הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

15.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57019

⸱

9 באפריל 2018

 ,  , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2University of Cincinnati College of Medicine, 3Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia

במאמר זה

סיכום

ב פרוטוקול זה, baculovirus המיוצר על ידי תרביות תאים ארעית של baculovirus פלסמיד לתאים Sf9, הגביר בתרבות ללא סרום ההשעיה. תגובת שיקוע מטוהרת על-ידי הפארין כרומטוגרפיית זיקה, עוד יותר מרוכז על-ידי ultracentrifugation. פרוטוקול זה שימושי עבור ייצור וטיהור של baculovirus עבור יישום טיפול גנטי.

תקציר

Baculovirus באופן מסורתי שימש לייצור חלבון רקומביננטי, חיסון. עם זאת, לאחרונה, baculovirus מתגלה כמו וקטור המבטיח ליישום טיפול גנטי. כאן, baculovirus מופק על ידי תרביות תאים ארעית של פלסמיד baculovirus ה-DNA (bacmid) ב תרבות חסיד של תאים Sf9. Baculovirus לאחר מכן מורחב בתאים Sf9 תרבות ללא סרום השעיה עד לנפח הרצוי מתקבל. זה לאחר מכן מטוהרים מתרבות supernatant באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפארין. וירוס supernatant הוא טעון על גבי העמודה הפארין אשר נקשר baculovirus חלקיקים ב תגובת שיקוע עקב בזיקה של הפארין עבור baculovirus אופפים גליקופרוטאין. העמודה נשטף עם מאגר כדי להסיר מזהמים, baculovirus היא eluted מן העמודה עם מאגר מלח גבוהה. Eluate הוא מדולל ריכוז מלח מול, baculovirus חלקיקים הם הרבה יותר מרוכז באמצעות ultracentrifugation. באמצעות שיטה זו, baculovirus יכול להיות מרוכז עד 500-fold עם החלמה 25% של חלקיקים זיהומיות. אף על פי הפרוטוקול המתואר כאן מדגים את הייצור ואת טיהור של baculovirus מתרבויות עד 1 L, השיטה יכול להיות קנה המידה להמציא בתרבות סגור-מערכת המתלים לייצר וקטור קליני-כיתה ליישום טיפול גנטי.

מבוא

Baculovirus משמשת בעיקר לייצור של חומרים וחיסונים ב lepidopteran זחל כנימה fugiperda (Sf) 9 תאים חרקים באמצעות רקומביננטי קליפורניה Autographa וירוס multicapsid polyhedrosis הגרעין (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. לאחרונה, זה מתגלה כמו וקטור מבטיח עבור ג'ין טיפול יישום5. זה ידוע tropism רחב של המארח ורקמות, מדביק פריט שקט וגם מתרבים תאים, פתוגניים שאינם, לא לשלב המארח כרומוזום4,5,6. יתר על כן, baculovirus יכול להיות מיוצר בתרבות ללא סרום ההשעיה היא מדרגית ומאפשר למערכת סגורה, עיבוד ייצור קליניים עתידיים1.

הטוהר של חלקיקים baculovirus חשוב להשגת התמרה חושית יעילה תוך מזעור cytotoxicity-7,-8,-9. להיות מרוכזת Baculovirus על ידי ultracentrifugation או זרימה וצורניים סינון (TFF) עם השפעה מוגבלת על infectivity שלה. עם זאת, נהלים אלה לא רק להתרכז חלקיקי וירוס אבל גם פסולת הסלולר וחלבונים מן Sf9 תרבות, אשר יכול להיות רעיל במבחנה (תצפית אישי), עלול לגרום לדלקת או תגובה חיסונית כאשר נעשה שימוש ב- vivo. כדי להימנע מכך, במיוחד בעת שימוש מאוד מרוכז וירוס מניות, baculovirus זיהומית צריך להיות מטוהרים הופרדו מזהמות חלקיקים.

דווחו מספר שיטות לטיהור ודה-ריכוז של baculovirus וקטורים10,11,12. גישות זמין, הפארין כרומטוגרפיית זיקה מאפשר צעד אחר צעד רמה גבוהה של טיהור עם ריכוז נמוך של מזהם חלבונים12. השיטה מבוססת על זיהוי הפאראן גופרתי כמו רצפטור baculovirus13,14. לאחר טעינת תגובת שיקוע תא Sf9 עמודה ועל הכריכה של baculovirus, ניתן לשטוף את העמודה עם הפיזיולוגיות מאגר (מול) כדי להסיר חלקיקים מזהמים באופן רופף מאוגד או לא מאוגד. מאז האיגוד כדי הפארין הוא הפיך, חלקיקי baculovirus יכול להיות eluted עם מאגר מלח גבוהה, אשר הוא מדולל מיד כדי הפיזיולוגיות ריכוז המלחים (מול) כדי למנוע איון-שוק אוסמוטי12. יתר על כן, הייצור של baculovirus, כמו גם לוכדים במחשבים ואת • תנאי מן העמודה כרומטוגרפיה, ניתן לבצע באמצעות תהליך מערכת סגורה אשר תואמת נוהלי ייצור טוב הנוכחי (cGMP).

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור ייצור, היטהרות, ריכוז של baculovirus זיהומיות באמצעות כרומטוגרפיית זיקה צנטריפוגה. בקצרה, אנו מייצרים baculovirus על ידי תרביות תאים תאים Sf9 עם פלסמיד baculovirus DNA בתרבות חסיד, להרחבה נוספת של baculovirus זיהומיות בתרבות ללא סרום ההשעיה. אנחנו לטהר baculovirus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה הפארין ועושים שימוש ultracentrifugation השלב הסופי להתרכז מאוד הווקטור ליישום טיפול גנטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ראה איור 1 איור המסכמת את הפרוטוקול.

1. טיהור של פלסמיד Baculovirus דנ א

  1. לגדול התרבות חיידקי המכיל baculoviral פלסמיד דנ א (bacmid)14 ב 200 מ ל מרק ליברות עם אנטיביוטיקה; kanamycin (50 µg/mL), טטרציקלין (10 µg/mL) ו gentamycin (7 µg/mL), עבור 16 h ב- 37 מעלות צלזיוס על הגדרה של חומרים מסוכנים-300 סל ד.
  2. לטהר את bacmid ה-DNA של התרבות חיידקי באמצעות פרוטוקול סטנדרטי פירוק אלקליין15, לפזר את bacmid במאגר טה.

2. הפקה של Baculovirus

  1. התרבות התאים Sf9 בתוך אינקובטור חומרים מסוכנים-135 סל ד ו- 28 מעלות צלזיוס פוליקרבונט הבקבוק Erlenmeyer המכיל סרום ללא חרקים בינוני תרבות1,2,3.
    הערה: אם תאים Sf9 הם הקרת במלאי קפואים, אפשר לפחות שבועיים עבור התאים לשחזר ולהזין השלב מעריכית של צמיחה.
  2. לספור את התאים Sf9 שנקטפו בשלב מעריכית של צמיחה עם hemocytometer לאחר צביעת עם Trypan blue. זרע עונה 1 פרק 106 Sf9 התאים קיימא לכל טוב בצלחת 6-ובכן תרביות רקמה שטופלו ב- mL 2 בינוני. לאפשר את התא לצרף עבור 1 h ב- 28 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור.
  3. החלף את מדיום הגידול 1 מ"ל של מדיום תרבות חרקים ללא סרום unsupplemented של גרייס.
  4. Transfect את bacmid DNA לתוך התאים Sf9 באמצעות ריאגנט תרביות תאים תאים חרקים.
    1. מיקס 8 µL תא חרקים תרביות תאים מגיב עם 100 µL של גרייס חרקים בינוני.
    2. למהול 2 µg של bacmid ה-DNA לתוך µL 100 unsupplemented חרקים בינוני ומערבבים בעדינות על-ידי vortexing.
    3. לשלב את ה-DNA מדולל עם הכימית תרביות תאים תאים חרקים מדולל, ומערבבים בעדינות. תקופת דגירה של 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. להוסיף את התערובת DNA-השומנים dropwise על התאים. דגירה-28 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור במשך כ- 5 שעות.
  5. הסר את התערובת תרביות תאים מתאי ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS.
  6. להוסיף 2 מ של חרקים בינוני תרבות ולהמשיך לתרבות ב 28 מעלות צלזיוס בתוך אינקובטור מבלי לשנות את המדיה.
    הערה: אם bacmid מכיל חלבון פלואורסצנטי, הביטוי שלה ניתן להבחין ב תאים תקנים לאחר 48 שעות. Baculovirus מיוצר על ידי תאים Sf9 transfected, ומופרש אל המדיום תרבות אשר לאחר מכן מדביק את התאים untransfected. האוכלוסייה התא כולו הופך להיות נגוע baculovirus תוך 5 ימים, מראה סימנים של זיהום ויראלי, הנקרא גם אפקט ציטופתי. אלה כוללים תאים מוגברת קוטר, וקואלות/granules ציטופלזמה, הפסקת צמיחת תאים, התאים מתים או lysed קיימים תרבית תאים. עם זאת, אם תרביות תאים או זיהום היעילות אינה אופטימלית, התרבות עשוי להציג לא ציטופתי ברור. ניתן לאבחן את אפקט ציטופתי עם מיקרוסקופ שלב הפוך ב- 200-400 X הגדלה. תא Baculovirus נגוע יכול יזוהו על-ידי מכתימה עם נוגדן anti-gp6411.
  7. הקציר baculovirus supernatant 5 ימים לאחר תרביות תאים ותווית כמו P1 וירוס המניה.
  8. לאחסן את baculovirus supernatant, אשר הוא רגיש אור, בחושך עם 0.5% אלבומין שור (BSA) ב- PBS. לאחסן ב 4 ° C לטווח קצר (עד 90 יום) או ב- 80 ° C לטווח הארוך.
  9. זרע 6 × 10 תאים6 Sf9 בצלחת ס מ-10 תרביות רקמה שטופלו ב- 10 מ"ל של חרקים בינוני תרבות. להוסיף 1 מ"ל של הראשונית baculovirus supernatant (P1) לתאים.
  10. הקציר baculovirus supernatant (P2) ב-th 5 יום לאחר הפגיעה.
  11. זרע 50 מ של תאים Sf9 (3 x 106 תאים/mL) בתרבות השעיה בתוך תרבות חרקים, במדיום 250-mL פוליקרבונט הבקבוק Erlenmeyer ומקום הבקבוק בתוך אינקובטור חומרים מסוכנים. להוסיף 2 מ"ל של P2 מניות לתאים וללחוץ על סל ד 135 תוך שמירה על טמפרטורת חום קבועה של 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלושה או ארבעה ימים לאחר ההדבקה, כלל האוכלוסיה תא Sf9 יראה ציטופתי, דבר שמעיד על ייצור גבוהה-כייל נוגדנים baculovirus.
  12. ברצף להגביר את supernatants baculovirus עד לנפח הרצוי מתקבל (P3, P4,...) על-ידי הגדלת 10 לנפח 50-fold של תרבית תאים בתוך כל זיהום לאחר מכן.
    הערה: P3 הוא 3rd עגול של זיהום באיזה 500 מ"ל לליטר 1 Sf9 תרבית תאים יכול להיות נגוע עם 10 עד 20 מ ל P2 baculovirus supernatant; P4 הוא 4th עגול של זיהום ב L איזה 5-10 של Sf9 תרבית תאים יכול להיות נגוע עם 100 עד 200 מ ל P3 baculovirus תגובת שיקוע, וכן הלאה. בדרך כלל, Sf9 תאים הם נזרע-3 × 106 תאים למ"ל בתקשורת תרבות סרום ללא חרקים.
  13. Centrifuge את baculovirus supernatant ב 1,000 x g למשך 30 דקות ב 4 ° C הסרת לכלוך הסלולר ולטפל baculovirus את supernatant עם 50 יחידות/mL נוקלאז (250 יחידות/µL של מניות) עבור 2 h ב 37 מעלות צלזיוס לעכל את ה-DNA ו RNA הגנומי. לסנן את supernatants דרך יחידת סינון 0.45 μm.

3. הכנת המערכת כרומטוגרפיה

  1. להכין את המערכת כרומטוגרפיה בשטיפת ברצף לדוגמה ומאגר הקווים כל במים סטריליים, 1 N נתרן הידרוקסידי, מים, לשטוף את מאגר (20 מ מ סודיום פוספט מאגר המכיל 150 מ מ כלוריד הנתרן, pH 7.0) בקצב זרימה ליניארי של 50 mL/min.
  2. להכין עמודה מיקרומטר הפארין 50 (10 × 10 ס מ, 7.9 מ"ל נפח עמודה (CV)) על-ידי הפעלת ברצף עמודה ניקוי מאגר (5 CV 20 מ מ סטרילי סודיום פוספט מאגר המכיל 2 מ' נתרן כלורי, pH 7.0) 5 חיץ שטיפת קורות חיים בקצב זרימה ליניארי של 7 mL/min.

4. טיהור של וקטור Baculovirus

  1. להגדיר את המערכת כרומטוגרפיה כדלקמן:
    1. השתמש המדגם טעינת כניסת יציאת עבור טעינת את baculovirus supernatant.
    2. השתמש הנמל כניסת מאגר A1 עבור טעינת מאגר לשטוף. להכין בקבוק לפחות 500 מ של מאגר לשטוף ולהניח הקו מאגר שטיפת לתוך הבקבוק.
    3. השתמש הנמל כניסת מאגר A2 עבור טעינת המאגר • תנאי (20 מ מ סודיום פוספט 1.5 M נתרן כלוריד, pH 8.0). להכין בקבוק עם פחות 500 מ"ל • תנאי מאגר ולמקם את הקו מאגר • תנאי לתוך הבקבוק.
    4. הכנס מספר 50 מ ל צינורות חרוט האספן שבר כדי לאסוף את העמודה baculovirus pass-through supernatant, המאגר לשטוף את baculovirus eluted.
  2. Equilibrate את העמודה הפארין בחמישה כרכים עמודה 7.9 מ ל (CVs) שטיפת מאגר (40 מ ל)-קצב זרימה ליניארי של 7.0 mL/min.
  3. לטעון 250 מ של baculovirus supernatant אל העמודה הפארין באמצעות המשאבה מדגם (כניסת דוגמת יציאת) של מערכת כרומטוגרפיה בקצב זרימה ליניארי של 2.0 mL/min.
  4. לרוץ 10 CVs (80 מ ל) שטיפת המאגר דרך העמודה הפארין בקצב זרימה ליניארי של 2.0 mL/min ועד העיקול ספיגת אולטרה סגול (UV) (280 ננומטר) חזר בסיסית והופך להיות יציב.
  5. Elute החלקיקים baculovirus מן העמודה הפארין 7.9 מ עם CVs 5 (40 מ ל) • תנאי מאגר בקצב זרימה ליניארי של 4.0 מ"ל לדקה Watch לשיא • תנאי חדה של חלבון-chromatogram כאשר החלקיקים baculovirus מביצועם מן העמודה הפארין.
  6. • תנאי שלאחר, מיד לדלל את תגובת שיקוע eluted baculovirus 10-fold שימוש 20 מ מ סודיום פוספט של מאגר מים כדי למנוע איון של חלקיקים baculovirus מהלם אוסמוטי במהלך צנטריפוגה עוקבות.
  7. מאגר µL 100 של כל אחד השברים, כולל הזרימה עמודה את דרך שנאספו במהלך הטעינה של תגובת שיקוע של baculovirus, המאגר לשטוף את eluate. להדביק את השברים baculovirus האלה כדי HT1080 כדי להעריך את תהליך החיטוי (ראו סעיף 6).
  8. נקה את העמודה עם עמודה ניקוי מאגר ומאגר לשטוף. לבסוף, יש לשטוף את העמודה עם 5 CV סטרילי 20% אתנול במים בקצב זרימה ליניארי של 7.0 mL/min ולאחסן ב 4 º C.
  9. שתנקה את המערכת בקבוקים עם מים, 1 N נתרן הידרוקסידי, שוב עם מים, 20% אתנול במים בקצב זרימה ליניארי של 50.0 mL/min ולאחסן את המערכת ב- 20% אתנול.

5. ריכוז של Baculovirus

  1. מראש לעקר את צינורות צנטריפוגה באמצעות החיטוי. להוסיף אמצעי שווה של baculovirus supernatant כל צינורות ultracentrifuge בשכונה תרביות רקמה. למדוד את המשקל של הצינורית על ידי איזון ולהתאים את המשקל של התוכן של הצינורות ultracentrifuge עם PBS סטרילי.
  2. מקם כל אחד הצינורות ultracentrifuge מנוגדים דלי של הרוטור SW 32 Ti.
  3. הפעל את ultracentrifuge ב 80,000 × g במשך 90 דקות ב 4 º C.
  4. פתח הצינורות ultracentrifuge בשכונה תרביות רקמה, גילוח ורחיצה כירורגית וארוקן את הנוזל מבלי להסיר בגדר baculovirus.
  5. Resuspend בגדר של כל שפופרת מאת נמרצות pipetting למעלה ולמטה עם 200 µL PBS המכילה 0.5% (w/כרך) BSA.
  6. להעביר את baculovirus מרוכז cryovials (50 עד 100 µL לכל מבחנה) ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס.

6. טיטור של Baculovirus

  1. יום לפני זיהום, לספור תאים HT1080 באמצעות hemocytometer לאחר צביעת תאים עם Trypan blue. 5 HT1080 זרע עונה 1 פרק 10 תאים לכל טוב בצלחת. ובכן 6 ב 2 מ"ל בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS). זרעי כמה בארות נוספות כדי לקבוע את המספר המדויק של תאים המצויים בזמן זיהום. התרבות התאים בתוך אינקובטור-CO 37 ° C ו-5%2.
    הערה: HT1080 תאים משמשים עבור טיטור כפי שהן מבטאות רמה גבוהה יותר של הפאראן גופרתי לעומת ה שאר תא שורות16. מאחר HT1080 תאים חסיד, טיטור הוא פשוט יותר וצורכת פחות זמן לעומת באמצעות טיטור מבוססי Sf9 המסורתי.
  2. ביום של זיהום, לקבוע את מספר התאים לכל טוב על ידי ספירת תאים מבארות. להדביק את התאים על-ידי הוספת את baculovirus המקורי מדולל אשר נקבעו הצידה לפני עמודה טיהור, ועם דוגמאות מן העמודה זרימה דרך, לשטוף, • תנאי שברים. עבור כל דגימה, לקבוע את דילול ואת נפח מדעית המבוססת על חלקיקים baculovirus זיהומית, להדביק כל טוב דולר.
  3. יומיים לאחר זיהום, לנתח את התאים עבור הביטוי של הגן עניין. התאים ניתן לנתח באמצעות cytometer זרימה אם הם מבטאים חלבון פלואורסצנטי (למשל GFP)17.
  4. לחשב את titers (זיהומיות יחידה לכל mL) מבוסס על מספר התאים המצויים בזמן של זיהום, גורם לדילול, אחוזי חלבון פלואורסצנטי בתאים תוך שימוש בנוסחה: (מספר תאים במהלך זיהום × אחוז חלבון פלואורסצנטי תאים חיוביים × דילול פקטור) / נפח של baculovirus ב mL.
    הערה: לדוגמה, אם המספר הכולל של תאים לכל טוב בזמנו של זיהום × 10 1.25, אחוז החלבון הניאון הוא 5%, הגורם דילול הוא 100, הנפח של baculovirus מדולל הוסיף 10 µL, כייל הוא 6 × 107 זיהומיות יחידות (IU) /mL.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול שהוצג הוא בדיאגרמת זרימה (איור 1). השלבים כוללים את תרביות תאים ארעית של תאים Sf9 עם bacmid דנ א כדי לייצר baculovirus בתרבות חסיד בצלחת, הגברה עוקבות ב תרבות ללא סרום ההשעיה, נוקלאז טיפול הבהרה על-ידי צנטריפוגה ולאחר סינון, ואחריו טיהור באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של הפארין ריכוז עם ultracentrifugation.

אחרי מפשיר, Sf9 תאים צריך לפחות שבועיים כדי לשחזר ולחתימה על השלב מעריכית של צמיחה. פעיל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול המובאת כאן מתאר את הייצור של baculovirus בתאים Sf9 בתרבות ההשעיה ולטיהור baculovirus באמצעות כרומטוגרפיית זיקה של הפארין. הפרמטרים המשמשים פרוטוקול זה למקסם את התשואה ולצמצם את איון של baculovirus זיהומית. פרוטוקול שסופק כאן מראה שהחלמה משופרת באופן משמעותי של חלקיקים baculovirus לעומת ושחזורים מושגת על-ידי אחרים9.

עקב המארחת רחב טווח ורקמות tropism, נערכו מספר מחקרים ב מערכת העצבים המרכזית, הכבד, עין, השחלה, הערמונית, ו testis עם baculovirus בתיווך גן משלוח

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

תודות

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי סטארט-אפ המימון של קרן המחקר (CCRF סינסינטי ילדים) ועד M.N. נתמך על ידי המרכז הלאומי עבור קידום מדעי Translational של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט הליבה החדשנית (ICG) פרס TR001425 UL1 מספר. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Akta Avant 150GE Healthcare28976337מערכת כרומטוגרפיה
POROS Heparin 50 µ m טורThermoFisher Scientific4333414עמוד הפרין
אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטרפריט שאינו קטלוגתרכיז וירוס במהירות
גבוהה צינור אולטרה-צנטריפוגהבקמן-קולטר326823תרכיז וירוס בחממת
שייקר מסלולית MaxQ 8000 במהירות גבוהה ThermoFisher Scientificפריט לא קטלוגשייקר לתרבית מתלה
250 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer ThermoFisherScientific238071 בקבוק לתרבית מתלה
1 ליטר צלוחיות ErlenmeyerThermoFisher Scientific238072בקבוק לתרבית תרחיף
מיקרוסקופ (Olympus CKX41)Olympusפריט שאינו קטלוגניטור וספירת תאים 
צנטריפוגה שולחניתThermoFisher Scientific75253839/433607לבירור של Baculovirus supernatant
50 מ"ל צינור חרוטיThermoFisher Scientific14-959-49Aלאיסוף צלחת Baculovirus supernatant
6 בארותThermoFisher Scientific07-200-80צלחת מטופלת בתרבית רקמות
צלחת 10 ס"מThermoFisher Scientific08-772Eצלחת מטופלת בתרבית רקמות
Stericup-HV, 0.45  ומיקרו; m, PVDFEMD-Milliporeיחידת סינוןSCHVU05RE
KanamycinThermoFisher Scientific15160-054
טטרציקליןסיגמא-אולדריץ'T7660
GentamycinThermoFisher Scientific15750-060
ערכת וקטור Bac-to-BacThermoFisher Scientific10360-014מערכת ביטוי Baculovirus
DH10B-T1R  תא מוכשרThermoFisher Scientific12331-013תא מוכשר למאגר TE bacmid
פריט פנימי שאינו קטלוג10 מ"מ Tris-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0.
ערכת Maxiprep פלסמידThermoFisher ScientificK2100-06לטיהור bacmid
תאי Sf9ThermoFisher Scientific11496-015תאי חרקים
גרייס' s תרבית תאי חרקים מדיוםThermoFisher Scientific11605-094מדיום טרנספקציה
PBSThermoFisher Scientific20012227תאי שטיפה, דגימות דילול
HyClone SFX-Insect cell mediaGE HealthcareSH30278.02מדיום גידול תאי חרקים ללא סרום בנזונאז
נוקלאזסיגמא-אולדריץ'E1014אנזים לפירוק DNA ו-RNA
Baculovirus פלסמיד (bacmid) DNAפנימיפריט שאינו קטלוגBacmid לייצור Baculovirus
Cellfectin II ThermoFisher Scientific10362מגיב טרנספקציה לתאי חרקים
אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA4737מייצב את Baculovirus
CryovialThomas Scientific1222C24של Baculovirus
HT1080ATCCCCL-121קו תאים פיברובלסטי
DMEMSigma-AldrichD6429צמיחה מדיה לקווי תאים
מאגר כביסהפנימיפריט שאינו קטלוג20 מילימול/ליטר מאגר פוספט המכיל 150 מילימול/ליטר נתרן כלורי
מאגר אלוטיוןפנימיפריט שאינו קטלוג20 מילימול/ליטר מאגר פוספט המכיל 1.5 מול/ליטר נתרן כלורי
מאגר ניקוי עמודותפנימי שאינו קטלוג20 מילימול/ליטר מאגר פוספט המכיל 2.0 מול/ליטר נתרן כלורי
מים סטרילייםבתוך הביתפריט שאינו קטלוגעבור Akta Avant ניקוי
נתרן הידרוקסידSigma-Aldrich1.09137עבור Akta Avant ניקוי
אתנולSigma-AldrichE7073עבור Akta Avant ניקוי
לאחסון קו תאים פריט

מקורות

  1. Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
  2. Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
  3. Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
  4. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  5. Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
  6. Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
  7. Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
  8. Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
  9. Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
  10. Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
  11. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071(2016).
  12. Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
  13. Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
  14. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  15. Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
  16. Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
  17. Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
  18. Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
  19. Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
  20. Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Sf9
ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.