כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

Takuma Iguchi; Noriyo Niino; Satoshi Tamai; Ken Sakurai; Kazuhiko Mori

doi:10.3791/56850

מאמר שיטה

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

DOI:

10.3791/56850

⸱

12 בפברואר 2018

Takuma Iguchi¹ , Noriyo Niino¹ , Satoshi Tamai¹ , Ken Sakurai¹ , Kazuhiko Mori¹

¹Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי עם או בלי הגברה מראש. פרוטוקול זה מאפשר הבנה טובה יותר של כמות פלזמה miRNAs ומאפשר הערכה איכותית של נתונים התואמים מחקרים שונים או מעבדות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RT-qPCR היא אחת השיטות הנפוצות להערכת miRNAs היעד בודדים. רמות MiRNAs בדרך כלל נמדדים ביחס דגימת. גישה זו מתאימה לבחינת שינויים פיסיולוגיים רמות הביטוי של גנים היעד. עם זאת, כימות מוחלט באמצעות ניתוח סטטיסטי יותר עדיפה עבור הערכה מקיפה של רמות ביטוי גנים. כימות המוחלט הוא עדיין לא במשותף להשתמש. הדו ח מתאר פרוטוקול למדידת ברמות המוחלטות miRNA פלזמה, באמצעות RT-qPCR עם או בלי הגברה מראש.

נפח קבוע (200 µL) של EDTA-פלזמה הוכן מהדם שנאסף וריד הירך cynomolgus בהכרה קופים (n = 50). סה כ RNA שהופק באמצעות מערכת זמינים מסחרית. פלזמה miRNAs היו לכמת על ידי המבוסס על בדיקה RT-qPCR מבחני אשר מכיל miRNA ספציפי לפנים/הפוכה PCR פריימר בדיקה. עקומות רגיל על כימות מוחלטת נוצרו תוך שימוש זמינים מסחרית oligonucleotides RNA סינתטי. סינתטי צ'ל-מיר-238 שימש פקד חיצוני להערכה נורמליזציה ואיכות. MiRNAs הראה כימות מחזור (סי) ערכים מעל 35 היו מראש מוגבר לפני השלב qPCR.

בין 8 miRNAs בחן, מיר-122, מיר-133a ומיר-192 היו לזיהוי ללא הגברה מראש, ואילו מיר-1, מיר-206 ו miR-499a הנדרש הגברה מראש בגלל רמות נמוכות הביטוי שלהם. MiR-208a מיר-208b היו לא לזיהוי גם לאחר הגברה מראש. הדגימה יעילות העיבוד הוערך על ידי ערכי סי מחודדים צ'ל-מיר-238. בשיטה זו assay, וריאציה טכני היה מוערך להיות פחות 3-fold, הגבול התחתון של כימות (LLOQ) היה העתק² 10/µL, עבור רוב miRNAs בחן.

פרוטוקול זה מספקת אומדן טוב יותר כמות פלזמה miRNAs, ומאפשרת הערכת איכות הנתונים המתאימים ממחקרים שונים. בהתחשב שהמספר הנמוך של miRNAs בנוזלי גוף, קדם הגברה שימושית לשפר זיהוי של גרוע הביע miRNAs.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר גדל והולך של מחקרים יש כבר חקר מיקרו Rna (miRNAs) כמו סמנים ביולוגיים עבור האבחון, הפרוגנוזה של סרטן, או ניטור וכן זיהוי מחלות אחרות מחקרים קליניים nonclinical¹^,²^,³. כמותיים שעתוק במהופך בזמן אמת PCR (RT-qPCR) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לשימוש לצורך הערכת miRNAs היעד בודדים, כי טכניקה זו הוא יותר רגיש ממה microarray⁴ ו- RNA רצף המבוסס על פלטפורמות⁵. באופן כללי, miRNA ביטוי נמדד ביחס דוגמה הפניה באמצעות שיטת ΔCq⁶. גישה זו מתאימה עבור חוקרים שינויים פיסיולוגיים רמות הביטוי של גנים היעד. עם זאת, כימו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של תחנת Sankyo ושות', בע מ

1. הכנת הדוגמא

לאסוף דם (לפחות 0.5 מ"ל) וריד הירך קופים cynomolgus לתוך צינורות 2K המכילה EDTA.
הערה: ציטראט הפארין אינם מקובלים כי אלה תרופות נגד קרישת דם לעכב PCR עוקבות¹⁴^,¹⁵.
במקום הדגימות שנאספו באופן מיידי על הקרח ותהליך לבידוד פלזמה תוך שעתיים של אוסף.
Centrifuge את הדגימות ב g x 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
להעביר את תגובת שיקוע microtube 2 מ"ל, ואחריו צנטריפוגה ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות להסיר שאריות תאים שיורית טסיות.<....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה של miRNA assay מאת RT-qPCR ו- assessmen איכותt
איור 1 מציג את זרימת העבודה של miRNA assay מדגימות דם באמצעות qPCR¹⁰. האיכות של הניסויים ניתנת לאימות כמקורית על-ידי הכללת צ'ל-מיר-238 כמו שליטה חיצונית. זה יחשוף טכני בווריאציות החילוץ-RNA ומעבד עוקבות RT-qPCR. במחקר זה, זאת אומרת ± SD מערכי סי שחושב מתוך 50 דגימות היה ± 21.0 0.4 (טבלה 1). אם צ'ל-מיר-238 היה מדולל בגלל השלב קדם הג.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להערכתנו, מקיף מספק ניתוח סטטיסטי קפדנית יותר של היקף הטווח הדינמי, אשר לציין בבירור סדר הגודל של וריאציה בין דוגמאות בודדות היה שונה מאוד בין miRNAs נבדק. למרות לווריאציות אלה ניתן לייחס שלהם כמויות קטנות של נוזלי הגוף, יצוין כי נתונים אלו משקפים לא רק הווריאציות ביולוגי, אלא גם וריאציות טכני. רוב וריאציית טכני ניתן לבדיקה באמצעות סי הערכים בפקד חיצוני (cel-מיר-238), אשר משמש פלטפורמות אחרות assay¹⁸. מאז היו ללא בקרה פנימית מתוקננת בניתוח miRNA, יש לכלול את המידע על וריאציה טכני בניתוח, לקביעת אי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר הזה לא קיבל כל מענק ספציפי מהארגונים במגזר הציבורי, מסחריים, או שלא למטרות רווח.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שפופרת BD Microtainer (K2EDTA)	בקטון, דיקינסון ושות'	365974	לאיסוף דם
צינורות Eppendorf PCR, 0.2 מ"ל	Eppendorf	0030124359
מבחנות מיקרו Eppendorf Safe-Lock 1.5 מ"ל	Eppendorf	0030120086
Eppendorf Safe-Lock מבחנות מיקרו 2.0 מ"ל	Eppendorf	0030120094
אוליגונוקלאוטיד סינתטי	Hokkaido System	Science-Individual	miRNA (0.2 μ מול, כיתה HPLC)
Tris-EDTA Buffer (pH 8.0)	Nippon Gene	314-90021	TE
מאגר מאגר RPE	QIAGEN-תוכן		בערכת מיני miRNeasy
מאגר RWT	QIAGEN-תוכן		בערכת מיני miRNeasy
miRNeasy Mini Kit	QIAGEN	217004
מים ללא נוקלאזים	QIAGEN	129114
QIAzol מגיב ליזה	QIAGEN-תוכן		בערכת מיני miRNeasy
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic	QIAGEN	219600	ID:MSY0000293, 5 ננומול
SC מתאמי	TAIGEN Bioscience Corporation	S0120	למיצוי RNA
VacEZor 36 מערכת שלמה	TAIGEN Bioscience Corporation	M3610	למיצוי RNA
7900HT מערכת PCR מהירה בזמן אמת	Thermo Fisher Scientific Inc.	4351405	מהירה של 96 בארות GeneAmp
9700	Thermo Fisher Scientific Inc.	9700
מיקרו-אמפר מהיר אופטי 96 באר צלחת תגובה	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ
4346907 סרט דבק אופטי MicroAmp	Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan Fast Advanced Master Mix	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ
TaqMan MicroRNA Astests (cel-miR-238-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	מזהה בדיקה: 000248
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-122-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	מזהה בדיקה: 002245
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-133a-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	מזהה בדיקה: 002246
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-1-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	מזהה בדיקה: 002222
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-192-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	מזהה בדיקה: 000491
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-206)	Thermo Fisher Scientific Inc.		4427975 מזהה בדיקה: 000510
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-208a-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	מזהה 4427975	בדיקה: 000511
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-208b-3p)	Thermo Fisher Scientific Inc.		4427975 מזהה בדיקה: 002290
TaqMan MicroRNA Astests (has-miR-499a-5p)	Thermo Fisher Scientific Inc.	4427975	מזהה בדיקה: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse ערכת שעתוק	Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan PreAmp Master Mix (2&)	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ
כלורופורם	Wako Pure Chemicals	035-02616
אתנול (99.5)	Wako Pure Chemicals	057-00456

מערכת PCR 4311971444455743665974391128

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicroRNA RT qPCR RNA

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים