שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
המכשול מעיים מגן נגד מיקרואורגניזם פתוגניים, הרעלן מיקרוביאלי. תפקידה מוסדר על ידי צומת חזק חדירות ושלמות תאי אפיתל, שיבוש של הפונקציה מכשול המעי תורמת התקדמות המחלה במערכת העיכול ומערכתית. שתי שיטות פשוטות מתוארים כאן כדי למדוד את החדירות של אפיתל המעי. במבחנה, קאקו-2BBe תאים הם מצופים בבארות תרביות רקמה כמו טפט ואת ההתנגדות החשמלית של transepithelial (TER) נמדד על ידי מד אפיתל (וולט/אוהם). שיטה זו שהתחפש בשל פעולה ידידותי למשתמש הדיר. אין ויוו, עכברים הם gavaged עם 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-לתוספי, ריכוז FITC-לתוספי נמדדים סרום שנאספו דגימות עכברים כדי לקבוע את החדירות אפיתל. Gavage אוראלי מספק מנה מדויקת, ולכן היא השיטה המועדפת כדי למדוד את חדירות המעי ויוו. יחדיו, שתי שיטות אלו יכולים למדוד את החדירות של אפיתל המעי בתוך חוץ גופית ו ויוו, ומכאן לשמש כדי לחקור את הקשר בין מחלות ותפקוד מכשול.
מבוא
תאים אפיתל המעי אחראים לא רק על ספיגת חומרים מזינים, אך גם טופס מכשול חשוב כדי להתגונן מפני מיקרואורגניזמים פתוגניים ורעלים מיקרוביאלי. פונקציה זו מכשול המעי מוסדר על ידי צומת חזק חדירות ותא אפיתל שלמות1,2,3, תפקוד לקוי של הפונקציה מחסום האפיתל מזוהה עם מעי דלקתיות המחלה (מחלת המעי הדלקתי). הטבעת actomyosin perijunctional (PAMR) שוכנת בתוך התא הוא קשר הדוק ורציף צמתי צר. ההתכווצות של PAMR, אשר מווסת על ידי הרשת אור צולבות הקישור חוטים שרירן (MLC), חיוני לוויסות של צומת חזק חדירות4,5,6
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מחקר זה אושרה על ידי טיפול בעלי חיים, שימוש בפרוטוקול של קיימברידג-סודה גנומית מרכז משאבים (פקה-סו), אוניברסיטת שבחיים.
1. ציפוי ותחזוקה של קאקו-2bbe על ממברנות פוליקרבונט נקבובי
- לגדל תאים בבקבוקון T75 עם מדיה (DMEM המכיל 10% FBS). מבחנות צריך להיות מוזן באופן קבוע, בהתאם צפיפות התאים.
הערה: עבור ציפוי אופטימלית, התאים צריכים לחלק במהירות, בעלי צורה שטוחה "הביצה", המציינת כי תאים הם בשלב הצמיחה. - לאחר תאים 80% confluent, לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהסיר את המדיה. לשטוף כל המדיה שיורית עם 1-2 מ של PBS סטרילי (ללא Ca2 +). Pipet 1.5 mL טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק ובעדינות סלע את הבקבוקון; אז, במקום את הבקבוקון בחמ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בתרבות, קאקו-2BBe התאים ינבכ טפט, להבדיל לאט לתוך בוגרת enterocytes ספיגת ידע שיש גבולות מברשת. ב פרוטוקול זה, קאקו-2BBe תאים מצופים עם צפיפות גבוהה על ממברנות פוליקרבונט, והגיע תאים 100% confluency יום אחד לאחר זריעה. עם זאת, תאים הם מובחן בשלב זה: להבחין באופן מלא את התאים, התקשורת השתנתה כל 2-3 ימים למשך 3 שבועות. התאים היו מוכתמים גרעינים, F-אקטין כתמי כדי להציג את ההבדלים בין תאים מובחן ו הבדיל. סיבי סטרס נראים בבירור בתאים מובחן. לעומת תאים מובחן, תאים יש אמצעי אחסון קטן יותר, גרעינ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. קאקו-2BBe (מברשת הגבול-לבטא) תאים משמשים תמיד למדידה טר, שנבחרו מתוך שורת תאים קאקו-2 עבור ביטוי של חלבונים מברשת-הגבול. קאקו-2BBe התאים להיות פנוטיפ ספיגת ידע סיסי כאשר הבדיל לחלוטין (לאחר כשלושה שבועות של תרבות פוסט-הנהרות)17. זה הכרחי כדי למנוע זיהום במהלך המדידה, וכדי לעקר את האלקטרודה. מאחר שההליך שאינו סטרילי, ניתן לבצע מדידות בלבד עבור עד 8 שעות ברוב המקרים. במהלך המדידה, אנחנו נקבע את הערך ההתנגדות של שתי נקודות בתוך ומחוץ את תותב. המדידות ההתנגדות באתרים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים ד ר ג'רלד ר טרנר, מן בריגהם אנד וימנס, הספר לרפואה בהרווארד, על עזרתו הנדיבה השלמת המחקר הזה. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט מספר 81470804, 31401229 ו- 81200620), את מדעי הטבע קרן של מחוז ג'יאנגסו (גרנט מספר BK20180838, ו BK20140319), תוכנית חדשנות מחקר עבור המכללה הבוגרים של מחוז ג'יאנגסו (גרנט מספר KYLX16-0116), מתקדם פרוייקטים של שבחיים אוניברסיטת מחקר (גרנט מספר SDY2015_06), ו קרוהן & קוליטיס קרן מחקר מלגת פרס (להעניק מספר 310801).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחט 22 G gavage | VWR | 20068-608 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | 46944 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| צלחות שחורות 96 בארות לפלואורסצנטי | פישר | 14-245-197A | |
| C57/B6 עכברים | מכון המחקר הביו-רפואי של אוניברסיטת | ||
| תאי Caco-2BBe | ATCC | CRL-2102 | |
| דקסטרן סולפט נתרן | MP ביו-רפואי | 2160110 | |
| DMED עם גלוקוז גבוה ונתרן פירובט | Hyclone | SH30243.01B | |
| מד אפיתל (וולט/אוהם) | Millicell-ERS | MERS00002 | |
| אתנול | סינופארם כימיריאגנט | 10009218 | |
| צינור פלקון (15 מ"ל) | קורנינג | ||
| FBS | Gibco | 10437-028 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | אולימפוס | FV1000 | |
| פלואורומטר | ביוטק | סינרגיה 2 | |
| HBSS | 138 מ"מ NaCl, 0.3 מ"מ Na2HPO4, 0.4 mM MgSO4, 0.5 mM MgCl2, 5.0 mM KCl, 0.3 מ"מ KH2PO4, 15.0 mM HEPES, 1.3 מ"מ CaCl2, 25 mM גלוקוז | ||
| IFNg | PeproTech | 315-05-20 | |
| מרכז הטמעת רקמות מודולרי | Leica | EG1150H | |
| צינורות איסוף סרום | Sarstedt | 41.1378.005 | |
| T75 בקבוק | קורנינג | 430641 | |
| TNF | PeproTech | 315-01A | |
| Parraffin | Sigma | A6330-1CS | |
| ממברנות פוליקרבונט (Transwell) | משאבת לחץ Costar | 3413 | |
| AUTOSCIENCE | AP-9925 | ||
| מיקרוטומיה סיבובית | Leica | RM2235 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| קסילן | סינופארם כימיריאגנט | 10023418 |
מקורות
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).
- Odenwald, M. A., Turner, J. R. The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target? Nature reviews. Gastroenterology & ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
