מאמר שיטה

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

DOI:

10.3791/56688

⸱

14 בדצמבר 2017

 , 
1Laboratory of Brain and Neurological Disorders, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 2Laboratory of Neuropathology and Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוטציות בגן עשיר לאוצין קינאז חוזר 2 (LRRK2) הוכחו להיות מקושר עם משפחתית מחלת פרקינסון (FPD). מאז הפעלת נורמלית של פעילות קינאז LRRK2 היה מעורב בפתוגנזה של המשטרה, זה חיוני להקים שיטה להעריך את רמות פיזיולוגיים של פעילות קינאז LRRK2. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי LRRK2 phosphorylates בני משפחת ראב GTPase, כולל Rab10, בתנאים פיזיולוגיים. למרות זירחון של Rab10 אנדוגני מאת LRRK2 בתאים בתרבית יכול להתגלות על ידי ספקטרומטר מסה, זה היה קשה לזהות את זה על-ידי immunoblotting עקב הרגישות המסכן של נוגדנים ספציפיים זרחון זמין כעת עבור Rab10. כאן, אנו מתארים פשוט שיטת זיהוי הרמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי LRRK2 בהתבסס על immunoblotting ניצול נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) בשילוב עם תג מחייב פוספט (P-תג), אשר הוא N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) -N,N',N'- טריס (pyridin-2-yl-מתיל) - 1,3 - diaminopropan-2-ol. בפרוטוקול הנוכחי לא רק מספק דוגמה של המתודולוגיה ניצול P-התג אלא גם מאפשרת את ההערכה של מה מוטציות וכן מעכב טיפול/ניהול או כל גורמים אחרים לשנות באיתות במורד הזרם של LRRK2 ב תאים ורקמות .

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משטרת היא אחת ממחלות ניווניות הנפוץ ביותר, בעיקר משפיע על נוירונים דופאמין במוח התיכון, והתוצאה היא חוסר תפקוד של מערכות מנוע קשישים1. בעוד רוב החולים לפתח PD באופן סדיר, יש משפחות הורשת המחלה. מוטציות בגנים מספר נמצאו יקושרו עם FPD2. הוא אחד הגנים סיבתי עבור FPD LRRK2, שבו שמונה missense מוטציות (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S ו I2020T) קשורה FPD דומיננטית תורשתית בשם PARK8 כה דווח על3,4,5. מספר מחקרים הגנום כולו האגודה (GWAS) של חולי PD סדיר גם זיהו גנומית וריאציות על מיקומה LRRK2 כגורם סיכון עבור PD, רומז ליקוי בפונקציה של LRRK2 הוא גורם נפוץ הקשורים ניוון מוחיים בשתי סדיר ו PARK8 FPD6,7,8.

LRRK2 הוא חלבון גדול (חומצות אמינו 2,527) בהיקף של תחום אני חוזר לאוצין-עשיר, הראס GTP-איגוד של חלבונים מורכבים (ROC) תחום, C-מסוף של תחום ROC (קור), תחום סרין/תראונין פרוטאין קינאז, תחום אני חוזר WD409. מוטציות FPD שמונה לאתר בתחומים פונקציונליים אלה; N1437H, R1441C/G/H/S בתחום ROC, Y1699C בתחום קור, G2019S ו- I2020T בתחום קינאז. מאז מוטציה G2019S, אשר נמצא לעתים קרובות ביותר מוטציה ב- PD חולים10,11,12, מגביר את פעילות קינאז LRRK2 על ידי קיפול במבחנה2-313, זה המשוערות כי העלייה חריג זירחון של LRRK2 substrate(s) רעיל נוירונים. עם זאת, זה כבר בלתי אפשרי ללמוד אם זירחון של סובסטרטים LRRK2 רלוונטי מבחינה פיזיולוגית היא שונה בחולים PD משפחתית/סדיר עקב המחסור של שיטות להערכת זה בדגימות נגזר החולה.

זירחון חלבונים מזוהה בדרך כלל על-ידי immunoblotting או מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) באמצעות נוגדנים במיוחד להכרת המדינה phosphorylated של חלבונים, או על ידי ניתוח המוני spectrometric. עם זאת, האסטרטגיה לשעבר לפעמים אין אפשרות להחיל בשל הקשיים ביצירת נוגדנים ספציפיים זירחון. תיוג מטבולית של תאים עם פוספט רדיואקטיבי הוא אפשרות נוספת לבחון רמות פיזיולוגיים של זרחון נוגדנים ספציפיים זרחון אינם זמינים. עם זאת, הוא דורש כמות גדולה של חומרים רדיואקטיביים, ולכן כרוך איזה ציוד מיוחד עבור המכון להגנת14. ניתוח spectrometric המוני הוא רגיש יותר לעומת שיטות immunochemical אלה והפך פופולרי בניתוח זירחון חלבונים. עם זאת, הכנת הדוגמא היא גוזלת זמן, כלי נגינה יקר נדרשים לניתוח.

תת-קבוצה של משפחת ראב GTPase כולל Rab10 ו- Rab8 דווח לאחרונה סובסטרטים פיזיולוגיים ישירים עבור LRRK2 בהתבסס על התוצאה של ניתוח phosphoproteomic בקנה מידה גדול15. אנחנו מכן הפגינו זרחון Rab10 הוגדל על ידי מוטציות FPD fibroblasts עובריים בעכבר, הריאות של knockin עכברים16. בדו ח זה, בחרנו להעסיק נתרן dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד)-המבוסס על שיטת שבו מולקולה P-תג הוא שותף polymerized לתוך ג'לים מרחביות-דף (P-תג מרחביות-עמוד) לגילוי הרמות אנדוגני של זרחון Rab10, כי נוגדן רגישה מאוד ספציפיות עבור phosphorylated Rab10 היה עדיין חסר. אנחנו נכשלנו לזהות זירחון של Rab8 אנדוגני בשל מידת הבררנות המסכן של נוגדנים זמין כעת עבור Rab8 סה לכן, החלטנו להתמקד זירחון Rab10. LRRK2 phosphorylates Rab10 ב Thr73 באיתור באמצע של אזור מאוד שנשמרת "להחליף II". גבוהה שימור האתרים זרחון בין חלבונים רב יכול להיות אחת הסיבות למה קשה לעשות נוגדנים phosphospecific זיהוי חלבונים ראב ברורים.

זירחון של Rab8A על ידי LRRK2 מעכב את הכריכה של Rabin8, גואנין נוקלאוטיד exchange גורם (בתאוריה) אשר מפעילה Rab8A על ידי החלפת התל מאוגד עם GTP15. זירחון של Rab10 ו- Rab8A על ידי LRRK2 מעכב גם את הכריכה של מעכבי התמ ג-דיסוציאציה (GDIs), המהווה מרכיב חיוני להפעלת ראב חלבונים על-ידי חילוץ התמ ג מכורך ראב חלבונים ממברנות15. באופן קולקטיבי, זה זה שיערו כי זירחון של ראב חלבונים על ידי LRRK2 מונעת מהם ההפעלה למרות המנגנון המולקולרי המדויק ואת ההשלכות הפיזיולוגיות של זירחון אינן ברורות.

P-תג מרחביות-דף שהומצאה על ידי קינוסיטה. et al. 2006: בשיטה זו, אקרילאמיד covalently תמיד עם P-תג, מולקולה לכידת פוספטים עם זיקה גבוהה, אשר copolymerized לתוך מרחביות-דף ג ' לים-17. כי המולקולות P-תג של ג'ל מרחביות-דף מפגר באופן סלקטיבי electrophoretic ניידות של חלבונים phosphorylated, P-תג מרחביות-דף יכול להפריד חלבונים phosphorylated אלה שאינם phosphorylated (איור 1). אם החלבון-של-העניין הוא phosphorylated על משקעים מרובים, יתקיימו סולם של להקות המתאים טפסים באופן שונה phosphorylated. במקרה של Rab10, אנו מבחינים הלהקה שהוסטו אחד בלבד, המציין כי Rab10 הוא phosphorylated רק ב Thr73. היתרון העיקרי של P-תג מרחביות-דף מעל immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים זרחון הוא כי ניתן להבחין phosphorylated Rab10 באמצעות immunoblotting עם נוגדנים לא זרחון-ספציפית (קרי, בזיהוי Rab10 סה) לאחר שהועבר על ממברנות, אשר בדרך כלל יותר ספציפיים, רגיש ו זמין ממקורות מסחריים/אקדמית. יתרון נוסף של השימוש P-תג מרחביות-דף זה כי הוא יכול להשיג אומדן משוער סטויכיומטריה של זרחון, שזה בלתי אפשרי immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים זרחון או על ידי תיוג מטבולית של תאים עם רדיואקטיבי פוספטים.

מלבד השימוש אקרילאמיד P-תג יקר כמה שינויים מזעריים הקשורות אליו, השיטה נוכח גילוי של זרחון Rab10 על ידי LRRK2 כדלקמן פרוטוקול הכללי של immunoblotting.לכן, זה צריך להיות ישירה בקלות הפעלה במעבדות כל איפה immunoblotting אימון כרגיל, עם כל סוגי דגימות כולל חלבונים מטוהרים, lysates תא של רקמת homogenates.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מדגם הכנה מרחביות – העמוד P-תג

  1. להסיר, למחוק את המדיה של 10 ס מ מנות שבו תאים גדלים באמצעות יניקה לשטוף תאים עם באגירה פוספט תמיסת מלח 5 מ"ל Dulbecco (DPBS) על ידי DPBS הוספת הראשון לצד של הכלים כדי שלא להפריע למטופלים את שכבת תאים ואני רוק באופן ידני את הכלים בחזרה הלאה וכמה פעמים.
  2. להסיר, למחוק את DPBS באמצעות יניקה להוסיף 2 מ של 0.25% (w/v) טריפסין מעורבבת עם DPBS ו רוק בעדינות את הכלים כדי לכסות את שכבת תאים. מכניסים את הכלים CO2 מיכלים (37 ° C, humidified אוויר, 5% CO2) במשך 5 דקות.
  3. לאחר pipetting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה חד פעמיות לשבור את התאים מנותקת, לאסוף את התליה תא לתוך צינור 15 מ"ל ולמדוד את צפיפות התאים באמצעות hematocytometer תחת מיקרוסקופ18.
  4. לדלל את התאים כדי 2.5 × 105 תאים למ"ל בינונית נשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v/v) העובר סרום שור (FBS), פניצילין U/mL 100 ו- 100 סטרפטומיצין µg/mL. להוסיף 2 מ ל (5 × 105 תאים) של התליה תא מדולל כל טוב של לוחות 6-. טוב.
  5. לגדל את התאים לילה ב- CO2 מיכלים (37 ° C, humidified אוויר, 5% CO2).
  6. תרביות תאים לתאים HEK293
    הערה: אם זירחון של Rab10 אנדוגני להיבדק, להמשיך לצעוד 1.7. פלסמידים המשמשים פרוטוקול זה ניתן לקבל מן המחברים על פי בקשה. ראה טבלה של חומרים עבור מידע קצר, איור S1 עבור הדנ א שלהם רצף.
    1. Aliquot µL 200 של DMEM לתוך צינורות 1.5 mL.
    2. כדי כל שפופרת, להוסיף שתי µg 0.266 (הריכוז הסופי של 1.33 µg/mL) של פלסמיד קידוד HA-Rab10 ו µg 1.066 (הריכוז הסופי של 5.33 מטרים µg/mL) של פלסמיד קידוד 3 × LRRK2 הדגל של 500 מניות פלסמיד µg/mL. לאחר מכן להוסיף 4 µL של 1 מ"ג/מ"ל תמיסת polyethyleneimine (מומס 20 מ מ HEPES-NaOH, pH 7.0) ומערבבים מיד את הפתרון על ידי vortexing על 5 s.
    3. תן הצינורות לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולהוסיף את תכולת שפופרת אחת dropwise לשימוש אחד טוב של micropipette. בעדינות באופן ידני רוק הלוחות תרבות ואחורה מספר פעמים כדי שהתערובת תרביות תאים מפוזר באופן שווה לאורך כל הבאר.
  7. תן את התאים גדלים עבור עוד 24-36 h ב- CO2 מיכלים (37 ° C, humidified אוויר, 5% CO2).
  8. אם זירחון של Rab10 אנדוגני להיבדק, יטפל בתאים עם ובלי LRRK2 מעכבי לשעה לפני lysing תאים.
    1. להכין מלאי פתרונות של מעכבי LRRK2 על ידי המסת את מעכבי ב דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-10 מ מ. אנו ממליצים להשתמש MLi-2 ו- GSK2578215A, שהינם מעכבי LRRK2 ספציפיים מאוד, חזק. פתרונות מלאי החנות ב-80 מעלות צלזיוס.
    2. להכין עבודה מניות של מעכבי על ידי דילול מניות הפתרונות עם דימתיל סולפוקסיד: MLi 2, להתכונן 10 מיקרומטר ו- 30 מיקרומטר אנדוגני, overexpressed LRRK2, בהתאמה. עבור GSK2578215A, להכין 1 מ 3 מ מ עבור אנדוגני, overexpressed LRRK2, בהתאמה.
    3. להוסיף 2 µL של המניות לעבוד MLi-2 או GSK2578215A לאמצע אחד טוב באמצעות micropipette ו בעדינות סלע את הצלחת באופן ידני ואחורה מספר פעמים כדי לאפשר את מעכבי מפוזר באופן שווה לאורך כל הבאר.
    4. להוסיף 2 µL של דימתיל סולפוקסיד באר אחרת כפקד שלילי באופן דומה לחומר המדכא בשלב 1.8.3.
    5. ! תחזירו את הצלחות בחזרה אל החממה, התרבות התאים לשעה.
  9. Lyse התאים.
    1. לשים את הצלחות תרבות על קרח. להסיר ולמחוק את התקשורת. לשטוף את התאים על ידי הראשון mL 2 הוספת DPBS לצד של הכלים כדי שלא להפריע למטופלים התא שכבה ו סלע באופן ידני את הכלים ואחורה מספר פעמים.
    2. להסיר, למחוק את DPBS, ולהוסיף µL תאים 100 המאגר פירוק (50 מ מ טריס-HCl pH 7.5, 1% (v/v) אתר polyoxyethylene(10)-octylphenyl, 1 מ"מ EGTA (אתילן גליקול-bis(2-aminoethylether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic), orthovanadate נתרן 1 מ מ, 50 מ מ נתרן פלואוריד, 10 מ מ β-glycerophosphate, 5 מ מ נתרן רב-תכליתי, 0.1 µg/mL microcystin-LR, סוכרוז 270 מ מ, מעכב פרוטאז קוקטייל).
    3. להטות את הצלחות על קרח, לגרד את התאים באמצעות המגרד של התא כדי לאסוף כמה שיותר תא lysate ככל האפשר. לאסוף את lysates באמצעות micropipette לתוך צינורות 1.5 mL (טרום מקורר על הקרח).
      התראה: Microcystin-LR יכולה להיות קטלנית אם נבלע או במגע עם העור.
  10. תן הצינורות לעמוד על קרח למשך 10 דקות על פירוק השלם. להבהיר את lysates התא על ידי צנטריפוגה (20,000 × g, 10 דקות ב 4 ° C) ולהעביר את supernatants חדש צינורות 1.5 mL טרום מקורר על קרח.
  11. למדוד ריכוז חלבון (µg/µL) lysates שנוקה על ידי שיטת ברדפורד.
    1. להכין שור אלבומין (BSA) סטנדרטים (0.2 0.4, 0.6, 0.8, 1 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול הפתרון מניות עם מים מזוקקים. לדלל את התא lysates על ידי 20-fold עם מים מזוקקים.
    2. לשים 5 µL היטב את הסטנדרטים BSA, ריק (מים מזוקקים), וכל אחד מדולל תא lysate לתוך צלחת 96-ובכן כן.
    3. להוסיף 150 µL טוב מהתרכובת assay ברדפורד באמצעות 12-ערוץ micropipette ותנו את הצלחת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    4. למדוד את ספיגת-595 nm על הקורא צלחת עם השוואה לסטנדרטים BSA.
  12. היכונו µL 100 דגימות מרחביות-דף. ריכוז החלבון של הדגימות הוא µg 1/µL עבור overexpressed HA-Rab10 2 µg/µL עבור Rab10 אנדוגני.
    1. באמצעות ריכוז כימות מהשלב 1.11.4, לחשב את עוצמת הקול (µL) את lysates תא שקול ל- 100 µg (HA overexpressed-Rab10) או µg 200 (Rab10 אנדוגני) על-ידי חלוקת הסכום חלבון (100 µg או 200 µg) על-ידי ריכוז חלבון lysates (ממוצע g/µL).
    2. להוסיף 25 µL של 4 × Laemmli מרחביות-דף לדוגמה מאגר (62.5 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8, 8% (w/v) מרחביות, 40% (v/v) גליצרול, כחול bromophenol 0.02% (w/v), 4% (v/v) β-mercaptoethanol) צינורות 1.5 mL החדש המשיך בטמפרטורת החדר.
    3. הוסף את הנפח מחושב של התא lysates לכל צינור ומערבבים על ידי vortexing על 5 s בטמפרטורת החדר.
    4. להביא את הנפח הכולל 100 µL עם פירוק מאגר, מיקס על ידי vortexing על 5 s בטמפרטורת החדר.
  13. תוספת עם 10 מ מ MnCl2 כדי להרוות את מכלט. להוסיף 1 µL של 500 מ מ MnCl2. מיקס על ידי vortexing על 5 s בטמפרטורת החדר.
    הערה: ייתכן דגימות המכיל MnCl2 לא להיות מתאים מרחביות רגיל-דף.
השלב זה נדרש בשל נוכחותם של מכלט (כגון חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), EGTA, וכו) במאגר של פירוק. אחרת, Mn2 + יונים מצמידים P-תג אקרילאמיד להיות חלופה מועדפת על ידי הסוכנים chelating, P-תג מרחביות-דף לא תפעל כראוי.
  • להרתיח כל דוגמאות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחסן את הדוגמאות להלן-20 ° C עד השימוש. ניתן לאחסן את הדגימות מבושל עד 6 חודשים לפחות.

    • 2. יציקה ג'לים P-תג מרחביות – דף

    הערה: ג'לים צריכה להיעשות באותו יום כמו של משטחים. ג'לים יכולים להתבצע בתנאים אור מקיף.

    1. להכין 5 מ מ P-תג אקרילאמיד מניות פתרון על ידי המסת הראשון 10 מ ג של אבקת/מלא P-תג אקרילאמיד לחלוטין עם µL 100 של מתנול, ואז להביא עד 3.3 מ"ל על-ידי הוספת מים מזוקקים כפול.
      הערה: P-תג אקרילאמיד הוא רגיש אור. יש לאחסן את הפתרון מוכן בחושך ב 4 ° C עד השימוש.
    2. צלחות נקי רגיל והן מחורץ על ידי ריסוס אתנול 70% ו לקנח עם מגבת נייר. להרכיב את הצלחות ג'ל. הממדים של הלוחות ג'ל בשימוש פרוטוקול מסוים זה הם 80 או 100 מ מ ארוך על ידי 100 מ מ רחב. מפרידי סיליקון נקי מוכנסים בין רגיל, לוחות מחורצים עם הלוחיות שהורכב כשכרטיס עם קלסר קליפים.
      הערה: כל סוג של צלחות ג'ל הפועלים למען חברה דמוקרטית רגיל-דף ניתן להשתמש.
    3. לשים מסרק להיות בשימוש (מסרק הפלסטיק. ובכן 17) לתוך צלחות ג'ל שהורכבו ו מארק בצלחת ג'ל המיקום של החלק התחתון של הבארות עם סמן קבוע.
    4. הכינו 10 מ"ל של 10% אקרילאמיד ג'ל תערובת (10% (w/v) אקרילאמיד (acrylamide:bis-אקרילאמיד = 29:1), 375 מ"מ טריס-HCl (pH 8.8), 0.1% (w/v) מרחביות) בשפופרת 15 מ"ל.
      הערה: ריכוז אופטימלי של אקרילאמיד עשוי להשתנות בהתאם ריאגנטים בשימוש. Persulfate Tetramethylethylenediamine (TEMED), אמוניום (APS) לא להוסיף בשלב זה.
    5. להוסיף 100 µL של אקרילאמיד P-תג 5 מ מ ו- µL 10 של 1 מ' MnCl2 פתרונות בריכוזים הסופי של 50 מיקרומטר ו 100 מיקרומטר, בהתאמה.
      הערה: ריכוז אופטימלי של אקרילאמיד תג P ו- MnCl2 יכול גם להשתנות בהתאם ריאגנטים בשימוש.
    6. להוסיף 15 µL של TEMED לתערובת ג'ל-ריכוז סופי של 0.15% (v/v) ולאחר מכן 50 µL של 10% (w/v) APS-ריכוז סופי של 0.05% (w/v). מערבבים היטב על ידי בעדינות מתערבל הצינור עבור 5 s ו לשפוך לתוך הלוחות מורכבים באופן מיידי עד לגובה זה 2 מ מ מתחת המיקום מסומן בשלב 2.3.
    7. בעדינות שכבה 2-פרופנול אל הפתרון ג'ל כדי לשטח את החלק העליון של הפרדת מוצקים.
    8. תן את ג'לים לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. . זה לא הכרחי להגן על ג'לים מפני אור.
      הערה: ייתכן שיידרשו ג'לים להגדיר תחת קר בטמפרטורת החדר מעט יותר זמן. Degassing את התערובת ג'ל לפני הוספת TEMED ו APS מסייעת להאיץ את שלב זה. למטרה זו, ניתן להכין לתערובת ג'ל בבקבוקון Erlenmeyer 100-200 מ"ל מחובר יניקה. דגה הפתרון עבור 10 דקות.
    9. הסר את 2-פרופנול שכבתית ע י קליטת עם מגבת נייר.
    10. לשטוף את החלל העליון היחסי של ג'ל על ידי ממלא את החלל עם מים מזוקקים מבקבוק שטיפת ולמחוק את המים על ידי שנוטפת לאגן. חזור על נטילת 3 פעמים.
    11. להסיר שאריות מים שנותרו בחלל העליון היחסי של ג'ל על ידי קליטת עם מגבת נייר.
    12. להכין 3 מ"ל של 4% אקרילאמיד ג'ל תערובת (4% (w/v) אקרילאמיד (ת crylamide:bis-אקרילאמיד = 29:1), 125 מ מ טריס-HCl (pH 6.8), 0.1% (w/v) מרחביות) צינור 15 מ"ל.
      הערה: לא להוסיף תג P אקרילאמיד או MnCl2 פתרון לתערובת ג'ל הערימה.
    13. להוסיף 7.5 µL של TEMED ו- µL 24 של 10% (w/v) APS בריכוזים הסופי של 0.25% (v/v) ו 0.08% (w/v), בהתאמה. מערבבים היטב על ידי בעדינות מתערבל הצינור עבור 5 s ולשפוך התערובת על גבי הג'ל ההפרדה. מיד לשים מסרקים המתאים (מסרק פלסטיק 17-ובכן להכיל עד 25 µL של דגימות, לדוגמה).
    14. תן את ג'לים לעמוד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. . זה לא הכרחי להגן על ג'לים מפני אור. לאחר ג'לים לערום הגדר, להפעיל אותם ללא אחסון נוסף.

    3. מרחביות – דף ו- Immunoblotting

    1. הסר את המסרקים ג'לים. ואז להסיר את הסיליקון מפרידי ולאחר מכן קליפים ג'לים.
    2. מכניסים את ג'לים casted ג'ל טנקים ולתקן את הג'ל למיכל על ידי מחבר חובק למעקה עם הקליפים בינדר.
    3. שופכים את המאגר המצטבר (25 מ"מ. טריס, 192 מ"מ גליצין, 0.1% (w/v) מרחביות) בחלק התחתון העליון היחסי של ג'ל. וולס נקי על ידי שטיפה המאגר פועל באמצעות מזרק 5 מ ל מחט 21G כדי להסיר חתיכות ג'ל.
    4. להסיר בועות אוויר מן החלל התחתון היחסי של ג'ל באמצעות מחט כפוף המצורפת מזרק. כדי להפוך את מחט כפוף, באופן ידני לכופף מחט 21G באמצע המחט כך הזווית בין הטיפ הבסיס של המחט הופכת 30-45 מעלות.
    5. ספין למטה פוחת משקעים הנגרמת על ידי התוספת של MnCl2 ב g × 20,000 עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבל דוגמאות ברורות.
    6. לטעון 10 חלבונים µg לגילוי זירחון של overexpressed Rab10 וחלבונים µg 30 עבור Rab10 אנדוגני.
      הערה: חיוני כדי לטעון את נפח שווה של דגימות בבארות כל. מסלולים ריקים ייטען באמצעות מאגר מדגם של Laemmli × 1 עמודים מרחביות. אם הדגימות מכילים MnCl2, להוסיף הדגימות דמה ריכוז זהה של MnCl2 .
    7. ובכן טעון עם סמן משקל מולקולרי (MWM) גם יש להשלימה באמצעות מאגר דגימה של 1 × Laemmli מרחביות-דף אז הנפח של דגימות טעון הוא זהה בבארות כל.
      הערה: שוב, אם הדגימות מכילים MnCl2, להוסיף ריכוז זהה של MnCl2 MWM. לחלופין, ניתן להשתמש MWM נטולת EDTA.
    8. הפעל ג'לים 50 V עבור סידור בערימה (כ- 30 דקות) עד לחזית לצבוע חוצה את הג'ל ההפרדה.
    9. לאחר הדגימות מחסנית, לשנות את המתח ל 120 V להפרדה עד לחזית צבע מגיע לתחתית היחסי של ג'ל (מינימום כ 50 ו 80 על 80 ו 100 ממ זמן רב ג'ל, בהתאמה).
      הערה: דפוס ההעברה של MWM צפוי להיות שונה מזו על ג'לים מרחביות-דף רגיל. זה לא צריך לשמש עבור הערכת משקל מולקולרי של חלבונים על P-תג מרחביות-דף ג'לים אבל יכול לשמש כדי לבדוק את הפארמצבטית של ג'ל P-תג. עיין בדיון לפרטים.
    10. לשטוף את ג'לים להסיר את MnCl2 ג'ל.
      1. יוצקים העברת מאגר (48 מ"מ טריס, 39 מ מ. גליצין, 20% (v/v) מתנול) המכילה EDTA 10 מ ל- 0.05% (w/v) מרחביות לתוך מכולה (למשל, גדול במשקל של סירות).
    היקף המאגר צריך להיות מספיק לכסות את ג'ל.
  • הסר את ההפרדה ג'לים הלוחות ג'ל ולשים ג'ל אחד בגורם אחד. למחוק את הג'ל הערימה.
  • להשאיר את ג'לים מטרף נדנדה (~ 60 סל ד) 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  • חזור על השלבים שטיפת סה כ 3 פעמים.
    הערה: השתמש מאגר טריים עבור כל כביסה.
  • לשטוף את ג'ל פעם במשך 10 דקות עם מאגר העברה המכילה 0.05% (w/v) מרחביות להסיר EDTA. היקף המאגר צריך להיות מספיק לכסות את ג'ל.
  • אלקטרו-העברת ממברנות difluoride (PVDF) ניטרוצלולוזה או polyvinylidene באמצעות טנקים רטוב.
    1. מניחים נייר סינון (10x7 ס מ) על משטח ספוג להעברה. להניח את הג'ל על נייר הסינון. ודא כי ישנם אין בועות אוויר בין נייר הסינון הג'ל.
    2. לשים הג'ל קרום (10x7 ס מ) וודא כי ישנם אין בועות אוויר בין הג'ל הקרום.
    3. לשים נייר סינון נוסף (10x7 ס מ) על הקרום, שוב, לוודא שאין אין בועות אוויר בין הקרום נייר הסינון.
    4. לשים עוד כרית ספוג על נייר הסינון. הכניסו ערימת הניירות ממברנה/סינון קלטת להעברה.
    5. לשים את הקלטת לתוך טנק העברה, מוודא כי הקרום ממוקם בין הג'ל האנודה הטעון חיובית.
    6. להתחבר הטנק ספק כוח, בקופסא הטנק styrene קצף מלא במים קפואים. התחל העברה ב- 100 וולט למשך 180 דקות.
      הערה: העברה ממושכת הכרחי, מאחר שההעברה של חלבונים P-תג מרחביות-דף ג לא יעיל כמו זה של ג'לים מרחביות-דף רגיל. קירור יעיל הוא חיוני כדי למנוע התכה ג'לים במהלך ההעברה.
  • בדוק את ההעברה
    1. הסר את הממברנות ג'לים באמצעות פינצטה ומשרים את הקרומים בפתרון צבע מאכל פונסו S (0.1% (w/v) צבע מאכל פונסו S, חומצה אצטית 5% (v/v)) כתם חלבונים שהועברו על הממברנות במיכל פלסטיק. הנפח של הפתרון צריך להיות מספיק לכסות את קרום.
    2. דגירה של ממברנות 1 דקות בטמפרטורת החדר במוזיקת באופן ידני.
      הערה: סולם של להקות צריך להיות גלוי כל ליין.
    3. להרים את הקרום הפתרון מכתימים עם פינצטה ולראות אם הסולם של להקות יש דפוס אחיד ועוצמה מכל סמטה היכן הדגימות שנטענו.
    4. לאחר בדיקת ההכתמה, להסיר את הפתרון מכתימים ולהוסיף TBST מאגר (20 מ מ טריס-HCl pH 7.4, 150 מ מ NaCl, 0.1% (v/v) polyoxyethylenesorbitan monolaurate). היקף המאגר צריך להיות מספיק לכסות את קרום.
      הערה: הפתרון S צבע מאכל פונסו אפשר לאסוף, מחדש נעשה שימוש מספר פעמים.
    5. לנענע את ריריות TBST על מטרף נדנדה (~ 60 סל ד) בטמפרטורת החדר עד להקות גלוי להישאר על הממברנות.
    6. חזור על השלב כביסה עם TBST טריים במשך 5 דקות.
  • להסיר ולמחוק את TBST. חסום על-ידי הוספת חלב רזה 5% (w/v) מומס TBST, נדנדה על מטרף (~ 60 סל ד) לשעה בטמפרטורת החדר. הנפח של הפתרון חסימה צריך להיות מספיק לכסות את קרום.
  • להכין נוגדן ראשוני פתרונות על ידי דילול נוגדנים הראשי (נוגדן anti-Rab10 עבור Rab10 אנדוגני) ונוגדן anti-HA עבור overexpressed HA-Rab10 ב- 10 מ"ל לכל ממברנה של הפתרון חסימה (ראו טבלה של חומרים ריכוזים).
  • להסיר, למחוק את הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן ראשוני. דגירה על הממברנות על מטרף נדנדה (~ 60 סל ד) בן לילה ב 4 º C.
  • להסיר את הפתרון נוגדן ראשוני ולהוסיף TBST לרחוץ את הקרומים. היקף המאגר צריך להיות מספיק לכסות את קרום.
  • דגירה של ממברנות 5 דקות על מטרף נדנדה (~ 60 סל ד) בטמפרטורת החדר. חזור על כביסה (שלב 3.16) סה כ 3 פעמים באמצעות TBST טריים בכל פעם.
  • להכין נוגדן משני פתרונות על ידי נוגדנים משניים המדללת עם חזרת peroxidase (HRP) תוויות ב 10 מ"ל לכל ממברנה של הפתרון חסימה. השתמש נוגדנים IgG נגד הארנב המסומנת HRP לממברנות שנבדק עם נוגדן anti-Rab10, העכבר אנטי איג נוגדן המסומנת HRP לאלו שנבדק עם מלחמה-HA נוגדנים (ראו טבלה של חומרים ריכוז).
  • להסיר, למחוק את TBST לאחר לשטוף את השלישי ולהוסיף הפתרון נוגדנים משניים. דגירה על הממברנות על מטרף נדנדה (~ 60 סל ד) לשעה בטמפרטורת החדר.
  • לשטוף את הקרומים ב- TBST עבור 10 דקות חוזר לשטוף את שלב סה כ 3 פעמים, בדומה לשלב 3.17.
  • לפתח את הממברנות בעזרת chemiluminescence משופרת (ECL).
    הערה: זמן החשיפה עשוי להשתנות בהתאם הפתרון ECL המשמש לצורך זיהוי של chemiluminescence את המחשב.
    1. הפעל imager מצויד with a מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) והמחשב מחובר םלצה. הפעלת התוכנה הבקרה עבור הצלם. המתן עד הטמפרטורה של המצלמה CCD הגיעה--25 ° C.
    2. לשים 1 מ"ל של הפתרון ECL עבור ממברנה אחת ניילון נצמד על ספסל.
    3. לשים ג'ל ממברנה-צד-up על הפתרון ECL ולאחר מכן במהירות להפוך אותו כך שני הצדדים של הקרום הם מצופים הפתרון.
    4. לאסוף את הקרום וסוחטים בלתת צד אחד של המגע ממברנה מגבת נייר עבור 5 s.
    5. לשים קרום בין סרטים ברורה (למשל, כיסים נייר נקי).
      הערה: ניילון נצמד לא מומלץ עבור גלישת בקרום. הסרטים ברור המשמש עבור גלישת הקרום צריך להיות שטוח ככל האפשר ללא קמטים גלויים כדי להימנע רקע לא אחיד.
    6. מניחים את הקרום על מגש שחור. מכניסים את המגש םלצה וסגור את הדלת.
    7. לחץ על לחצן "התמקדות" חלון של תוכנת שליטה. בדוק כי הקרום ימוקם בצורה נכונה. לחץ על לחצן "להחזיר".
    8. בחר "דיוק" עבור "סוג חשיפה". בחר "ידני" עבור "זמן חשיפה" ולהגדיר את זמן החשיפה 1 s.
    9. בחר 'גבוהה' עבור 'רגישות/פתרון'. השאר "הוסף תמונה דיגיטציה" לא מסומנת. לחץ על לחצן "התחל" כדי לקחת תמונה.
    10. לשמור את התמונה שהופיעו בתצוגה במחשב בתור קובץ TIFF.
    11. חזור על לקיחת תמונות עם חשיפה מעת 1, 3, 10, 30, 60, 90, 120, 150 s, עד 180 s. כשאתה לוקח את התמונה האחרונה, בדוק "הוסף תמונה דיגיטציה" אז התמונה הדיגיטלית, לא chemiluminescence, של הקרום שניתן לנקוט בעת ובעונה אחת.
    12. בחר את התמונה הטובה ביותר עם הטווח הדינמי הגדול ביותר וללא כל הפיקסלים saturating (מוצג באדום) הלהקות עניין.
      הערה: סרטי רנטגן קונבנציונלי יכול לשמש גם עבור זיהוי19.

    • הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    תוצאות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ביטוי מערכת: זירחון של HA-Rab10 על-ידי 3 × הדגל-LRRK2 ב HEK293 תאים:

    HEK293 התאים היו transfected עם µg 0.266 של HA-Rab10 פראי-סוג של 1.066 µg של 3 × הדגל-LRRK2 (מוטציה פראי-סוג, לא פעיל-קינאז (K1906M), או מוטציות FPD). זרחון Rab10 נבדק על ידי P-תג מרחביות עמודים ואחריו immunoblotting באמצעות של אנטי-HA נוגדנים (איור 2). 10 µg של חלבונים היו להפעיל על ג'ל 10% (80 x 100 x 1 מ מ) המכיל 50 מיקרומטר P-תג א...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    דיון

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    כאן, אנו מתארים שיטה נתיישב חזקה של גילוי Rab10 זרחון על ידי LRRK2 ברמות אנדוגני בהתבסס על המתודולוגיה P-תג. כי הנוגדן זמין כעת נגד phosphorylated Rab10 עובד רק עם חלבונים overexpressed15, השיטה נוכח ניצול P-תג מרחביות-דף היא הדרך היחידה להערכת רמות אנדוגני של זרחון Rab10. יתר על כן, השיטה הנוכחית מאפשרת את אומדן סטויכיומטריה של זרחון Rab10 בתאים. מאחר המתודולוגיה P-תג חל כללי פוספו-חלבונים, בפרוטוקול הנוכחי ניתן "טיפוס" להקמת שיטות דומות פוספו-חלבונים אחרים.

    השלבים הקר...

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    גילויים

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    המחברים אין לחשוף.

    תודות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנו מודים ד ר טאקאשי Iwatsubo (אוניברסיטת טוקיו, יפן) בחביבות לספק את פלסמידים קידוד 3xFLAG-LRRK2 WT ו מוטנטים. אנו מודים גם ד ר אולאסי דריו (אוניברסיטת של דנדי, בריטניה) למתן בחביבות MLi-2 ואת פלסמיד קידוד HA-Rab10. עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) KAKENHI גרנט מספר JP17K08265 (ג'י. איי).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    חומרים

    רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
    שםחברהמספר קטלוגהערות
    <חזק>ריאגנטים
    מלח פוספט (DPBS)תוצרת ביתשל Dulbecco 150 מ"מ NaCl, 8 מ"מ Na2HPO4-12H2O, 2.7 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ KH2PO4 in MilliQ מים ועוקרו על ידי חיטוי
    נתרן כלורינקלאי Tesque31320-34
    נתרן דיסודיום הידרוגנפוספט 12-מיםWako196-02835
    אשלגן כלוריWako163-03545
    אשלגן דימימן פוספטWako169-04245
    2.5% טריפסין (10X)Sigma-AldrichT4549לדלל פי 10 עם DPBS סטרילי להכנת תמיסת עבודה
    Dulbecco's modified Eagle medium
    (DMEM)    		Wako044-29765
    סרום בקר עובריBioWestS1560מושבת בחום ב-56 מעלות; C למשך 30 דקות
    פניצילין-סטרפטומיצין (100X)Wako168-23191
    HEPESWako342-01375
    נתרן הידרוקסידWako198-13765
    פוליאתילנימין HCl MAX, ליניארי, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)PolySciences, Inc.24765-1תמיסת מלאי הוכנה ב-20 מ"מ HEPES-NaOH pH 7.0 ב-1 מ"ג/מ"ל ולאחר מכן ה-pH הותאם ל-7.0 עם NaOH
    דימתיל סולפוקסידWako045-28335
    TrisSTARRSP-THA500G
    חומצה הידרוכלוריתWako080-01066
    פוליאוקסיאתילן(10) אוקטילפניל אתרWako160-24751שווה ערך לטריטון X-100
    אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)Wako346-01312
    נתרן אורתוואנדאט(V)Wako198-09752
    נתרן פלואורידקאנטו כימיקל37174-20
    &בטא;-חומצה גליצרופוספורית מלח דיסודיום פנטהידראטנקלאי טסק17103-82
    נתרן פירופוספט דקהידראטKokusan Chemical2113899
    מיקרוציסטין-LRWako136-12241
    סוכרוזWako196-00015
    קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTARoche11873580001ממיסים טבליה אחת ב-1 מ"ל מים, שניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C לחודש. השתמש בו בדילול של 1:50 לליזה תאים
    Pierce Coomassie (Bradford) ערכת בדיקת חלבוןThermo Fisher Scientific23200
    נתרן דודציל סולפטNacalai Tesque31607-65
    גליצרולWako075-00616
    ברומופנול כחולWako021-02911
    β-מרקפטואתנולקאנטו כימיקל25099-00
    אתנולWako056-06967
    מתנולWako136-01837
    תג מחייב פוספט אקרילאמידWakoAAL-107P-tag אקרילאמיד
    40% (w/v) תמיסת אקרילאמידNacalai Tesque06119-45אקרילאמיד: Bis = 29: 1
    Tetramethylethylenediamine (TEMED)Nacalai Tesque33401-72
    אמוניום פרסולפט (APS)Wako016-08021תמיסה של 10% (w/v) הוכנה על ידי המסת אבקת אמוניום פרסולפט במי MilliQ
    2-פרופנולWako166-04831
    מנגן כלוריד טטרהידרטSigma-AldrichM3634
    Precision Plus חלבון צבוע מראשBio-Rad1610374, 1610373, 1610377סמן משקל מולקולרי המשמש בפרוטוקול
    WIDE-VIEW סמן גודל חלבון צבוע מראש IIIWako230-02461
    GlycineNacalai Tesque17109-64
    Amersham Protran NC 0.45GE Healthcare10600007קרום ניטרוצלולוזה
    מסנן ממברנה DuraporeEMD MilliporeGVHP00010PVDF ממברנה
    מסנן ניירות מסנן מס' 1Advantec00013600
    Ponceau SNacalai Tesque28322-72
    חומצה אצטיתWako017-00251
    Tween-20Sigma-AldrichP1379פוליאוקסיאתילנסאורטן מונולאורט
    חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)Wako345-01865
    אבקת חלב רזהמעבדות Difco232100
    ImmunostarWako291-55203תמיסת ECL (רגישות רגילה)
    Immunostar LDWako290-69904תמיסת ECL (רגישות גבוהה)
    תמיסת צביעה CBBתוצרת בית1 גרם CBB R-250, 50% (v/v) מתנול, 10% (v/v) חומצה אצטית ב-1 ליטר מים
    MilliQ CBB R-250Wako031-17922
    CBB תמיסהתוצרת בית12% (v/v) מתנול, 7% (v/v) חומצה אצטית ב-1 ליטר MilliQ מים
    <חזק>שם<חזק>חברה><חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
    <חזק>נוגדנים
    נגד HAסיגמא-אולדריץ'11583816001בשימוש ב-0.2 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    anti-Rab10 נוגדניםCell Signaling Technology#8127בשימוש בשעה 1:1000 עבור אימונובלוטינג.
    הספציפיות אושרה על ידי CRISPR KO ב- Ito et al., Biochem J, 2016.
    נוגדן anti-pSer935Abcamab133450בשימוש ב 1 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    נוגדן נגד LRRK2Abcamab133518בשימוש ב 1 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    נוגדן אנטי-&אלפא;-טובוליןSigma-AldrichT9026בשימוש ב-1 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    נוגדן נגד GAPDHSanta-Cruzsc-32233בשימוש ב-0.02 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch515-035-003בשימוש ב-0.16 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-035-003בשימוש ב-0.16 μ גרם/מ"ל לאימונובלטינג.
    NameCompanyCatalog NumberComments
    InhibitorsGSK2578215A
    תמיסת המלאי של MedChem ExpressHY-13237הוכנה ב-DMSO ב-10 מ"מ ואוחסנה ב-80 מעלות; C
    MLi-2סופק על ידי ד"ר דריו אלסי (אוניברסיטת דנדי)תמיסת המלאי הוכנה ב-DMSO ב-10 מ"מ ואוחסנה ב-80 מעלות; C
    NameCompanyCatalog NumberComments/strong<>
    Plasmids
    Rab10/pcDNA5 FRT ל-HAשסופק על ידי ד"ר דריו אלסי
    (אוניברסיטת דנדי)    		פלסמיד זה מבטא Rab10 אנושי מתויג HA.
    LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)איטו ואחרים, ביוכימיה, 46: 1380– 1388 (2007). פלסמיד זה מבטא LRRK2 אנושי מסוג פרא מתויג באמינו 3xFLAG.
    LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)איטו ואחרים, ביוכימיה, 46: 1380– 1388 (2007). פלסמיד זה מבטא מוטציה לא פעילה K1906M קינאז מתויגת אמינו-טרמינלית של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10מאמר זה. פלסמיד זה מבטא מוטציה N1437H FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963– 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441C FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963– 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441G FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963– 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441H FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10מאמר זה. פלסמיד זה מבטא מוטציה R1441S FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963– 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה Y1699C FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)Kamikawaji et al., ביוכימיה, 48: 10963– 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה G2019S FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10סופק על ידי ד"ר טאקשי איוואטסובו (אוניברסיטת טוקיו)קאמיקאוואג'י ואחרים, ביוכימיה, 48: 10963– 10975 (2013). פלסמיד זה מבטא מוטציה I2020T FPD מתויגת 3xFLAG של LRRK2 אנושי.
    שםחברה<strong>מספר קטלוגיהערות
    Equipments
    CO2 חממהתרמו פישר ScientificForma Series II 3110 פיפטה אוטומטית עם מעטפת
    דראמונדPipet-Aid PA-400
    Micropipette P10Nichiryo00-NPX2-100.5– 10 μ L
    מיקרופיפטה P200Nichiryo00-NPX2-20020– 200 μ L
    מיקרופיפטה P1000Nichiryo00-NPX2-1000100– 1000 μ L
    טיפים למיקרופיפטה P10STARRST-481LCRST
    טיפים סטריליים למיקרופיפטה P200FUKAEKASEI1201-705YS
    טיפים סטריליים למיקרופיפטה P1000STARRST-4810BRSTסטרילי
    5 מ"ל פיפטה ניתנת לחלוקהגריינר606180סטרילי
    10 מ"ל פיפטה ניתנת לחלוקהגריינר607180
    סטרילי 25 מ"ל פיפטה ניתנת לחלוקהפלקון357535
    המטוציטומטרזכוכית עופרתשמש A126מיקרוסקופ נויביואר משופר
    אולימפוסCKX53
    10 ס"מ כליםפלקון353003לתרבית רקמות
    צלחות 6 בארותAGC טכנו זכוכית3810-006לתרבית
    רקמותמערבל מערבולתScientific IndustriesVortex-Genie 2
    מגרדי תאיםSumitomo BakeliteMS-93100
    צינורות 1.5 מ"לSTARRSV-MTT1.5
    צינורות 15 מ"לAGC טכנו זכוכית2323-015
    צינורות 50 מ"לAGC טכנו זכוכית2343-050
    צנטריפוגותTOMYMX-307
    צלחות 96 בארותגריינר655061לא לתרבית רקמות
    קורא צלחותמכשירים מולקולרייםSpectraMax M2e
    SDS– מיכלי PAGENihon EidoNA-1010
    מיכלי העברהNihon EidoNA-1510B
    צלחות ג'ל (מחורצות)Nihon EidoNA-1000-1
    צלחות ג'ל (רגילות)Nihon EidoNA-1000-2
    מרווחי סיליקוןNihon EidoNA-1000-16
    מסרקים 17 בארותNihon Eidoבהתאמה
    קליפס קלסרNihon EidoNA-1000-15
    מזרק 5 מ"לTerumoSS-05SZ
    21GTerumoNN-2138R
    תחנת כוח 1000 VCATTOAE-8450ספק כוח עבור SDS– עמוד והעברה
    סירות שקילה גדולותIna OptikaAS-DL
    מיכלי פלסטיקכמארז PS אחד מס'4 10 x 80 x 50 מ"מ
    שייקר נדנדהTitechNR-10
    קופסת קצף סטירןגנריתהמידות הפנימיות צריכות להתאים למיכל העברה אחד (200 x 250 x 250 מ"מ).
    ImageQuant LAS-4000GE Healthcareצילום מצויד במצלמת CCD מקוררת לזיהוי ECL
    תמיסת מים סטרילי אישית

    מקורות

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
    2. Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
    3. Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
    4. Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
    5. Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
    6. Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
    7. Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
    8. Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
    9. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
    10. Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
    11. Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
    12. Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
    13. West, A. B., et al. Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
    14. Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
    15. Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
    16. Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
    17. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
    18. Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017).
    19. Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
    20. Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
    21. Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
    22. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
    23. Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519(2011).

    הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

    הדפסות חוזרות והרשאות

    בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

    בקש הרשאה

    תגיות

    SDS PAGEWestern BlottingHEK293P tagRab10

    מאמרים קשורים