מאמר שיטה

הדמיה תפקודית של מפעלי שעתוק ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות תלת-ממד

DOI:

10.3791/56832

⸱

18 בינואר 2018

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מפעלים תעתיק ויראלי הם מבנים בדידים מועשר עם הסלולר RNA פולימראז II כדי להגדיל את שעתוק גנים ויראליים במהלך הפעלה מחדש. . הנה, מתוארת שיטה לאיתור אתרים של פעיל תעתיק כרומטין ויראלי במרחב תלת-ממדי גרעינית על ידי שילוב של immunofluorescence מכתים, בחיי עיר RNA הכלאה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ידוע כי יכולות ויסות גנים היא חלק בלתי נפרד המסדירים ביטוי נאות גנים, הוא... כתוצאה מכך, זה לא יסולא בפז. כדי להבין איפה ומתי שעתוק מתרחש בתוך הגרעין וכדי להמחיש את הקשר בין episomes נגועים בתוך גרעין התא אותו. כאן, היה immunofluorescence (IFA) ו- RNA-דג combinedto לזהות באופן פעיל תעתיק episomes הקשורים סרקומת קפוסי ההרפס (KSHV). על ידי צביעת KSHV השהיה-הקשורים גרעיני אנטיגן (לנה), זה ניתן לאתר היכן episomes ויראלי קיימים בתוך הגרעין. בנוסף, על-ידי עיצוב הגששים RNA-דג כדי להתמקד באזור אינטרון של גנים ויראליים, שבא לידי ביטוי רק במהלך זיהום פרודוקטיבי, המתהווה תעתיקים RNA יכול להיות ממוקם. באמצעות השילוב של הגששים מולקולרית, זה אפשרי לדמיין את ההרכבה של מפעלים גדולים שעתוק ויראלי ולנתח ויסות גנים ויראליים במהלך הפעלה מחדש KSHV מרחבית. על-ידי הכללת אנטי-RNA פולימראז II נוגדן מכתים, אחד יכול לדמיין גם את הקשר בין צבירת RNA פולימראז II (RNAPII) ו- KSHV שעתוק במהלך הפעלה מחדש.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זה הפך ליותר ויותר ברורה כי ייתכן הארגון של הגרעין ממלא תפקיד חשוב ב להתכוונן ביטוי גנים משומנות ב פרוקריוטים. רוב רקמת גנים ספציפיים מופצים על פני הכרומוזומים רבים, צריך להיות מוסדר באופן סינכרוני כדי להגיב לגירויים ספציפיים בצורה מתואמת1. תאים לבנות כרומטין פעיל רכזות (ACH) כדרך וקירוב גנים ומרכיביהן cis-רגולציה הגרעין ספציפי1.

זה גם הוכח על ידי מחקרים שונים כי למרות הגרעין נראה צפוף מאוד צמיגה, מולקולות פעילים ביולוגית שבאפשרותם הגרעין די מהר באמצעות דיפוזיה2. בשל תכונה זו ארעיות, רוב ה-DNA מחייבת חלבונים 'לקפוץ' איגוד האתר מחייבת באתר, מרגיש דרכם סביב הגרעין, מה שמאפשר עבור גרעין מאוד גמישים ופסיביות2.

למרות התנהגות דינמית זו של מולקולות בתוך הגרעין, גרעיני גופות ללא ממברנות כגון (אך לא רק) גרעינון, קחאל גופות וגופים פרומיאלוציטית לוקמיה גרעינית (PML-NB) עדיין קיים. . זה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים כגון חזרה DNA טנדם (גרעינון), rRNA (גרעינון) חלבונים מבניים כגון coilin (גופים קחאל) או PML חלבונים (PML-NB) שמחזיקים אלה בונה יחד3,4,5 . מבנים אלה ושל קהילות אחרות כגון מפעלי שעתוק לשמש פיגומים לא רק להגדיל את הריכוז המקומי של הרכיבים הנדרשים, אך גם לווסת את ההרכב של חלבונים וחומצות גרעין בתוך אותם בסופו של דבר ליצור אתר מרכזי יעיל תאיים6.

להמחיש מתי ואיפה מבני הגרעין טופס מספק שפע של מידע לחוקרים הלומדים אפיגנטיקה. מנקודת מבט וירולוגיה, שהפעלה של לחשוף נגוע וירוסים, כגון KSHV, משנה באופן משמעותי את הנוף של גרעין והפצה של אנזימים גרעינית כדי להעביר שעתוק בעיקר מן הגנים הסלולר גנים ויראליים, בסופו של דבר אל לייצר באופן תקין רומא ויראלי7,8. איך KSHV לתפעל את מכונות ביטוי גנים הסלולר כדי להקל על ביטוי גנים ויראלי? מידע כזה יכול גם לשפוך אור על מנגנוני הרגולציה ג'ין הסלולר טמפורלית.

כמו כל herpesviruses אחרים, KSHV יש שני מחזורי החיים שנקרא שכפול lytic וזמן ההשהיה. KSHV מתגוררת בעיקר בשלב החביון, שרוב שלה ג'ין ויראלי ביטוי מושתק, אלא השהיה הקשורים גנים9,10. במהלך השהיה ש-KSHV מייצרת השהיה קשור אנטיגן גרעיני (לנה), אשר צורונים נקשר הגנום הנגיפי ואת היתדות כרומטין ויראלי כרומוזום אנושי11. בגלל לאנה יחסים אינטימיים עם הגנום הנגיפי, זה אפשרי להשתמש IFA דאפי כתם ולאתר איפה episomes ויראלי היו ביחס כרומטין המארח.

ללמוד הפעלה מחדש KSHV ברמת episome יחיד, את הקשר עם אחרים episomes ויראלי תא נגוע, הוקם אסטרטגיה לאתר פעיל תעתיק כרומטין ויראלי בחיי עיר . בהתאם לכך, לאנה, IFA RNAPII עם אינטרון RNA-דג משולב, על ידי יצירת RNA-דג הגששים לאגד לאזור אינטרון (בדיקה המדויק ניתן למצוא רצפים של המעבדה Izumiya הפרסום האחרונה8) של חלבון נגיפי מפתח KSHV K-Rta-זה חיוני ומספיק KSHV הפעלה מחדש-זה היה ניתן לזהות היכן שעתוק למעשה לוקח במקום8,11,12,13,14,15 . אינטרון זו טכניקת ה-RNA-דג מאפשר לחוקרים לדמיין איפה ה-mRNA הוא עיבד מיד לפני זה הוא משולבים וייצא אל הציטופלסמה16,17.

KSHV ניתן להפעיל מחדש על ידי גירויים כימיים שונים לרבות אסטרים phorbol כגון 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA), מעכבי deacetylase היסטון כגון נתרן butyrate, בנוסף KSHV יכולה להיגרם להפעיל מחדש על ידי ביטוי של פקטור שעתוק ויראלי, K-Rta19. בהצלחה להגביר את היעילות של KSHV הפעלה מחדש על-ידי סינכרון מחזורים של התא לפני גרימת הפעלה מחדש18. לפיכך, ללימודים אלה מסוים, תאים סונכרנו מודגרות עם TPA ו דוקסיציקלין (Dox) לזמן קצר ושימוש בלוק תימידין כפול (פרוטוקול המתואר להלן). Doxycyline שימש כי הקו תא מנוצל בניסויים אלה יש קלטת K-Rta inducible-דוקסיציקלין, אשר היה שוכפלה מ cDNA אינו כולל האזור אינטרון של K-Rta. למרות שניתן להפעיל מחדש רק באמצעות KSHV המושרה בביטוי K-Rta, הוכח על ידי חוקרים אחרים כי בשל מגוון גורמים ביוכימיים שונים בביטוי K-Rta לבד מוכיחה להיות גירויים הפעלה מחדש חלש20. על ידי שילוב של כל אלה, על-ידי הגבלת incubations את התרופה לתקופה קצרה של זמן, הפעלה מחדש KSHV חזקים אך לא יתר על המידה מלאכותית הושגה עבור הדמיה.

לאחר תיוג לאנה, RNAPII, K-Rta אינטרונים, דנ א כמו שמתואר הנייר הזה, הדמיה תלת-ממדית פלורסצנטיות התבצע בעזרת מיקרוסקופ deconvolution widefield. לאחר העיבוד עם תוכנות ליצירת תמונות, התפוצה המרחבית של episomes ויראלי פעיל שניתן יהיה להעריך כראוי. בעזרת טכניקה זו, השאלות המרכזית לגבי אופי מהותי של היווצרות של כרומטין פעיל רכזות ומבנים אחרים גרעיני יכול להילמד. שיש episomes נגיפי זהה בתא יחיד המעבדת אותם רכיבי רגולטוריות עשוי לייצג כלי מחקר ייחודי להעמיק את ההבנה של מנגנונים רגולטוריים ייתכן ג'ין.

מגבלה של הדמיה מרובים תא דגימות קבוע בנקודות זמן שונות כדי לאפיין תהליך מולקולרית מטבעו דינאמי הוא שינויים עדינים או בקנה מידה קטן התפלגות קרינה פלואורסצנטית מבלי שיבחינו או ייחשב חסר חשיבות. זה נכון, אלא אם כן במופע נדיר, כל תא נצפתה מציגה את השינוי אותו עדין. לכן, הקשר מלא זמן-מרחבי של שעתוק ויראלי פעיל ומבנים אחרים גרעינית לא ניתן באורח קשה להעריך באמצעות הדמיה קבוע. כדי לטפל אלה אתגרים טכניים, הגישה הטובה ביותר היא התמונה תאים חיים המסומנים episomes ויראלי, לעקוב אחר המיקום של אנזימים הסלולר מפתח לאורך זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התראה: שורות תאים המשמשים בהליך זה להכיל וירוסים זיהומיות, להיזהר והמשך רק במתקן BSL רמה 2 ומעלה.

1. תא הכנה ותחזוקה

  1. התרבות התאים TREx-K-RTA BCBL-1 (או KSHV עוד נגוע שורות תאים פל) בינוני RPMI1640 בתוספת 15% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1% פניצילין סטרפטומיצין גלוטמין פתרון.
  2. לגדל תאים ב 37 ° C עם 5% פחמן דו-חמצני (CO2), מוודא לגדול ללא הרף כדי לפצל תאים לפי יחס של 1:4 כל 2-4 ימים.
  3. לפקח על תרביות תאים עם מיקרוסקופ אור כל יום כדי לאשר צמיחת תאים טובה, מורפולוגיה, אחרת שמומלץ להפעיל מחדש את התרבות התא או כדי להתאים את התנאים התרבות התא בהתאם.

2. תימידין סינכרון ומעגל Lytic

  1. ב 10 ס"מ פטרי, צלחת התאים TREx-K-Rta BCBL-1 בלהתמחויות מדיה (1 x 106 תאים/2 מ"ל של מדיה)
  2. להוסיף 200 מ"מ תימידין (הריכוז הסופי: 2 מ מ) למנה, לערבב, תקופת דגירה של 18 h.
  3. צנטריפוגה התאים עבור 5 דקות ב 500 x g... לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) צנטריפוגה שוב, resuspend תאים בתקשורת המוכנים באופן טרי. חזור על סך של 3 מנקי. Resuspend בתקשורת המוכנים באופן טרי.
  4. מאפשרים לתאים exit שלב S עבור 8 שעות.
  5. להוסיף תימידין (הריכוז הסופי: 2 מ מ), לערבב, תקופת דגירה של 16 h.
  6. צנטריפוגה התאים עבור 5 דקות ב 500 x g... לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) צנטריפוגה שוב, resuspend תאים בתקשורת המוכנים באופן טרי. חזור על סך של 3 מנקי. Resuspend בתקשורת המוכנים באופן טרי.
  7. לזירוז ויראלי הפעלה מחדש, להוסיף 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, הריכוז הסופי 20 ng/mL) ו דוקסיציקלין (DOX, ריכוז סופי 100 ננוגרם למ"ל) התרבות תאים, לערבב, דגירה במשך 4 שעות. עבור שורות תאים ללא קלטת inducible K-Rta, לעורר הפעלה מחדש באמצעות TPA (ריכוז סופי 20 ng/mL, נתרן butyrate (1 מ מ)).
  8. צנטריפוגה התאים עבור 5 דקות ב 500 x g... לשטוף את התאים עם עקר 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) צנטריפוגה שוב, resuspend תאים בתקשורת תרבות שלמה. חזור על סך של 3 מנקי. Resuspend בתקשורת תרבות שלמה.
  9. מאפשרים לתאים לגדול במשך 24 שעות ביממה.

3. קיבוע ו- Permeabilization

הערה: לפני שתמשיך, ודא תיקון פתרון (פורמלדהיד 3.7% ב- PBS שטופלו DEPC), diethyl שטופלו pyrocarbonate באגירה פוספט תמיסת מלח (DEPC-PBS), גליצין DEPC PBS (הריכוז הסופי של גליצין: 100 מ מ) permeabilizating הפתרון (50% אצטון, 50% מתנול) מוכנים. בדרך כלל, כל שקופית לדרוש לפחות 0.5 מיליון תאים, להכפיל במידת הצורך, כוללות תאים נוסף בחזרה למעלה, במיוחד אם התאים אינם בריאים.

  1. איסוף תאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
  2. Centrifuge התאים למשך 2 דקות ב 200 x ג' שטיפת התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS DEPC סטרילי. Resuspend ב 1.2 מ של DEPC PBS.
  3. למקם את המספר המתאים של coverslips (שנקבע על ידי התקנה ניסיונית) שהסוליות של צלחת 6-. טוב.
  4. פיפטה 200 µL של התא DEPC PBS התערובת על כל coverslip, להבטיח כי לפחות 0.5 מיליון תאים בכל שקופית. לאפשר את התאים להתיישב למשך 2 דקות, תשאף עודף PBS DEPC עוזב רק שכבה דקה של תאים. זה נורמלי עבור תאים יוסרו בתהליך זה.
    התראה: PFA רעיל, לענוד הגנה הולמת.
  5. להוסיף בזהירות 1 מ"ל של תיקון לפתרון כל תגית כיסוי (3.7% פורמלדהיד ב- DEPC PBS). לאפשר את התאים לתקן 10 דקות.
  6. רחץ coverslips 3 פעמים עם DEPC PBS.
  7. להוסיף בזהירות 1 מ"ל של גליצין DEPC PBS (הריכוז הסופי של גליצין: 100 מ מ) להתחמק כל כיסוי. מאפשרים לתאים להרוות במשך 5 דקות.
  8. להוסיף 1.5 mL DEPC PBS ומקום גם על מטרף במשך 5 דקות או לנער בחוזקה אך בעדינות ביד 1 מינימלית לשאוב PBS עודף DEPC. יש להיזהר לא לשבש את התאים. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 3 מנקי.
  9. להוסיף בזהירות 1 מ"ל של permeabilizing פתרון (אצטון 50%, 50% מתנול) להתחמק כל כיסוי. מאפשרים לתאים permeabilize למשך 15 דקות.
    הערה: בשלב זה, coverslips ניתן לאחסן במקפיא-20 ° C לא יותר משבוע. הימנע הקפאה או למזער את הזמן בילה בפריזר כמו איכות התמונה עלולות לפגום במהירות. ודא כי כאשר במקפיא שנותרו התאים רטוב ומכוסה ב מתנול/אצטון, וכדי להבטיח כי הם כראוי נתרענן עם DEPC PBS לאחר הסרת מהמקפיא.
  10. להוסיף 1.5 mL DEPC PBS ומקום גם על מטרף במשך 5 דקות או ללחוץ בחוזקה אך בעדינות ביד עבור מינימלית 1 מחוק לגמרי מגניב DEPC עודף, להיזהר שלא לשבש את התאים. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 3 מנקי.

4. IFA, RNA-דגים

הערה: לגבי תיוג RNA דגים בדיקה והכנת: עבור ה K-Rta אינטרון 959 בסיסי זוגות, 31 הגששים שונים היו שנוצר זה היו 20 בסיסי זוגות כל אחת, המכילה GC תוכן כ-50%. פתרונות עבודה מלאי הגששים היו aliquoted לתוך 100 מיקרומטר וריכוזי 2.5 מיקרומטר, בהתאמה.

  1. תווית שקופיות מיקרוסקופ עם המידע הנחוץ ניסויית או סוג של תווית ניתן להבחנה.
  2. הקו התחתון של מיכל פלסטיק sealable במגבת נייר לחה.
  3. להכין את הפתרון נוגדן ראשוני (µL 1.5 של נוגדן לאנה, µL 0.75 של נוגדן RNA Pol II, µL 3 של בייקר שמרים tRNA, PBS DEPC עד 30 µL), להכפיל את המתכון לכל coverslip הנוכחי. מקום 30 µL של פתרון נוגדן ראשוני על גבי כל תוויות שקופיות מיקרוסקופ.
    1. Titrate הנוגדן הראשי עניין קודם ולהשתמש הכמות האופטימלית. הקפד להשתמש IgG מטוהרים, כמו סרום (נוזל מיימת) עשוי להכיל כמות גדולה של RNase.
  4. מניחים את coverslip (תאים מול הפתרון) על גבי שקופיות מיקרוסקופ שכותרתו ולהעביר את השקופיות לתוך המיכל עם מגבת נייר לחה. יש להיזהר לא להציג בועות. לכסות את החלק החיצוני של המכולה בניילון נצמד. להזיז את המיכל לתוך אינקובטור מוגדר כ- 37 מעלות לשעה.
  5. להכין מאגר שטיפת הדגים (2 x מלוחים סודיום ציטרט מאגר (האס) (גמר), 10% formamide, 90% DEPC dH2O).
  6. להכין 2 x הכלאה מאגר (4 x SSC, 20% לתוספי סולפט).
  7. להכין נוגדן משני ומאגר בדיקה דגים אינטרון (20 µL של 2 x הכלאה מאגר (סופי 1 x Hyb מאגר), 4 µL של בייקר של שמרים tRNA (האחרון 10%), 4 µL של formamide (10% הסופי), בדיקה אינטרון K-Rta (125 הסופי nM), 0.8 µg של נוגדנים משניים, DEPC dH2 O עד 40 µL). להכפיל את המתכון בכל השקופיות הדרוש.
  8. לאחר דגירה, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS DEPC בצלחת טוב 6 למשך 5 דקות.
  9. לשטוף עם דגים מאגר שטיפת 3 פעמים במשך 5 דקות. לשמור coverslip במאגר שטיפת הדגים עד סיום הכנת תערובת של שנית בדיקה נוגדן ואינטרון (שלב 4.7).
  10. שקופיות זכוכית נקי המשמש נוגדן ראשוני דגירה של הכלאה.
  11. במקום 40 µL של נוגדנים משניים, בדיקה אינטרון דגים המכיל פתרון על גבי כל שקופית מזכוכית.
  12. מניחים את coverslips עם התאים על השקופיות עם הצד תא כלפי מטה על המאגר, להיות להיזהר לא כדי להציג בועות.
  13. מניחים את השקופיות לתוך מיכל פלסטיק במגבת נייר לחה על התחתון. לעטוף את מיכל פלסטיק ניילון נצמד הראשון ולאחר מכן רדיד אלומיניום.
  14. דגירה המכולה עם השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות.
  15. לאחר דגירה, בזהירות להחליק את coverslip מהקצה של השקופית זכוכית, תחזיר את 6 לוחות טוב כלפי מעלה ו לשטוף תאים עם שטיפת הדגים מאגר 3 פעמים בצלחת טוב 6 למשך 5 דקות.
  16. לשטוף את התאים פי 2 עם 2 x SSC.
  17. בוזקים דאפי (1:1, 000) 2 x SSC מאפשרים לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  18. לשטוף את התאים פי 2 עם 2 x SSC.
  19. לנקות את השקופיות זכוכית המשמש הכלאה, ולהוסיף 10 µL של הרכבה פתרון על השקופיות זכוכית.
  20. במקום coverslips עם הפנים כלפי מטה על גבי הפתרון הרכבה. יש להיזהר לא להציג בועות.
  21. עם טישו מעבדה, להסיר בעדינות את הפתרון הרכבה עודף, נזהר שלא למעוך את התאים.
  22. באמצעות לק, להחיל על שכבה בשפע סביב קצה coverslips, אפשר להתייבש.
  23. המשך לבצע פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

5. 3D פלורסצנטיות מיקרוסקופ

הערה: בזמן, פרוטוקולים שונים עם הסוג של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מערכת המשמשת השלבים הבאים תסייע כדי להבטיח הרכישה של נתוני תמונה אופטימלית עבור ניתוח כמותי.

  1. Pretreat דגימות קבוע והר בתקשורת האנטי-עמעום לעכב זריחה photobleaching במהלך דימות.
  2. השתמש מטרה באיכות גבוהה (כגון 60 X 1.42 N.A שמן-טבילה עדשה), אשר ניתן ללכוד כל תא (או גרעין התא) השדה-of-view.
  3. הגדר פרמטרים חשיפה (כגון, עירור כוח, זמן החשיפה) עבור כל אחד מערוצי הצבע פלורסצנטיות, באמצעות דגימות חיובי-שלילי-שליטה. לרכוש תמונות זריחה.
    הערה: דגימות בקרה חיובית המכילים תווית פלורסנט אחת בלבד צריך לשמש גם כדי לקבוע את מידת "crosstalk" בין ערוצי הצבע. עבור דגימות תאים קבוע הדמיה, כוח עירור קרינה פלואורסצנטית יכול להיות מופחת (עם מעט יותר פעמים חשיפה) כדי למזער את photobleaching.
  4. ברגע פרוטוקול הדמיה הקימה, לתחזק באותם פרמטרים חשיפה קבועה עבור כל דוגמאות במחקר — כך יכול להיות מנותח, בהשוואה במדויק נתוני תמונה.
  5. לבצע עיבוד שלאחר רכישת תמונה ושחזור תלת-ממד. לזהות את התמלילים K-Rta על ידי אות ה-RNA-דג (אדום), לאנה מולקולות על ידי immunofluorescence (ירוק), הגרעין כרומטין (במקרים המתאימים) צבעונית עם דאפי (כחול).
    הערה: אזורים של גרעין התא, שבה K-Rta ולאנה הם שיתוף באשכולות, הם ולכן האמינו להיות מזוהה עם מפעלי שעתוק ויראלי ושכפול מורכבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול מעט המקוצרת בוצעה שבו תאים BCBL-1 שימשו, רק לאנה הרנ"א K-Rta היו מוכתמים (איור 1). הניסוי הזה מאפשר לנו לבחון היכן פעיל תעתיק episomes ויראלי והטרוגניות את התגובה לגירויים הפעלה מחדש KSHV בקרב אוכלוסיה של תאים. בתא שמציין החץ באיור1, ברורים K-Rta באזורים מתאימים במדויק את חלוקת episomes ויראלי (מסומן עם לנה) הוא ראיה שעתוק פעיל המתרחשים בקרבת KSHV הגנום. במדגם זהה, תאים כמו האחד המסומן באמצעות החץ בא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם כמה היבטים של פרוטוקול זה יכול להשתנות כדי להכיל את נסיבות יוצאות דופן. הבחירה של מאגרי קיבעון, permeabilization יכול גם להשתנות. למאגרי קיבעון, paraformaldehyde גם יעיל, אתנול יכול לשמש permeabilization.

להרוות את הפורמלדהיד עם גליצין ש-PBS מומלצת היא מונעת פורמלדהיד הפיכת הנוגדנים בהעדר אלבומין שור (BSA), אך אם coverslips נשטפים ביסודיות מספיק, ניתן לדלג לשלב PBS גליצין. בפרוטוקול, הימנע משימוש שור אלבומין כפתרון חסימה. לימודי טייס שנערך במעבדה Izumiya הראתה אותות RNA-דג חלש יותר, ככל ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחברי המאמר אין קשרים פיננסיים או מתחרים קונפליקטים של אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים גרנט (R01-DE025985) על ידי אמריקאי סרטן החברה מחקר מלומד פרס (RSG-13-383-MPC). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים החקלאות האמריקאי (2015-67015-23268 ו- 2014-67015-21787), מחקר חדש יוזמה גראנט מאוניברסיטת קליפורניה, דייוויס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMI בינוני 1650 GlutaMAXGibco מבית Life Technologies61870-036צריך לחמם ל-37 מעלות;
C סרום בקר עובריאומגה סיינטיפיק בע"מFB-11
Pen Strep Glutamine (100x)Gibco by Life Technologies10378-016
תימידין סיגמא אולדריץ'T9250
דולבקו s תמיסת פוספט חוצץGibco של Life Technologies14190-144
TPASigma AldrichP1585
נתרן בוטיראט סיגמא אולדריץ'B5887
תמיסת פורמלדהיד סיגמא אולדריץ'252549קורוזיבי, רעיל, סכנה בריאותית
דיאתיל פירוקרבונטסיגמא אולדריץ'D-5758רעילות חריפה 
גליציןסיגמא אולדריץ' 410225
אצטוןסיגמא אולדריץ'179124כימיקל פישר מתנול דליק ורעיל
 67-56-1חד שבטי דליק, רעיל, סכנה בריאותית
ל-KSHV/HHV-8 ORF73Advanced Biotechnologies13-210-100
אנטי-RNA פולימראז II נוגדן שיבוט CTD4H8EMD Milipore05-623
חומצה ריבונוקלאית, העברה מאופה' שמרים (S. cerevisiae) Sigma Aldrich9014-25-9
מאגר נתרן ציטראט מלוח 20x (SSC)Thermo Fisher Scientific 
פורממיד Sigma Aldrich295876
Omnipur Dextran Sulfate, תמיסה של 50%EMD Milipore1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher Scientific D1306
slowFade זהב נוגד דהייה מגיבLife TechnologiesS36936
זכוכית כיסוי מיקרו 22x22MatsunamiC022221
VoloCITYתוכנת הדמיה תלת מימדית
נוגדן 15557044 DeltaVision מיקרוסקופ Superfrost / Plus מיקרוסקופ שקופיות פישר סיינטיפיק 12-550-15

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
  2. Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
  3. Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
  4. Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
  5. Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
  6. Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
  7. Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
  8. Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
  9. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
  10. Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi's sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
  11. Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
  12. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30(2012).
  13. Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
  14. Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192(2007).
  15. Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
  16. Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300(2011).
  17. Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
  18. McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
  19. Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
  20. Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNA FISHRNA IIRNAan episome

מאמרים קשורים