הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בייצור המוני של ג'ין להחרשת תאי NK מאתר באמצעות מערכת בידול נטולת מזין עבור המחקר מכניסטית חוץ גופית בתוך ו ויוו.

תקציר

תאים (NK) רוצח טבעי שייכת מערכת החיסון המולדת, השורה הראשונה נגד סרטן מערכת החיסון הגנה; עם זאת, הם מדוכאים ב microenvironment הגידול, המנגנון הבסיסי הוא עדיין אינו מודע לקיומם. העדר מקור עקבית ומהימנה של תאי NK מגביל את התקדמות המחקר של חסינות התא NK. כאן, אנחנו מדווחים במבחנה מערכת שיכול לספק איכות גבוהה, כמות הנגזרות מח עצם של תאי NK מאתר בתנאי נטולת מזין. יותר חשוב, אנחנו גם להוכיח כי בתיווך siRNA ג'ין להחרשת בהצלחה מעכב ההבשלה התא NK תלויי-E4bp4 באמצעות מערכת זו. לפיכך, הרומן במבחנה NK תא זה המבדילים המערכת היא פתרון biomaterial למחקר חסינות.

מבוא

התקדמות סרטן תלוי במידה רבה הגידול microenvironment^1,2, כולל המארח, נגזר immunocytes, למשל, תאי NK. מספר מחקרים הראו כי תאי NK intratumoral נמצאים בקורלציה שלילית עם^3,התקדמות הגידול⁴. בנוסף, מחקרים קליניים הראו כי טיפול המאמצת בתאי NK היא אסטרטגיה אפשרית עבור סרטן^5,6,-^7,-^8,-⁹. חיסוני סרטן המבוסס על תאי NK לאחרונה הוצע כאופציה טיפולית עבור גידולים מוצקים, אך אתגרים קיים בשל ההפרשה של ציטוקינים לדיכוי המערכת החיסונית ואת downregulation של הפעלת ליגנדים ב- microenvironment של גידולים מוצקים ^10,11. שינוי צורה של גורם גדילה-β (TGF-β) הוצע כדי לשחק תפקיד מדכאים carcinogenesis, אבל באופן פרדוקסלי תאים סרטניים גם לייצר TGF-β1 כדי לתמוך את הגידול פיתוח^{12,13,14 , 15}. TGF-β איתות יכול לדכא את פעילות תאי NK באמצעות ויסות מטה תגובתיות אינטרפרון, בתיווך CD16 אינטרפרון-גמא (IFN-γ) ייצור במבחנה^{16,17, cytolytic 18}.

למרות שיבוש TGF-β איתות ב microenvironment הגידול עשוי להיות דרך אפשרית עבור ביטול סרטן, חוסמת לחלוטין TGF-β איתות יגרום מחלות אוטואימוניות בשל תפקידה אנטי דלקתיות, כפי שמעידים על התפתחות תופעות לוואי כולל דלקת מערכתית, מומי לב וכלי דם, מחלת חיסון עצמי עכבר מודלים¹⁹. לפיכך, הבנת מנגנון העבודה של TGF-β-מתווכת החיסוני תוביל אל זיהוי מטרה טיפולית נגישים לטיפול בסרטן.

התירי את האירועים המולקולריים הדרושים להתפתחות תאי NK, וויליאמס. ואח הקימה מערכת במבחנה כי להבדיל מאתר מח עצם תאי גזע hematopoietic לתוך NK תאים²⁰. מערכת זו מקלה במידה רבה בחקר התפתחות התא NK, כולל זיהוי אבות הרומן של תאי NK²¹מכניסטית. עם זאת, צריך להיות תרבותי המוצא לאגס מח עצם במערכת עם תמיכה OP9 סטרומה תאים כמו מזין שכבה^20,21, ומגביל אוכלוסייה הטרוגנית תא זו במידה רבה יישום נוסף של שיבוש גנטי כלים (למשל, בתיווך siRNA ג'ין להחרשת) שימושית במיוחד לתאי NK המבדילים.

כאן נתאר מערכת נטולת מזין, שפותחו על-ידי המערכת במבחנה של וויליאמס ואח²⁰שינוי נוסף. במערכת שלנו, תאי סטרומה מזין OP9 אינם נדרשים, ולהוביל במקום OP9 המדיום המותנה משמש מבלי להשפיע על הבידול של NK תאים במבחנה, ואת זה לאחרונה לנו לחשוף כי TGF-β הוא לקדם התקדמות סרטן באמצעות פיתוח המדכאים של התא NK תלויי-E4bp4 microenvironment גידול²². מערכת חדשנית זו מספקת בהצלחה שיטה ללא רקע שחקרתי את המנגנון המולקולרי התפתחות תאי NK תחת תנאים מסוימים (למשל, גבוהה TGF-β1, בתיווך siRNA ג'ין להחרשת, וכו.) במבחנה.

פרוטוקול

הפרוטוקול עבור קבלת, המבדילים NK הנגזרות מח עצם תאים (מוניטור-NK) מבוסס על שיטות שפורסמו בעבר^20,21,22. כל ההליכים עם עכברים אושרו על ידי החיה אתיקה ניסיוני הוועדה (AEEC) באוניברסיטה הסינית של הונג קונג.

1. הכנת המדיום המותנה OP9

1. תרבות משתית מאתר תא בשורה OP9 אלפא-מ המכיל 20% FBS, U/mL 100 פניצילין G ו סטרפטומיצין µg 100/mL, ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של אוויר/CO₂ (95%: 5%).
   1. לספור את התאים עם hemocytometer, ואז זרע 2 x 10⁶ תאים OP9 את הבקבוק תרבות² כל 75 ס מ עם 15 מ"ל של מדיום. תרבות במשך 48 שעות.
   2. התרבות מגיעה למפגש 80%, לשטוף את הבקבוק עם 10 מ"ל של PBS ולהוסיף 20 מ"ל של מדיום אלפא-מ רגיל (ללא FBS ואנטיביוטיקה) לכל את הבקבוק.
2. לאסוף את המדיום תנאי OP9 מן הבקבוק תרבות-24 שעות ביממה, לנקות את שאריות תאים עם מסנן polyethersulfone (פסי) מיקרומטר 0.25 ולשמר ב 4 ° C (שימוש בתוך 2 שבועות).

2. בידוד תאי מח עצם העכבר

1. המתת חסד עכבר C57BL/6J בן 12 בשבוע מנת יתר pentobarbitone (100 מ"ג/ק"ג, הזרקת בקרום הבטן). לאשר את מותו על ידי חוסר נשימה, ואז לקצור את העצמות עצם הירך עם חיתוך סכין כירורגית בצמתים שבין עצמות, להסיר את השרירים הנותרים עם הלהב על ידי גירוד עדין.
2. מניחים את העצמות שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל המכיל אלפא סטרילי צונן-מ, ולאחר מכן בצע את הפעולות הבאות באבטחה ארון.
3. ביטול המדיום אלפא-מ, ולשטוף את העצמות עם 70% אתנול ל 30 s.
4. לשטוף את העצמות עם PBS קר כקרח סטרילי פעמיים כדי לנקות האתנול הנותרים.
5. העברת עצמות מרגמה המכילה 5 מ של PBS קר כקרח, בעדינות fragmentize העצמות עם כבעלי (לא pulverize אותם).
6. להתסיס את העצמות בעדינות על ידי מתערבל את המרוסקים כדי לשחרר את התאים במח העצם לתוך מגניב. איסוף תאי מח עצם המכיל PBS לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש.
7. חזור על שלב 2.6 עבור ארבע פעמים עד שברי עצם הופכים לבן, מוצק בצבע.
8. Centrifuge את הצינור ב- g x 465 עבור 5 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.
9. Resuspend בגדר עם 18 מ ל מים מזוקקים סטריליים, ומשהים 30 s כדי להסיר תאי דם אדומים.
10. להוסיף 2 מיליליטר 10 קר כקרח PBS X כדי לעצור את התגובה, ואז לסנן את התערובת דרך מסננת תא מיקרומטר 70 להסרת כדוריות דם אדומות lysed.
11. Centrifuge את הצינור ב- g x 465 עבור 5 דקות ב 4 º C. Resuspend בגדר עם 20 מ של PBS קר כקרח.
12. לשטוף את התאים באמצעות חזרה שלב 2.11 בפעם השנייה.
13. להעביר בגדר תא 100-מ מ עקר פטרי עם 10 מ"ל של המדיום המותנה OP9 מהשלב 1.2 בתוספת 20% FBS ותערובת של 0.5 ng/mL 7-IL מאתר 30 ננוגרם למ"ל העכבר SCF, 100 flt3L מאתר U/mL.
14. דגירה המנה ב 37 ° C עם 5% CO₂ ח' 2 העברת תאי כעיגולים בצבע לתוך מיכל תרבות חדשה-צפיפות של 5 x 10⁵ קיימא תאים למ"ל (ספירת תאים על-ידי hemocytometer עם הדרה trypan-כחול) עם אותה נוסחה בינוני כמו שלב 2.13 , דגירה ב 37 ° C עם 5% CO₂.
15. יום 4, שינוי התנאי תרבות המדיום המותנה OP9 בתוספת 20% FBS ו- 2,000 U/mL של מאתר il-2.
16. רענון המדיום תרבות כל 3 ימים; תאי NK בוגר יכול להיות מתקבל על ידי 7 יום, מוסמך כמו סעיף 4.

3. siRNA בתיווך גנים Silencing של תאי NK המבדילים

1. Premix siRNA או שטויות הפקד (NC) עם סוכן תרביות תאים על פי ההדרכה של המוצר.
2. בצע את שלב 3.1 בכל נקודת זמן מהיום 0.
3. להוסיף את ה-50 nM של siRNA או תערובת NC לתאים מהשלב 2.14.
4. חזור על שלב 3.1 על כל כיבוד בינונית (למשל, היום 0, 4 ו- 7) עד נקודת הסיום ניסיוני.

4. ניתוח של התא NK בידול באמצעות Cytometry זרימה

1. בנקודת זמן מתאים, לאסוף את התליה של הבחנה תאים ולשטוף עם PBS קר כקרח.
2. לתקן את התאים באמצעות מאגר קיבוע תאים על פי המדריך המוצר.
3. לשטוף את התאים קבוע עם PBS קר כקרח ולאחר מכן resuspend עונה 1 פרק 10⁶ תאים µL 100 של Flow Cytometry מכתים מאגר המכיל Cy3 מצומדת אנטי עכבר NKp46 ו- PE-מצומדת העכבר אנטי CD244 נוגדנים על יחס דילול בטחונות.
4. כתם המדגם בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
5. Resuspend הדגימות ויטראז'ים עם 300 µL ל- PBS, ולאחר מכן לרכוש FACS הנתונים ולנתח עם Cytobank פלטפורמה²⁰ (http://cytobank.org/).

תוצאות

התוצאות נציג מתקבלים בעקבות הפרוטוקול המתואר. תאים במח העצם הכולל ההשעיה היו מעובדות תחת מערכת מזין ללא בידול למשך 11 ימים; עלייה משמעותית בשיעור התפשטות נצפתה על ידי יום 7 לעומת מספר התאים הכולל ביום 0 (איור 1א'). תאי NK בוגרת עם יחס גבוה גרעיני כדי cytoplasmic, מורפולוגיה ציטופלזמה עשירה גרגר נמצאו ביום 6 במערכת (איור 1B).

כדי להבהיר ...

דיון

בשנת העבודה הנוכחית, תארנו שיטה להפקת הנגזרות מח עצם מאתר NK תאים בתוך חוץ גופית. התא המזין^21,המערכת המקורית²² מוחלף בהצלחה על-ידי המדיום המותנה של תאים OP9, שהגדילה במידה רבה את היציבות של המערכת בידול. בנוסף, המערכת יכולה לייצר כמות גבוהה, טוהר NK בוגרת תאי במבחנה , כמו גם ויוו מבחני, אשר יכול להקל את המחקר מכניסטית, כמו גם המחקר translational תאי NK במחלות אנושיות.

השיטה המתוארת שימש עבור חוקרים את התפקיד ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאים OP9	ATCC	ATCC® CRL-2749™
MEM α, ללא נוקלאוזידים	Gibco	22561021
סרום בקר עוברי	Gibco	10500064
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
עכברים רקומביננטיים IL-7	PEPROTECH	217-17
עכבר רקומביננטי SCF	PEPROTECH	250-03
עכברים רקומביננטיים Flt3-Ligand	PEPROTECH	250-31L
עכבר רקומביננטי IL-2	PEPROTECH	212-12
ליפופקטמין RNAiMAX מגיב טרנספקציה	Invitrogen	1377815
מאגר קיבוע IC	eBioscience	00-8222-49
מאגר צביעת ציטומטריית זרימה	eBioscience	00-4222-26
PE-conjugated anti-mouse CD244	eBioscience	12-2441-83
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46	Bioss	bs-2417R-cy3
Nonsense Control (NC)	Ribobio	siN05815122147
siRNA נגד עכבר E4BP4 mRNA	Ribobio	N/A	5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3& פריים;