מאמר שיטה

שיטה פשוטה ויעילה In Vivo מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב באמצעות הזרקת Intramyocardial בעכברים

DOI:

10.3791/57074

⸱

16 באפריל 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה, הלבבות העכבר היו מוחצן בחלל הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, adenoviruses גנים ספציפיים קידוד הוזרקו מזרק לתוך שריר הלב, ואחריו מדידה ביטוי חלבון באמצעות הדמיה ויוו ומערביות כתם ניתוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מניפולציה ג'ין במיוחד בלב פלאטין באופן משמעותי את החקירה של מחלות לב pathomechanisms, הפוטנציאל הטיפולי שלהם. In vivo המסירה הגן הספציפי דום לב מושגת בדרך כלל על ידי משלוח מקומי או סיסטמי. הזרקת מערכתית דרך וריד הזנב היא קלה ויעילה לתמרן את ביטוי גנים הלב באמצעות וירוס רקומביננטי adeno-הקשורים 9 (AAV9). עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור עבור התמרה חושית יעילה, עלול לגרום איברים nontarget ג'ין התמרה חושית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה ו לחיסכון בזמן של הזרקת intramyocardial עבור ויוו מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב בעכברים. תחת הרדמה (ללא אוורור), שרירי החזה ראשיות ומשניות היו גזור בלשון בוטה, בלב העכבר נחשף במהירות על-ידי הוצאתו ידני דרך חתך קטן ברווח הבין-צלעי הרביעי. לאחר מכן, אדנו קידוד לוציפראז (לוק), קולטן ויטמין D (VDR), או סיכת ראש קצר RNA (shRNA) מיקוד VDR, הוזרק עם מזרק המילטון לתוך שריר הלב. הדמיה עוקבות ויוו הפגינו שלוציפראז הזה היה בהצלחה overexpressed באופן ספציפי בלב. יתר על כן, ניתוח תספיג אישר את ביטוי מוצלח או להחרשת VDR בלב העכבר. לאחר mastered, ניתן להשתמש בטכניקה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים כגון nanogels בלב העכבר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת לב היא הגורם המוביל של התחלואה והתמותה ברחבי העולם1,2. העדר אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות עבור הלב מסכני כולל אוטם שריר הלב, אי ספיקת לב מושך אינטנסיבית חקר pathomechanisms כבסיס וזיהוי של אפשרויות טיפוליות הרומן3. עבור האלה החקירות מדעי, מניפולציה ג'ין ספציפיות הלב הוא בשימוש נרחב4,5. מניפולציה ג'ין הלב יכולה להיות מושגת על ידי הגנום עריכת בעזרת נוקלאז activator דמוי אפקטור את תמלול חזק (TALEN), מקובצים באשכולות חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) / CRISPR הקשורים חלבון 9 (Cas9) כלים, או דרך אספקה של חומרי גנטי חוץ רחמי (למשל, וקטורים וירוס נושאת גנים קידוד חלבונים עניין)6. למרות הגנום עריכה מאפשר שינויים הגנום ייתכן ומדויק בעכברים חי, זה עדיין מהגידולים ועתירת תרגול6. לחלופין, מניפולציה ג'ין הלב ספציפיים על-ידי וירוס וקטוריים או הפרעה קטנה מסירה מורכבת RNA (siRNA) יש לבצע6.

וירוס משלוח וקטור ללב העכבר למבוגרים מושגת על ידי בערך שתי אסטרטגיות: הזרקה מקומית או מערכתית. הזרקת מערכתית של cardiotropic serotype של AAVs כגון AAV9 היא לא פולשנית הלב גנים ספציפיים מניפולציה7. עם זאת, שיטה זו דורשת כמות גבוהה יחסית של וקטור הכרחי עבור התמרה חושית יעילה של ביטוי גנים, עלול לגרום משמעותי התמרה חושית של איברים nontarget כגון שרירים, כבד7. הזרקת וירוס המקומית מושגת על ידי הזרקת intramyocardial או משלוח intracoronary7. משלוח intracoronary מוביל הפצת וירוס בתוך הלב לעומת הזרקה intramyocardial אפילו יותר. עם זאת, החסרונות של שיטה זו הם כביסה מהירה החוצה של וקטורים ויראלי מחזור מערכתי, התמרה חושית איברים nontarget8, וכן את הדרישה של מכשירי מדידת לחץ במהלך המבצע. לעומת זאת, מאפשר הזרקת intramyocardial השמירה וירוסים יותר שריר הלב, כמו גם משלוח באתר מסוים, אבל זה נכשל לפיזור אחיד ויראלי וקטור7. לבעלי-חיים קטנים, משלוח intracoronary קשה מבחינה טכנית לבצע, בעוד הזרקת AAV9 מערכתית, הזרקת intramyocardial הם יותר נפוץ התאמן4,5,7. למרות הזרקת מערכתית הוא קל לביצוע, הזרקת intramyocardial המקובלת דורש אוורור מכני ניקור חזה גורמת נזק לרקמות נרחב, הרבה זמן.

בדו ח זה, אנחנו תיאר שיטה נוחה לחיסכון בזמן, יעילה במיוחד עבור intramyocardial הזרקה. אדנו קידוד לוציפראז VDR, או shRNA מיקוד VDR, הוזרק לתמרן ביטוי גנים הלב. לאחר mastered, ניתן להשתמש בשיטה זו מניפולציה ג'ין, כמו גם הזרקת תאים או חומרים אחרים בלב העכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של הבריאות הנחיות על שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעל חיים של המכון. עכברים C57BL/6J זכר (בגילאי 8-10 שבועות) שימשו כל הניסויים. עכברים שוכנו בתנאים ללא הפתוגן ב 24 ° C ± 4 ° C, תחת מחזור/כהה 12-h, עם גישה חופשית מים ומזון.

1. הכנת אדנו פתרון

  1. עם ההגעה של הפתרון אדנו מטוהרים, לאחסן את הפתרון במקפיא-80 ° C.
    הערה: הזריקה אדנו בוצעה בעכברים קיימא. כדי להבטיח העקרות של וקטור אדנו, אדנו (לוציפראז קידוד, VDR או shRNA מיקוד VDR) הוכנו וטיהרו מסחרית9,10.
  2. ביום של הניתוח, להוציא את הפתרון אדנו מטוהרים (3 x 1010 פלאק ויוצרים יחידות [pfu] /mL) מהמקפיא-80 ° C, להפשיר פתרון וקטור אדנו על קרח.
  3. לשים על facemask כפפות סטריליות, שמלת סטרילי.
  4. הכנת 50-µL של מזרק המילטון אשר יש עברו עיקור כפוי יום לפני הניתוח.
    הערה: עבור עיקור, המזרק המילטון היה עטוף גזה והניח מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה. המצב של "עיקור עבור המוצק" נבחר והחלה עיקור היה על-ידי לחיצה על כפתור "התחל".
  5. לאחר מלאה הפשרתו של הפתרון אדנו מטוהרים, לרסס את הצינור המכיל אדנו פתרון עם 75% אתנול, להעביר את הפתרון אדנו לתוך תא סטרילי למינארי.
  6. ב תא סטרילי למינארי, תשאף 50 µL אדנו פתרון באמצעות המזרק המילטון ללא מחט, ואחריו מצורף של מחט 30 G כדי המזרק המילטון.
  7. . תחזיק את המזרק עם המחט 30 G כלפי מעלה, דחף בעדינות את הבוכנה של המזרק עד המחט מתמלא פתרון אדנו (אושר על ידי הופעת הטיפות הפתרון הראשון מהקצה מחט).
    הערה: זה לוקח כ 45 µL פתרון כדי למלא את המחט 30 G, אז עכשיו כמעט אין פתרון מוצגת במזרק.
  8. משתמשת במזרק מוכן לעיל לרוקן בזהירות אחר פתרון אדנו µL 30 ולמקם את המזרק רצ'ט באופן רופף על הקרח לשימוש עוקבות.

2. הרדמה והכנות פעיל

  1. להוסיף 20 מ"ל איזופלוריין לתוך מכשיר אידוי איזופלוריין, והתחבר מאדה איזופלוריין את מיכל חמצן.
  2. פתח את השסתום. ותן את החמצן זרימת ממיכל חמצן מאדה איזופלוריין. לשמור על קצב הזרימה חמצן ב 2 ל'/דקה באמצעות צג זרימת חמצן במאדה איזופלוריין.
  3. לגרום הרדמה של העכבר עם 4% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) למשך 2 דקות בתוך כלוב מפלסטיק מחובר מאדה איזופלוריין.
  4. להוציא את העכבר anesthetized מן הכלוב פלסטיק, לאבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה ב תא סטרילי למינארי ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין 100% חמצן (2 ל'/דקה) באמצעות קונוס האף.
  5. לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.
  6. קרם עיניים סטרילי חלות על כל עין כדי להגן על הקרנית מפני ייבוש.
  7. מגלח את החזה והבטן העליונה. להחיל קרם depilatory הנמכרים באתר מגולח עבור מינימלית 1 להסיר את הקרם depilatory, שנותרו פרווה עם פדים רטוב.
  8. לחטא באתר כירורגית (החלק התחתון השמאלי של החזה) עם 3 קרצוף של חיטוי יוד-chlorhexidine מבוסס (למשל entoiodine). מכסים באתר כירורגית עם תלוי סטרילי.

3. Intramyocardial הזרקה של אדנו בלב העכבר

  1. . תוריד את הכפפות ולהניח על זוג חדש של כפפות סטריליות.
  2. לחטא מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים, זוג מספריים כירורגיים, ולחץ בעל מחט ביום שלפני הניתוח בקול רם טמפרטורה/גבוהה מעקר (ראה הערה שלב 1.4).
  3. עושים חתך בעור 0.5 ס מ לאורך הקו המחבר בין מצאתי את בית השחי. בלשון בוטה לנתח את החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן עם מלקחיים, עוצר דימום מיקרו-יתושים.
  4. לחשוף את בצלעות על ידי מפסק את החזה הגדולים ואת שרירי החזה משנית. . נקבי ופתח לחלל הבין-צלעי הרביעי (או לחלל הבין-צלעי הרחב באמצעות התבוננות) עם עוצר דימום מיקרו-יתושים.
  5. לדחוף הלב לכיוון החתך כדי להחצין את הלב עם האצבע המורה. של היד-הדומיננטי בהקשת בעדינות כנגד הצד הימני של הקיר החזה.
  6. בעדינות לאבטח את הלב מוחצן עם האצבע והאגודל של היד האחרת.
  7. להזריק סך של 30 µL אדנו פתרון לתוך שריר הלב של החדר השמאלי בשלושה אתרים (הגחון, הגבי ו לרוחב הקיר של החדר השמאלי) באמצעות המזרק המילטון מלא עם אדנו (איור 1C) עם היד הדומיננטית.
  8. לאחר סיום הזרקה, מיד מקום הלב בחזרה לחלל intrathoracic.
  9. לפנות באופן ידני את האוויר בחלל intrathoracic בהקשת קיר החזה בעדינות לכיוון מקום החתך בעור.
    הערה: פינוי אוויר מוצלח יכול להיות שמעידים נפנוף של החזה גדול, שרירי החזה קטין הנגרמת על ידי האוויר גורשו.
  10. לסגור את העור על ידי מזרון אופקי תפר בתפר משי 5-0.
    הערה: החזה הגדולים ואת שרירי החזה קטן צריך לא להיות sutured, כי הם רק בלשון בוטה ביתר מבנים אנטומיים שלהם ניזוקו במהלך הפעולה.

4. לאחר הניתוח ניהול

  1. לנהל הבופרנורפין (3 מ"ג/ק"ג) פעמיים מדי יום באמצעות הזרקה תת-עוריים כדי להפחית את הכאב עבור ה 48 הראשון אחרי מבצע11.
  2. לאחר המבצע, מיד לשמור על העכברים על משטח חום (37 מעלות צלזיוס) עד החלים לחלוטין. הנח את העכבר בחזרה לכלוב לאחר מלא התאוששות מתקלה.
  3. לחטא את המזרק המילטון בשימוש ואת מחט מזרק 30 G מעקר לחץ טמפרטורה גבוהה/גבוהה (ראה הערה שלב 1.4). לאסוף את המחט מזרק 30 G סטיריליים במיכל החדים.

5. דימות in Vivo למדידת ביטוי לוציפראז הלב

  1. ביום 5 לאחר ההזרקה אדנו, להכין פתרון מניות טריים של luciferin ב- 15 מ ג/מ ל תמיסת מלח פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.2 µm.
  2. Intra-peritoneally להזריק העכברים ער הפתרון luciferin-150 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
  3. הפעל את מערכת הדמיה.
  4. לאחר אוטומטי בדיקה עצמית של מערכת ההדמייה, לבחור את מצב הדמיה כמו "זורח" ובצע את ההגדרות הבאות: חשיפה: אוטומטי; Binning: 8; FStop: 1; עירור: לחסום; פליטה: פתוח.
  5. ב- 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, עזים ומתנגד העכברים בזריקה כלורין (300 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאשר הרדמה נאותה על ידי העדר תגובה קמצוץ הבוהן.
  6. לאבטח העכברים anesthetized על הבמה הדמיה מחומם במצב שכיבה, עם החזה לכיוון המצלמה.
  7. לאסוף תמונות (תמונה 1 עבור כל עכבר) ולכמת את עוצמת האותות על ידי ציור זהה מדידה מעגלית אזורים מעניינים (ROI) סביב בית החזה.
  8. לאחר האוסף של תמונות, להקריב את העכברים ולאסוף את הרקמות כאמור בסעיף הבא.

6. קצירת רקמות

  1. בנקודות זמן שונות לאחר הזרקת וירוס (איור 1B), עזים ומתנגד העכברים עם 4% איזופלוריין, ו לשמור על הרדמה עם 2% איזופלוריין באמצעות קונוס האף ואבטח אותו על משטח פלסטיק במצב שכיבה.
  2. עושים חתך הגחון קו האמצע בצוואר הקדמי. חושפים את עורק תרדמני של ממש על ידי מפסק השרירים omohyoid, שריר הצוואר.
  3. להקריב את העכברים מאת transecting עורק תרדמני נכון, וגומר את הדם.
  4. עושים חתך הגחון קו האמצע בבטן. לחתוך את הצלעות משני צידי הצלעות לאורך הקו midclavicular, ו transect הסרעפת.
  5. לחשוף את הלב על-ידי הרמת מצאתי. לאתר של אבי העורקים ולהסיר בעדינות את רקמת השומן perivascular.
  6. נקרר אבי העורקים, retrogradely perfuse את הלב עם מחט 30 G המצורפת מזרק 1 מ"ל מלא 0.5 מ של 4 ° C בופר פוספט (PBS).
  7. לאחר זלוף, לסלק את הלב, ומחלקים אותו לתוך מתגלה ימינה ושמאלה. לסלק את הכבד, הריאות, הטחול.
  8. לאחר שני שוטף ב- PBS קר (4 ° C), לאחסן כל רקמות שנאספו בנפרד בקבוקונים קריוגני בחנקן נוזלי.

7. קביעה של ביטוי חלבון

  1. להכין מאגר המגון על-ידי הוספת קוקטייל מעכב פרוטאז לתוך מאגר פירוק זמינים מסחרית ביחס של 1: 100. לחשב את הנפח הכולל מבוסס על מספר דוגמאות יעובדו. לשמור על המאגר המגון מוכן ב 4 ° C לשימוש עוקבות.
  2. להוציא את רקמות ממיכל חנקן נוזלי. שוקלים את הרקמה על סולמות דיוק גבוהה (כ 60 מ"ג עבור כל פיסת הרקמה).
  3. להעביר את רקמת צינור 1.5-mL microcentrifuge. מיד מוסיפים 200 µL המגון מאגר precooled כדורי ברזל 1.5 מ מ (4 ° C) לתוך הצינור microcentrifuge.
  4. לאבטח צינורות microcentrifuge precooled (4 ° C) מחזיקי מתכת רקמה אוטומטית מכונת גריסה, ומתחילים המגון על-ידי הפעלת המכונה ההגדרות הבאות: תדירות: 70 הרץ; זמן: 120 s.
  5. לאחר המגון, centrifuge את homogenate (16,000 × g, 4 ° C), בזהירות להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL עם פיפטה 100 µL.
  6. להוסיף טעינת מאגר לפתרון החלבון supernatant (5 x) ביחס של 1:4, denature החלבון ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  7. רמות ביטוי חלבון את הלב ואת רקמות איברים אחרים נוספים המפוקחים על-ידי ניתוח תספיג (נציג התוצאות יוצגו ב- 2C איור , איור 3) לפי הפרוטוקול12שתואר קודם לכן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הניסוי וחלק השלבים המפתח עבור שיטת דיווח מוצגים באיור1. ב- 5 ימים לאחר הזרקת intramyocardial אדנו קידוד לוציפראז (עו ד-לוק), ויוו הדמיה בעכברים עו ד-לוק מוזרק המצוין ביטוי חזקים של לוציפראז במיוחד בלב (איור 2 א, ב'), אשר היה לאשר תספיג ניתוח (איור 2C), רומז העדר איברים nontarget התמרה חושית. לעומת זאת, אין ביטוי לוציפראז זוהה בעכברים שליטה. בקנה אחד עם ביטוי מוצלח ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדו ח הנוכחי מדגים טכניקה שונה להזרקה intramyocardial של וקטורים נגיפי עבור מניפולציה ג'ין הלב, אשר היה שונה משיטה של אוטם שריר הלב אינדוקציה על-ידי גאו. et al. 13 . כעת, ויוו אפיון של פונקציות גנים ספציפיים לרוב לערב את הדור של העכברים הטרנסגניים3,14,15,16,17 או נוק , אשר הוא יקר, זמן רב ו מהגידולים. לחלופין, מסירה של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית עבור חוקרים צעירים מכובד (81625002), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81470389, 81270282, 81601238), התוכנית של שנגחאי אקדמי למחקר מנהיג (18XD1402400), שנגחאי העירוני חינוך הנציבות Gaofeng ברפואה קלינית גרנט תמיכה (20152209), מרכז פיתוח בית החולים של שנגחאי Shenkang (16CR3034A), אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי (YG2013MS42), שנגחאי ג'יאו טונג אוניברסיטת בית הספר לרפואה (15ZH1003 ו- 14XJ10019), שנגחאי שיט התוכנית (18YF1413000), ואת התוכנית חדשנות לתואר שני במכללה לרפואה Bengbu (Byycx1722). אנו מודים ד ר Erhe גאו לעזרתו קודמים במעבדה שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ציוד
למינרי זרימה סטרילית ברדספנגשי בעלי חיים ניסיוני  ציוד Techonology Co., Ltd. (Soochow, סין)FS-CJ-2F
צנטריפוגהThermo Scientific (וולת'אם, ארה"ב)75005282
מכונת טחינת רקמותScientz Biotechnology Co., Ltd. (נינגבו, סין)Scientz-48
מעקר בטמפרטורה גבוהה/לחץ גבוהHirayama (סאיטאמה, יפן)HVE-50
Isoflurane וופורייזר מטריקס (אורצ'רד פארק, ארה"ב)VIP3000
IVIS  מערכת הדמיה לומינה IIIPerkinElmer (וולת'אם, ארה"ב)CLS136334
Precision  איזוןSartorius (Gö ttingen, גרמניה)28091873
Instruments 
פיפטה אפנדורף (100 ומיקרו; L)Eppendorf (ווסטבורי, ארה"ב) 
פיפטה אפנדורף (10 ומיקרו; L)Eppendorf (ווסטבורי, ארה"ב) 
מלקחייםשנחאי מכשירים רפואיים (קבוצה) בע"מ, Corp. JD4020קצה מעוקל
מזרק המילטוןהמילטון (נבאדה, ארה"ב)80501כרך 50 μ L
מיקרו-יתושים המוסטטFST (פוסטר סיטי, ארה"ב)13011-12מעוקל, רוחב קצה 1.3 מ"מ
מחזיק מחט שנחאי מכשירים רפואיים (קבוצה) בע"מ, Corp. (שנגחאי, סין)J32110
מספריים כירורגייםFST (פוסטר סיטי, ארה"ב)14002-12
מזרק 1 מ"לWeiGao Group Medical Polymer Co., Ltd. (ShangDong, סין)
<חזק>חומרים וריאגנטים< / נוגדן
נגד GAPDHCST (Danvers,   ארה"ב)#2118
נוגדן נגד לוציפראזAbcam (קיימברידג', בריטניה)ab187340
אנטי-ארנב IgGCST (דנברס,   ארה"ב) #7074
נוגדן נגד VDRAbcam (קיימברידג', בריטניה)  ab109234
BuprenorphineThermo Scientific (וולת'אם, ארה"ב)PA175056
Chloralic hydrasLingFeng Chemical (ShangHai, סין)
בקבוקונים קריוגנייםThermo Scientific (וולת'אם, ארה"ב)3754181.8 מ"ל 
קרם אפילציהVeet (שנגחאי, סין)
מי מלח חומציים פוספט של Dulbecco גיבקו (גרנד איילנד,  ארה"ב)14040133
EntoiodineLiKang (שנחאי, סין)310132
צינור EPSarstedt (ניוטון, ארה"ב)PCR001
מסנןMillipore (בדפורד, ארה"ב)גודל נקבוביות 0.2 ומיקרו; מ 
IsofluraneYipin (הביי, סין)
LuciferinPromega (מדיסון, ארה"ב)P1041
מאגר ליזה למערב  כתםBeyotime (שנחאי, סין)P0013Jללא מעכבים
קרם עינייםApex Laboratories (מלבורן, אוסטרליה)PBS
Gibco (גרנד איילנד,  ארה"ב)10010023
קוקטייל מעכב פרוטאזתרמו סיינטיפיק (וולת'אם, ארה"ב)78438
5-0 תפר משישנחאי מכשירים רפואיים (קבוצה) בע"מ, קורפ (שנחאי, סין)
כדור פלדהScientz ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ (נינגבו, סין)רוחב 1.5 מ"מ
מחט מזרקKindly Medical Devices Co., Ltd. (ג'ג'יאנג, סין)30 מד 
מחצלת חמהWarmtact חימום חשמלי טכנולוגיה ושות', בע"מ (גואנגדונג, סין)NF-GNCW
49200000594920000113 חזק > חברת התרופות

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yancy, C. W., et al. 2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America. J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).
  2. Pu, J., et al. Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury. Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).
  3. He, B., et al. The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury. J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).
  4. Yao, T., et al. Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy. Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).
  5. He, Q., et al. Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury. Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).
  6. Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J Vis Exp. (118), (2016).
  7. Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. Adeno-associated virus vector delivery to the heart. Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).
  8. Michael, J., et al. Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass. Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).
  9. Lei, S., et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Front Physiol. 7, 270(2016).
  10. Zhang, H. B., et al. Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats. Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).
  11. Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. J Vis Exp. (52), (2011).
  12. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  13. Gao, E., et al. A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse. Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).
  14. Zhao, Y., et al. Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy. J Pineal Res. 62 (3), (2017).
  15. Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection. J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).
  16. Wu, H. M., et al. JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis. J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).
  17. de Luxan-Delgado, B., et al. Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice. J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).
  18. Scofield, S. L., Singh, K. Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography. J Vis Exp. (117), (2016).
  19. Cai, B., et al. Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675. J Pineal Res. 61 (1), (2016).
  20. Chua, S., et al. The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome. J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).
  21. Pei, H. F., et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
  22. Yu, L., et al. Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies. J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).
  23. Yu, L., et al. Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner. J Pineal Res. 62 (1), (2017).
  24. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. (83), e851064(2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In VivoWestern BlotD

מאמרים קשורים