלושה שלבים עיקריים: 1) Oocytes מבודד antral זקיקים מסווגים הראשון המבוסס על כרומטין בתצורה שלהם או של גרעינון מוקף (SN) או של גרעינון מוקף לא (NSN); 2) תמונות בצילום מואץ של CMVs המתרחשים במהלך המעבר GV-כדי-MII של כל יחיד oocyte נלקח וניתח עם חלקיקים תמונה velocimetry (PIV); ו- 3) נתונים שהושגו עם PIV מנותחים עם הזנה-קדימה מלאכותי עצבית רשת (FANN) עבור סיווג עיוור12,13. אנחנו נותנים פרטים על השלבים הקריטיים ביותר של ההליך מיועד העכבר שיהיה מוכן זמין להיות נבדק, המשמש עבור יונקים אחרים (למשל, שור, קופים, בני אדם).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכל ההליכים הכרוכים חיות אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים, שימוש ו ועדות אתיות ב אוניברסיטת פאביה. בעלי חיים היו נשמרים בתנאים של 22 מעלות צלזיוס, לחות האוויר 60% מחזור/כהה 12:12 h.

1. השחלה בידוד

  1. מזריקים intraperitoneally 2 4-ל-11 בת שבוע CD1 הנשי עכברים עם 10 U של זקיק מגרה הורמון עם מזרק אינסולין עקר 1 מ"ל.
  2. . אני לא. h 46-48
  3. שוקל את העכבר, עזים ומתנגד עם זריקה תוך שרירית של 50 מ"ג/ק"ג של Zoletil (cloridrate Tiletamina, Zolazepan). המתת חסד מאת נקע בצוואר הרחם.
  4. לתפוס את העור המכסה לקיר הבטן בעזרת זוג מלקחיים לנתיחה. לחתוך את העור ופתח לגוף החומה עם זוג מספריים ומשוך את החתך עם מלקחיים.
  5. בעזרת זוג מספריים, להעביר האומץ הצידה, לאתר את הקרניים הרחם לשפה השחלות ב ממעמדם.
  6. בעדינות להחזיק את השחלה בעזרת מלקחיים שען, להשתמש במספריים לחתוך רצועה שלה אל הרחם. חזור עם השחלה אחרים.
  7. העברת השחלות שנאספו לתוך התא 35 מ מ תרבות פטרי המכילות 1 מ"ל של M2 בידוד בינוני להתחמם מראש ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 באוויר.
  8. להסיר את השומן את oviduct באמצעות מספריים בסדר תחת stereomicroscope.

2. בידוד של מתחמי Oocyte תלולית

  1. לנקב פני השטח השחלות באמצעות פינצטה סטרילי, מחט סטרילית אינסולין 1G עד מתחמי oocyte antral cumulus (COCs) משתחררים פסיבי.
  2. לאסוף את COCs עם יותר משלוש שכבות של תאים cumulus באמצעות שבשליטת הפה משך ידו פסטר micropipette (200 מיקרומטר בקוטר) ולהעביר אותם לתוך טיפת 300 µL בינוני M2 טריים.
  3. להסיר את התאים cumulus המקיפים את oocytes באמצעות micropipette פסטר משך ידו (80 מיקרומטר בקוטר) על-ידי בעדינות pipetting שם במשך כמה שניות.
  4. שוב ושוב להעביר oocytes טיפה 20 µL של M2 בינוני עוד אחד, עד cumulus תאים בוטלו לחלוטין.

3. סיווג המבוסס על הארגון Oocyte כרומטין

  1. להכין פתרון מכתימים Hoechst 33342 ריכוז הסופי של µg/mL 0.05 ב- M2 בינונית החל מפתרון אמא של 5 מ"ג/מ"ל מדולל ב- 1 x PBS.
  2. במקום 3.5 µL מיקרו טיפות Hoechst מכתים פתרון בחלק התחתון של מכסה פטרי 35 מ מ.
  3. להעביר לכל oocyte יחיד לתוך Hoechst צביעת טיפה, למקם את המנה לצלחת חימום מראש ומחוממת (37 מעלות צלזיוס), לכסות את זה עם מכסה כהה כדי להימנע תערוכות אור.
  4. לאחר 10 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, לבחון את oocytes עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה X 10 תחת אור UV (330-385 ננומטר), עבור לא יותר מ- 1-2 s.
  5. כשידור oocytes גרעינון מוקף (SN) (איור 1 א'), אם הם מציגים טבעת של כרומטין Hoechst-חיוביות המקיפים את גרעינון.
  6. לסווג את oocytes כמו גרעינון לא מוקף (NSN), אם שלהם גרעינון שאינו מוקף Hoechst-חיוביות כרומטין ומעוררים מראה כתמים heterochromatic בתוך הגרעין (איור 1B).

4. סיווג Oocyte מבוססי-רשת עצבית

  1. להכין ארבעה µL 2, טיפות מדיום α-מ בתוספת 5% לא פעיל חום העובר שור סרום, 2 מ מגלוטמין, טאורין 5 מ מ, 100 U/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 75, נתרן µg/µL 23.5 פירובט לתוך כוס 35 מ מ בתחתית צלחת פטרי ולכסות אותם עם ומחוממת מראש (37 מעלות צלזיוס), שמן מינרלי equilibrated מראש כדי למנוע אידוי בינוני.
    הערה: אם משתמשים במערכת התא-הקרנה בשידור חי, לשמור על הטיפות במרחק מסוים באמצעות רשת מצוירות של 7 מ"מ x 7 מ"מ כקו מנחה.
  2. העברת 3 - 4 oocytes על כל טיפה.
  3. מקום בתחתית הכוס פטרי לתוך מערכת ההקרנה-תא חי, המצוידים בתוכנת הקלטה בצילום מואץ (ראה טבלה של חומרים), מה שמאפשר התבוננות oocyte ההבשלה בסביבה עם טמפרטורה יציבה (37 ° C) ו CO2 הריכוז (5%).
  4. פתח את תוכנת הצריבה זמן לשגות. על המסך מופיעה חלון עם שוט בשידור חי את oocyte, בצד שמאל, כל הלחצנים הגדרה בצד ימין.
  5. בחר מרכז oocyte כדי להציבו במרכז המסך. כוונן פוקוס במידת הצורך.
  6. בחר בלחצן ה-Ph והגדר את המנורה DIA 192; זמן החשיפה 1/125 s; רווח כדי 1.99; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.
  7. בחר FL2 ולהגדיר את המנורה DIA 5; זמן החשיפה 3 s; רווח כדי 2.37; את הרזולוציה כדי 1600 x 1200.
  8. בחר בלחצן הצבע החדשה כדי להקליט את מיקום oocyte בתוך הטיפה תרבות. חזור על שגרה זהה עבור כל oocyte בתוך הטיפה תרבות.
  9. בחר זמן ולהגדיר את רכישת מחזור 8 דקות , הזמן הכולל 15 h.
  10. בחר להתחיל בצילום מואץ להתחיל מחזור הקלטה.
  11. פתח את תוכנת MATLAB ולכתוב >>cell_piv; ולאחר מכן בחר את הכלי PIV.
  12. לבחור את התיקייה המכילה את הסרט המוקלט, בחר את כל הקבצים קבצי jpeg כדי לטעון את רצף התמונה כולה. עבור כל oocyte, בחר את האזור בעל עניין (ROI) על ידי לחיצה על בחר אזור הכלי.
  13. בחר תהליך PIV בתפריט קובץ. בחר בלחצן ' הכלי מציג .
    הערה: התוכנית יחשב את הווקטורים מהירות בתוך רועי ומייצרת באופן אוטומטי קובץ נתונים, לשמור כקובץ .mat.
  14. בחר את הקובץ .mat. בחר בלחצן ' ' רועי בחר כלי וצייר מעגל סביב קווי המתאר של oocyte. לחץ על שמור בתפריט קובץ.
    הערה: הווקטורים באזור זה מוצגים כעת, לעדכן את הנתונים מגניטודה רשע בחלון גרף עבור רועי החדש הזה.
  15. פתח הנתונים שנאספו הגודל הממוצע של המסגרות כל זמן לשגות הקליט לתוך גיליון אלקטרוני, עם, על השורות, הרצף מסגרת ועל, העמודות, oocyte יחיד לכל מנותח.
  16. לארגן את הנתונים של oocytes NSN וגם SN תת-קבוצות 10.
  17. השתמש תת-קבוצות 9 כדי לאמן את רשת עצבית מלאכותית הזנה-קדימה iteratively (FANN) ולקבוצת המשנה 1 בדיקה עיוורת.
    1. אני חוזר עוד 9 פעמים, שינוי המדגם בדיקה עיוורת (10-fold קרוס-אימות).
  18. MATLAB, להריץ את הסקריפט מחוייט הראשי ופתוח, על פי בקשה, להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הדרכה (train.txt), מספר oocytes NSN וגם SN המשמש את מרווח זמן לשגות והדרכה כדי להיות מנותח (בדרך כלל, מתוך מסגרת מס ' 1-2 להפליל # 112-113).
  19. לחץ על הזן כדי לבצע את האימונים.
  20. להוסיף את השם של הקובץ עם הנתונים הבדיקה (test.txt).
  21. פתח את וקטור test_outputs_cyt בסביבת MATLAB.
    הערה: חלון מופיעה על המסך מציג, בשורה הראשונה, ההסתברות להשיג אמת תוצאות חיוביות (TP או נכון NSN) חיוביות שגויות (FP או כוזב NSN) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה; במקום זאת, בשורה השניה, ההסתברות לקבל שווא שליליות (FN או SN שווא). ותשלילים אמיתי (TN או SN נכון) עבור oocytes NSN וגם SN, בהתאמה.
  22. להשתמש בנוסחה: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), כדי לחשב את רמת הדיוק של FANN, מבוטא באחוזים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 2 מציג נציג התפתחותי מוסמך ולא יוצלח oocyte, בהתאמה בהתחלה (GV) ובסופו של דבר (MII) של ההליך IVM. IVM של העכבר לבגרות oocytes מתרחשת במהלך 15 h תרבות. התצפית זמן לשגות מתעדת את ההתקדמות של מיוזה ומזהה האירועים meiotic הגדולים, כולל GVBD את ההבלטה של הגוף הקוטב הראשון.

ניתוח והשוואה בין יותר מ 200 - נכה המוסמכת נ' oocytes כשירים הראו הבדלי הזמן ההתקדמות של מיוזה. באופן ספציפי, ב- NSN oo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם מספר שלבים קריטיים אחד אמור לטפל תוך כדי ביצוע פרוטוקול זה עם העכבר oocytes, כמו גם עם אלה של מינים אחרים. ברגע מבודד זקיקים שלהם, oocytes מיד יועברו לתוך הטיפות הקלטה, כמו פרידה תלולית לוויה תאים המפעילים תחילת המעבר GV-כדי-MII. שינוי אפשרי בפרוטוקול הנוכחי יכול להיות התוספת של 3-איזובוטיל-1-methylxanthine (IBMX) למדיום M2 המשמש לבידוד COCs. IBMX מונעת את מפעילה מיידית של המעבר GV-כדי-MII ומאפשרת סנכרון של הקבוצה כל ניסיוני של oocytes.

מערכת ההקרנה-תא חי שימוש בניסויים שלנו (ראה ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נעשתה התאפשרה הודות לתמיכה על ידי: אוניברסיטת פאביה FRG 2016; האוניברסיטה של פארמה FIL 2014, 2016; Kinesis לאספקת plasticware את הצורך לבצע את המחקר הזה. אנו מודים ד"ר שיין וינדזור (הפקולטה להנדסה, אוניברסיטת בריסטול, אנגליה) למתן את התוכנה Cell_PIV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פוליגוןאינטרבטA201A02טיפול הורמונלי
הוכסט 33342 Sigma-AldrichB2261לצביעת ביצית הטרוכרומטין
תרבית תאים Petri-dish 35 מ"מ x 10 מ"מ קורנינג 430165לבידוד COCs
EmbryoMax M2 בינוני (1X), נוזלי, עם פנול אדוםMerck-MilliporeMR-015-Dלבידוד COCs
MEM אלפא בינוני (1X) + גלוטמקס סיגמא-אולדריץ'M4526להבשלת ביצית במבחנה
תרבית תאים פטרי צלחת 35 מ"מ תחתית זכוכית וילקו GWSt-3522לניסויי הדמיה
BioStation IM-LM מערכת סינון תאים חייםשל NikonMFA91001
פסטר פיפטהDelchimica Scientific Glassware6709230למניפולציה של זקיקים
שמן מינרליSigma-AldrichM8410למניעת זיהום ואידוי בינוני
פניצילין / סטרפטומיציןLife Technologies15070063למניעת זיהום בינוני 
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma-AldrichML16141079לאיפור ואלפא; MEM בינוני 
ל-גלוטמין Life Technologies25030לאיפור ואלפא; MEM בינוני 
טאוריןסיגמא-אולדריץ'T0625לאיפור ואלפא; MEM בינוני 
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA3310לאיפור ואלפא; מדיה MEM
נתרן פירובט  סיגמא-אולדריץ'  P4562לאיפור ואלפא; MEM מדיה
Zoletil (Tiletamina ו- Zolazepan cloridrate)Virbac SrlQN01AX9לעכברים הרדמה
Cell_PIV sofware נמסר באדיבות על ידי ד"ר שיין וינדזור, אוניברסיטת בריסטול, בריטניה                             -                             -
MATLABThe MathWorks, Natick, MA                              -לחישוב מספרי רב-פרדיגמות
 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. Molecular methods for selection of the ideal oocyte. Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).
  2. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).
  3. Tan, J. H., et al. Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes. Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).
  4. Vigone, G., et al. Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes. BMC Genomics. 14, 380(2013).
  5. Bui, T. T., et al. Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption. Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).
  6. Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organization during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).
  7. Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes. Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).
  8. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg? Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  9. Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice. Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).
  10. Ajduk, A., et al. Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability. Nat. Commun. 2, 417(2011).
  11. Swann, K., et al. Phospholipase C-ζ-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).
  12. Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer. Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).
  13. Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review. Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse OocytesCytoplasmic Movement VelocitiesTime Lapse ImagingParticle Image VelocimetryFeed Forward Neural NetworkGerminal VesicleMetaphase IIOocyte IsolationHoechst StainingDevelopmental Competence

Related Articles