הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

26K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57032

⸱

19 באוקטובר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of Neuropsychiatric Diseases and Cambridge-Suda (CAM-SU) Genome Resource Center, Soochow University, 2Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

תקציר

המכשול מעיים מגן נגד מיקרואורגניזם פתוגניים, הרעלן מיקרוביאלי. תפקידה מוסדר על ידי צומת חזק חדירות ושלמות תאי אפיתל, שיבוש של הפונקציה מכשול המעי תורמת התקדמות המחלה במערכת העיכול ומערכתית. שתי שיטות פשוטות מתוארים כאן כדי למדוד את החדירות של אפיתל המעי. במבחנה, קאקו-2BBe תאים הם מצופים בבארות תרביות רקמה כמו טפט ואת ההתנגדות החשמלית של transepithelial (TER) נמדד על ידי מד אפיתל (וולט/אוהם). שיטה זו שהתחפש בשל פעולה ידידותי למשתמש הדיר. אין ויוו, עכברים הם gavaged עם 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי, ריכוז FITC-לתוספי נמדדים סרום שנאספו דגימות עכברים כדי לקבוע את החדירות אפיתל. Gavage אוראלי מספק מנה מדויקת, ולכן היא השיטה המועדפת כדי למדוד את חדירות המעי ויוו. יחדיו, שתי שיטות אלו יכולים למדוד את החדירות של אפיתל המעי בתוך חוץ גופית ו ויוו, ומכאן לשמש כדי לחקור את הקשר בין מחלות ותפקוד מכשול.

מבוא

תאים אפיתל המעי אחראים לא רק על ספיגת חומרים מזינים, אך גם טופס מכשול חשוב כדי להתגונן מפני מיקרואורגניזמים פתוגניים ורעלים מיקרוביאלי. פונקציה זו מכשול המעי מוסדר על ידי צומת חזק חדירות ותא אפיתל שלמות1,2,3, תפקוד לקוי של הפונקציה מחסום האפיתל מזוהה עם מעי דלקתיות המחלה (מחלת המעי הדלקתי). הטבעת actomyosin perijunctional (PAMR) שוכנת בתוך התא הוא קשר הדוק ורציף צמתי צר. ההתכווצות של PAMR, אשר מווסת על ידי הרשת אור צולבות הקישור חוטים שרירן (MLC), חיוני לוויסות של צומת חזק חדירות4,5,6,7,8, 9,10. הגידול נקרוזה מקדם (TNF) הוא מרכזי מכשול המעי אובדן אפיתל המעי upregulating קולטני MLC קינאז (מיק) ביטוי וגרימת הפנמה occludin11,12,13.

יונים כגון Na+ ו- Cl– תוכלו לחצות את החלל paracellular על ידי מסלול נקבובית או דליפה14. האפיתל "דולף", שינויים ב- TER משקפים בעיקר צומת חזק שינו חדירות. טר המדידה היא גישה אלקטרופיזיולוגיות נפוץ לכמת צמוד לצומת פרמאביליות, בעיקר ל נה+ ו- Cl-, מבוסס על התנגדות של תא monolayers. סוגי תאים שונים, כולל תאים אפיתל המעי, תאי אפיתל ריאתי של תאי אנדותל כלי הדם, דווחו למדידות טר. היתרונות של שיטה זו הם כי TER המידות הם בלתי פולשני, ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר תאים חיים בזמן אמת. בנוסף, טר מדידה טכניקה שימושית עבור מחקרים רעילות התרופה15.

קאקו-2BBe תאים הם תאים אנושיים אפיתל המעי הגס אדנוקרצינומה עם מבנה ותפקוד הדומה הבדיל קטן בתאי אפיתל המעי: לדוגמה, תאים אלה יש microvilli ואנזימים הקשורים עם מברשת קטנה מעיים הגבול. לכן, monolayers קאקו-2BBe בתרבית מנוצלים כמודל במבחנה לבדיקת תפקוד המחסום.

בעכברים, דרך אחת ללמוד paracellular מעיים חדירות היא על ידי מדידת היכולת של FITC-לתוספי שיוקמו לומן לדם. לפיכך, חדירות המעי יכול להיות מוערך על ידי gavaging FITC-לתוספי ישירות לתוך ומדידה של זריחה בתוך הדם של עכברים. הפרוטוקול הבא מתאר שתי שיטות פשוטות כדי להעריך את חדירות אפיתל המעי גם במבחנה וגם בתוך vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים, שימוש בפרוטוקול של קיימברידג-סודה גנומית מרכז משאבים (פקה-סו), אוניברסיטת שבחיים.

1. ציפוי ותחזוקה של קאקו-2bbe על ממברנות פוליקרבונט נקבובי

  1. לגדל תאים בבקבוקון T75 עם מדיה (DMEM המכיל 10% FBS). מבחנות צריך להיות מוזן באופן קבוע, בהתאם צפיפות התאים.
    הערה: עבור ציפוי אופטימלית, התאים צריכים לחלק במהירות, בעלי צורה שטוחה "הביצה", המציינת כי תאים הם בשלב הצמיחה.
  2. לאחר תאים 80% confluent, לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהסיר את המדיה. לשטוף כל המדיה שיורית עם 1-2 מ של PBS סטרילי (ללא Ca2 +). Pipet 1.5 mL טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק ובעדינות סלע את הבקבוקון; אז, במקום את הבקבוקון בחממה 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בלי נדנדה.
  3. בעוד התאים הם trypsinizing, המקום מוסיף המכיל ממברנות פוליקרבונט נקבובי (גודל הנקבוביות, מיקרומטר 0.4; פני השטח, 0.33 ס מ2; ראה טבלה של חומרים) לוחות 24-. טוב. הוסף 1.0 מ"ל של תרבות התקשורת בבית הבליעה הבזליים (הרווח התחתונה של הקרום).
  4. Pipet מ של מדיה לתוך הבקבוק ואת נמרצות pipet התאים כנגד הצד + בקבוקי שתייה צידניות 5 - 10 פעמים כדי להשיג רופף, בודדים תאים או 2-3 תא מתגבש.
  5. צלחת 0.166 מ של תאים (להשגת יחס דילול של 1:8) אל החדר הפסגה (הרווח העליון של הקרום). דגירה ב 37 ° C עד 3 שבועות.
    1. להאכיל תאים שלוש פעמים מדי שבוע על ידי בקפידה כ רפה בעברית המדיה מן התא הבזליים של כל טוב באמצעות משאבה ללחץ. בעדינות לטפטף 1 מ"ל של מדיה לתוך התא הפסגה של כל הוספה.

2. השימוש אפיתל מטר (וולט/אוהם) למדידת טר

הערה: לאחר כשלושה שבועות של תרבות על ממברנות פוליקרבונט, קאקו-2BBe תאים הם מוכן למדידה טר.

  1. ללימודים ציטוקינים, יום אחד לפני המדידה, החלף את המדיה הבזליים המדיה המכילה 10 ננוגרם למ"ל של IFNγ. ביום של הניסוי, החלף את המדיה HBSS המכילים 2.5 או 7.5 ננוגרם למ"ל של TNF.
    הערה: טיפול IFNγ מגביר ביטוי הקולטן TNF 2 (TNFR2)16.
  2. כדי לתקן את המונה, הכנס האלקטרודה תיקון לתוך יציאת קלט ובחרו מצב "אוהם". התאם את הבורג R שם תואר עם מברג עד מד מציג קריאה של 1,000 Ω.
  3. לעקר את האלקטרודות על-ידי הצבתם אתנול 70% למשך 15-30 דקות ולאחר מכן אפשר אותם לאוויר יבש עבור שטיפה ס' 15 האלקטרודה בתקשורת תרבות תא ניסיוני.
  4. מאתחל את המחשב, ובחרו את מצב "אוהם". בזהירות המקום את הקצוות רב הגשרים אלקטרודה לתוך תא הבזליים, את הקצוות קצר אל החדר הפסגה. ודא כי האלקטרודות יותר לגעת בקרקעית של המנה, תוך שמירה על האלקטרודות קצר מתחת לפני השטח של התקשורת אבל מעל את הכיסויים תרביות רקמה. שמור האלקטרודות אנכי.
  5. למדוד את ההתנגדות של התוספות מדגם ומוסיף ריק (קרי, שהתרבות מוסיף ללא תאים אבל עם HBSS)-0, 1, 2, 3, 4 שעות לאחר הטיפול ציטוקין. להקליט את ההתנגדות.
  6. כדי להשיג עקביות על-פני צלחת שונה תבניות, לחשב התוצר של ההתנגדות ואת אזור ממברנה יעיל:
    figure-protocol-1
    עבור מוסיף 24-. ובכן, זהו אזור ממברנה יעיל 0.33 ס מ2.

3. מודל מאתר לתוספי סולפט נתרן (DSS)-induced קוליטיס

  1. להוסיף DSS מים בלוק ריכוז סופי של 3.5% (wt/כרך).
  2. לנהל 3.5% DSS לעכברים C57BL/6 זכר בן שבוע 8 עבור סכום כולל של 7 ימים. לתת שתייה רגילים ללא DSS בקרת עכברים.
    1. לעבור את המים המכילים DSS שתייה רגילים לאחר יום 7.
  3. שוקל עכברים ולהעריך קליניים עשרות העכבר כל כל יום. לנרמל את משקל הגוף של כל בעכבר כדי משקל הגוף הראשונית שלו. ציונים מוגדרים בהתאם לחומרת המחלה ע י ארבעה פרמטרים: צניחה של פי הטבעת (0-2), צואה עקביות (0-2), דימום (0-2), פעילות (0-2)5. לסכם את התוצאות של פרמטרים אלה בשביל ניקוד קליניים הסופי.
  4. כדי לנתח את המצב histopathological של רקמת המעי הגס, המתת חסד עכברים באמצעות הזרקת בקרום הבטן (i.p.) 1.2% (vol/כרך) Avertin (0.6 מ"ל/10 גרם משקל) 7 ימים טיפול פוסט-DSS. כדי להכין מלאי של 100% avertin, מערבבים 10 גרם של 2,2,2-tribromoethanol עם 10 מ ל אלכוהול טרט-ניטריט.  לאחסן בחושך ב 4 º C. כדי להשתמש, לדלל מניות 100% ל-2% במים.
  5. לבודד את המעי הגס ואת המעי האטום, למדוד את האורך של המעי הגס5.
  6. חותכים פלחי 0.5 ס מ מן המעי הדיסטלי תיקון צינור בז 15 מ"ל, המכיל 10 מ"ל של 10% פורמלין בן לילה. לשטוף את הרקמות קבוע עם אתנול מדורגת (75, 95 ו- 100%), קסילן. להטביע את הרקמות פרפין וחותכים סעיפים 6 מ מ עבור hematoxylin & אאוזין מכתים8.

4. מודדים את החדירות מחסום האפיתל DSS-induced קוליטיס בעכברים

  1. למדוד את החדירות מכשול 7 ימים לאחר תחילת ניהול DSS.
  2. ביום של וזמינותו, מהיר עכברים במשך 3 שעות.
  3. אוטוקלב gavage מחט כדי להבטיח עקרות, ואז gavage עכברים עם µL 150 80 מ"ג/מ"ל 4 kDa FITC-לתוספי במים סטריליים, ולשמור את לתוספי-FITC שאינן בשימוש כדי למדוד את העקומה רגיל אחרי אוסף סרום. שוקלים העכברים לחישוב חדירות.
    הערה: הפתרון FITC-לתוספי צריכה להיעשות במים.
  4. בעזרת זוג מספריים, קליפ קטע 1 ס מ של הזנב, לאסוף 100 µL של דם מן הזנב לתוך צינורות איסוף סרום. לסובב את הדם שנאספו ב 10,000 g x 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לדלל את הנסיוב 1:4 במים. כדי להפוך לסטנדרט לעקומה, לדלל שאינם בשימוש FITC-לתוספי עם מים ליד 1:300, 1:1, 000, 1:3, 000, 1:10, 000, 1:30, 000, 1: 100, 000, 1:300, 000, 1:1, 000, 000 ו- 1:3, 000, 000. להוסיף 100 µL/טוב של הסרום והדוגמאות עיקול רגיל 96-ובכן לוחות.
  6. קרא את זריחה בקורא צלחת עם פליטה עירור/528 485. לחשב את הערכים חדירות בהתבסס על העקומה סטנדרטי, להכפיל ב- 4 לתיקון הדילול.
  7. לחלק את הריכוז של FITC-לתוספי לפי המשקל לנרמל את הערכים (זה עוזר לנרמל את ההבדל בין FITC-לתוספי משלוח אם עכברים חולים. ואני איבדתי משקל).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בתרבות, קאקו-2BBe התאים ינבכ טפט, להבדיל לאט לתוך בוגרת enterocytes ספיגת ידע שיש גבולות מברשת. ב פרוטוקול זה, קאקו-2BBe תאים מצופים עם צפיפות גבוהה על ממברנות פוליקרבונט, והגיע תאים 100% confluency יום אחד לאחר זריעה. עם זאת, תאים הם מובחן בשלב זה: להבחין באופן מלא את התאים, התקשורת השתנתה כל 2-3 ימים למשך 3 שבועות. התאים היו מוכתמים גרעינים, F-אקטין כתמי כדי להציג את ההבדלים בין תאים מובחן ו הבדיל. סיבי סטרס נראים בבירור בתאים מובחן. לעומת תאים מובחן, תאים יש אמצעי אחסון קטן יותר, גרעינ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. קאקו-2BBe (מברשת הגבול-לבטא) תאים משמשים תמיד למדידה טר, שנבחרו מתוך שורת תאים קאקו-2 עבור ביטוי של חלבונים מברשת-הגבול. קאקו-2BBe התאים להיות פנוטיפ ספיגת ידע סיסי כאשר הבדיל לחלוטין (לאחר כשלושה שבועות של תרבות פוסט-הנהרות)17. זה הכרחי כדי למנוע זיהום במהלך המדידה, וכדי לעקר את האלקטרודה. מאחר שההליך שאינו סטרילי, ניתן לבצע מדידות בלבד עבור עד 8 שעות ברוב המקרים. במהלך המדידה, אנחנו נקבע את הערך ההתנגדות של שתי נקודות בתוך ומחוץ את תותב. המדידות ההתנגדות באתרים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים ד ר ג'רלד ר טרנר, מן בריגהם אנד וימנס, הספר לרפואה בהרווארד, על עזרתו הנדיבה השלמת המחקר הזה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט מספר 81470804, 31401229 ו- 81200620), את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (גרנט מספר BK20180838, ו BK20140319), תוכנית חדשנות מחקר עבור המכללה הבוגרים של מחוז ג'יאנגסו (גרנט מספר KYLX16-0116), מתקדם פרוייקטים של שבחיים אוניברסיטת מחקר (גרנט מספר SDY2015_06), ו קרוהן & קוליטיס קרן מחקר מלגת פרס (להעניק מספר 310801).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 22 G gavageVWR20068-608
4 kDa FITC-dextranSigma46944
AvertinSigmaT48402
צלחות שחורות 96 בארות לפלואורסצנטיפישר14-245-197A
C57/B6 עכבריםמכון המחקר הביו-רפואי של אוניברסיטת
תאי Caco-2BBeATCCCRL-2102
דקסטרן סולפט נתרןMP ביו-רפואי2160110
DMED עם גלוקוז גבוה ונתרן פירובטHycloneSH30243.01B
מד אפיתל (וולט/אוהם)Millicell-ERSMERS00002
אתנולסינופארם כימיריאגנט10009218
צינור פלקון (15 מ"ל)קורנינג
FBSGibco10437-028
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסFV1000
פלואורומטרביוטקסינרגיה 2
HBSS138 מ"מ NaCl, 0.3 מ"מ Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 מ"מ KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 מ"מ CaCl2, 25 mM גלוקוז 
IFNgPeproTech315-05-20
מרכז הטמעת רקמות מודולריLeicaEG1150H
צינורות איסוף סרוםSarstedt41.1378.005
T75 בקבוקקורנינג430641
TNFPeproTech315-01A
ParraffinSigmaA6330-1CS
ממברנות פוליקרבונט (Transwell)משאבת לחץ Costar3413
AUTOSCIENCEAP-9925
מיקרוטומיה סיבוביתLeicaRM2235
Trypsin-EDTAGibco25200-056
קסילןסינופארם כימיריאגנט10023418
נאנג'ינג430791

מקורות

  1. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
  2. Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).
  3. Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets. J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).
  4. Clayburgh, D. R., et al. A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability. J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).
  5. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).
  6. Su, L., et al. Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis. Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).
  7. Zha, J. M., et al. Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells. Gene. 588, 1-6 (2016).
  8. He, W. Q., et al. Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1. Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).
  9. He, W. Q., et al. Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice. Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).
  10. Li, H. S., et al. Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development. Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).
  11. Clayburgh, D. R., et al. Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo. J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).
  12. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).
  13. Ye, D., Ma, T. Y. Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity. J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).
  14. Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability. Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Wang, F., et al. IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction. Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).
  17. Peterson, M. D., Mooseker, M. S. Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2. J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).
  18. Wang, L., et al. Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease. J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חדירות אפיתל המעיהתנגדות חשמלית טראנס-אפיתליתתאי Caco-2BBeבדיקת FITC Dextranשיטת גבג'ה (Gavage) אוראליתקוליטיס מושרית DSSמדידת TERשכבת מונולייר של תרבית תאיםזיהוי פלואורסצנציהניתוח היסטופתולוגי
במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.