תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות

Summary

מחקר זה מציג עבור הרקמה הפיך ניקוי, immunostaining, תלת-ממד עיבוד וניתוח רשתות כלי דם השליה האנושית הדגימות villi גודל 1-2 מ מ³פרוטוקול.

Abstract

חילופי מזין וגז בין האם והעובר מתרחשת הממשק בדם intervillous אמהית, רשת נרחבת נימי villous חלקית המרכיבה הרבה parenchyma של השליה האנושית. הרשת נימי villous חלקית דיסטלי נמצאת התחנה הסופית של אספקת הדם העוברי לאחר מספר דורות של הסתעפות של כלי המשתרעת החוצה חבל הטבור. רשת זו יש נדן הסלולר רציפים, השכבה מכשול syncytial trophoblast, אשר מונע את ערבוב של דם עוברי והדם אימהי שבו זה ללא הרף הוא טובל. עלבונות לשלמותו של הרשת נימי היפרדות, המתרחשים הפרעות כגון סכרת אימהית, יתר לחץ דם, השמנת יתר, יש השלכות את הסיכונים הבריאותיים רציני הנוכחי של העובר, התינוק, למבוגרים. כדי להגדיר טוב יותר את השפעות מבניות העלבונות הללו, פרוטוקול פותחה עבור מחקר זה הלוכד את מבנה הרשת נימי גודל 1-2 מ מ³ שבו אחד יכול לחקור את מאפייניה טופולוגי המורכבות שלה מלא. כדי לעשות זאת, גזור אשכולות של מסוף villi מן השליה, בשכבה trophoblast, את endothelia נימי immunolabeled. אלה דוגמאות לאשורן ואז עם טישו חדש ניקוי תהליך אשר מאפשר רכישת אוספי תמונות קונאפוקלית z-לעומק של ~ 1 מ מ. הדמיות תלת מימדי מערימות אלה ואז מעובדים ניתח ליצירת אמצעי רשת נימי בסיסיים כגון נפח, מספר סניפים נימי, ואת ענף נימי נקודות קצה, כמו אימות של ההתאמה של גישה זו עבור אפיון רשת הנימים.

Introduction

הבנתנו את השליה המתפתח, פתולוגיות שלה, במידה רבה, מוגבל כדי להסיק יחסים מרחביים בין villi סמוכים נימים כלולות נגזר ממקטעים היסטולוגית. במחקר זה, פתרנו בעיה זו על-ידי פיתוח אמצעי כדי ליצור הדמיות תלת מימדי (3D) של רשתות נימי היפרדות האנושי המתאימים ניתוחים של תכונות רשת נימי (למשל הסתעפות, אחידות). לעשות את זה שילבנו מכתים immunofluorescent עם שני המוצרים ניקוי רקמות מסחרי, Visikol-1 ו- Visikol-2 (המכונים להלן פתרון-1 ופתרון-2).

השליה האנושית הוא מתחם עצום של כלי הדם הממוקם בין הדם intervillous של האם ואת העובר המתפתח. הרחבת החוצה מן ההכנסה שלה המשקולת שליה, הטבור סניפים לרשת של העורקים והוורידים אשר ramify כדי לכסות את המשטח שליה עם רשת כלי הדם משוכלל. הקצוות שלהם ואז לחדור למטה לתוך הפנים או עומק של הדיסק היפרדות איפה הם עוברים מספר דורות יותר מסעף ולסיים את villi מסוף, רשתות נימי כלולות, האתר של חילופי גזים, חומרים מזינים, וחילוף פסולת בין הדם העוברי, אימהית.

עלבונות לרשת הנימים היפרדות במהלך הפיתוח להיות השלכות מתמשך על הבריאות של העובר, הרך הנולד ו-^2,למבוגרים מתהווים ^1,3. על רקע ההריון הקשורות פתולוגיות כגון הפלה, הגבלת גדילה תוך רחמי, סוכרת רעלת היריון אימהי ^4,5,6 שם הוא ערך גבוה על פיתוח שיטות מדידה, אפיון של היפרדות רשתות נימי villous חלקית. מחסום הגדולות היא היפרדות רשתות כלי דם להקיף מגוון רחב של קנה מידה. הרשתות וסקולרית משטח יכול להיות גדול כמו 4-5 מ מ קוטר. הנימים villous חלקית מסוף הם גודל 10-20 מיקרומטר בקוטר; השליה מכילה יותר מ 300 ק מ של כלי הדם ⁷. כיום, ישנן מספר טכניקות קל לשימוש, מהיר ומדויק יכול ללכוד אלה הקצוות של הסקאלה כלי. עד כה, רק מספר קטן של villi שיכול להתבצע על ידי מיקרוסקופ. לדוגמה, Jirkovska. et al. התמקדו סיסי היפרדות-מונח, שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם טורי מקטעים אופטי במרווחים 1 מיקרומטר, המתקבל 120 חלקים עבה של מיקרומטר; אין נתונים על מספר דוגמאות למד ולא סטטיסטיקה נמסרו ⁸. מבנים נימי אותרו, קווי המתאר של villi של נימים היו מצוירת ביד, עם לשרטוטים מיוצא לניתוח תמונה. בעוד המחברים לדון על ההשלכות של הממצאים שלהם עבור "גדל villous חלקית וסקולרית הרשת", מסקנות כאלה הם בעייתיים כאשר רק "המונח" (36 + שבוע הריון גיל) הרקמה הוא למד. באופן דומה, מאיו ואחל', פירס. ואח הסתמכה על הרקמה של אותו הגיל, עבור שלהם סימולציות של העברת זרימה וחמצן דם, אבל את בדיקותיהם היו מוגבלים רק כמה המונח, ^9,villi מסוף¹⁰ . Stereology גם הוחל במחקר של המבנה של כלי villous חלקית. אבל שוב, המוקד כבר בדרך כלל על הריונות מאוחר יותר אספקת liveborn תינוקות עם אחד או יותר ההריון סיבוכים ^11,12.

עד לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית הייתה מוגבלת לדימות רקמות לעומק של 100-200 מיקרומטר בשל ספיגת עירור פליטת קרינה פלואורסצנטית על ידי רקמת שמעליה ¹³ . למרות רקמות ניקוי, היסטולוגיה 3D נרחב תוארו בספרות ויש שיטות רבות בשביל לרקמות ניקוי רבים הם מתאימים לשימוש עם רקמות באופן כללי, כפי שהם נזק בלתי הפיך מורפולוגיה הסלולר דרך hyperhydration של חלבונים או הסרה של ליפידים. לכן, אין אפשרות לאמת כי תוצאות אלה הם המעידים של הרקמה עצמה, לא ממצאים עיבוד ואילו שלנו רקמות ניקוי תהליך היא טכניקה הפיך כי הוא מסוגל שמולן היסטולוגיה מסורתיים. בדרך כלל, ניקוי רקמות כרוך באחת משלוש גישות עיקריים: 1) התאמת אחיד של מדד השבירה (RI) של מרכיבי רקמת ידי ועלייתו RI התאמת פתרונות, אשר מסיר את פיזור אור המצטבר שנגרם כבידתי עקב רציפה התנודות של רי נמוך (ציטוזול) ומרכיבים RI (חלבון/שומנים) גבוהה; 2) הסרת מרכיבי השומנים דרך הטמעה לתוך הידרוג וניצול אלקטרופורזה/דיפוזיה להסיר את מרכיבי השומנים; 3) הרחבה/דנטורציה של חלבון מבנה כדי לאפשר חדירה מוגברת של ממיסים ולעודד אחידות של רי ¹³. בעוד גישות אלה ניתן לעיבוד רקמות שקוף, לאפשר ייצוגים תלת-ממד של סמנים ביולוגיים שיווצר, ייצוגים תלת-ממד אלה הם ערך קליני רב כמו זה מאתגר כדי לקבוע אם התמונות האלה מעידים על מאפייני הרקמה או של הרקמה תהליך ניקוי. מצד שני, מאז שלנו רקמות ניקוי הוא הפיך תקן היסטולוגית ו/או אימונוהיסטוכימיה ניתן ליישם את הרקמה זהה כדי להעריך אם התיקונים יש משמעות קלינית.

מחקר זה מציג ניתוח של 47 דוגמאות villous חלקית דיסטלי המתקבל סך של הריונות קלינית נורמלי, electively הסתיים 23 בין ההיריון של 9-23 שבועות השלים שני משלוחים מלא לטווח רגיל. Immunofluorescence תיוג של trophoblast ושל endothelia אפשרה ניתוח כמותי, אוטומטי של שינויים הרשתות וסקולרית villous חלקית את המורכבות שלהם.

עם פרוטוקול זה, אנו מבודדים, ניתח villi מסוף ורשתות נימי שלהם בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו, כאשר חל פיתוח רשת נימי villous חלקית לאורך ההיריון יהיה לזהות מאפיינים אלה, המהווים הבסיס בלידת ילד בריא. כאשר מוחל על מחקרים של הריונות מסובך, זה נבאר גם כאשר, כיצד פתולוגיות היפרדות לשנות העצים villous חלקית של הרשתות הנימים הם נדן, וכיצד אלה לפגוע בעובר רווחה.

Protocol

פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של מכון מדינת ניו יורק למחקר בסיסי בועדת האתיקה האנושית מחקר התפתחותיות.

1. חיתוך עץ villous חלקית

1. לשטוף פורמלין קבוע רקמת השליה עם פוספט צחצח חזק מלוחים (PBS)¹⁴ כדי להסיר את פורמלין ומניחים בצלחת פטרי על השלב של מיקרוסקופ לנתיחה. השתמש באזמל ומלקחיים בסדר להתגרות רקמת השליה בנפרד כדי לאתר העצים villous חלקית (מבני מסעף תפטיר לבן). לנתח את חלקי העץ סיסי (מספר מ מ אורך) ולהעביר את הרקמה מיקרו-שפופרת המכילה PBS ~ 1 מ"ל.

2. immunofluorescent מכתים

1. עם פיפטה, להסיר את PBS והחלף PBS טריים. משהים 10 דקות עם מתערבל מפעם לפעם. אני חוזר פעם נוספת.
   הערה: שלב זה, כל צעדים נוספים נעשים בטמפרטורת החדר, מלבד הדגירה נוגדן ראשוני.
2. באמצעות פיפטה של, להסיר ולהחליף את PBS עם PBS +0.1% טריטון-X100 + 2% עז סרום (PBS-T-GS) כדי permeabilize האיגוד שאינם ספציפיים ברקמות של רחוב של נוגדנים משניים. תקופת דגירה של 30 דקות.
3. החלף את PBS-T-GS PBS המכיל 2% עז סרום, שניהם העכבר monoclonal anti-CK7, ארנב אנטי-CK7.
   1. דגירה רקמות בין לילה ב 4 º C.
   2. הסר את הנוגדנים הנותרים על ידי כביסה עם PBS-GS במשך 10 דקות עם מתערבל מפעם לפעם.
   3. תסיר את ה-PBS GS ותחליף PBS-GS המכיל שני העכבר נגד עז IgG בשילוב עם פלטה ירוקה (520 ננומטר) fluorophore, עז ארנב אנטי איג בשילוב של פליטת אינפרא-אדום (652 ננומטר) fluorophore.
   4. הסר הנוגדנים על ידי חזרה על שלב 2.1.
   5. אחסן את הרקמה immunolabeled בטמפרטורת החדר בחושך.

3. הבהרה של הרקמה

1. לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם PBS במרווחים של-10 דקות.
2. מייבשים את הרקמה על ידי הסרת מגניב עם פיפטה והחלפתו 50% אתנול (מתנול עשוי לשמש גם כן). דגירה במשך 10 דקות להחליף טריים 50% אתנול, דגירה במשך 10 דקות חזור על הפעולה פעם נוספת עבור סכום כולל של 3 incubations. חזור על incubations עם 70%. ואז להחליף 100% אתנול, דגירה במשך 15 דקות (לחלופין מתנול עשוי לשמש).
3. עם מלקחיים שקצהו פיין, העברת רקמות המכיל מיקרו-שפופרת טריים ~ 1 מ"ל פתרון-1 במשך 4 שעות.
4. עם מלקחיים שקצהו פיין, העברת רקמות טריים מיקרו-שפופרת המכילה פתרון-2 עבור ~ 4 שעות.
   הערה: כאשר מאוחסנים בחושך, immunofluorescence זה יציב בטמפרטורת החדר במשך לפחות 6 חודשים.
5. לא לערבב עם כל תמיסה מימית, (למשל הרכבה בינוני) כמו קרחת היער אבוד.

4. גובר על מיקרוסקופ

1. לא הר הרקמה בין זכוכית רגילה coverslip כמו הרקמות בקלות מעוותים ורכים.
2. עיין איור 5B והר הרקמה בחדר סייקס-מור כדלקמן;
   1. עם מלקחיים שקצהו קנס במקום coverslip עגול של 25 מ מ בבית הבליעה, הבסיס.
   2. עם מלקחיים שקצהו הקנס למקם את אטם גומי בבסיס על coverslip.
   3. עם פיפטה מקום טיפה (~ 40 µL) פתרון-2 במרכז coverslip.
   4. עם המלקחיים שקצהו בסדר להעביר פיסת רקמה פתרון-2 עד הטיפה במרכז coverslip.
   5. המקום coverslip השני על ראש האטם.
   6. לשרשר את טבעת הנעילה לתוך העליון של הבסיס דחיסת coverslips של אטם עד המשרד.
      הערה: היזהרו שלא להדק יותר מדי או coverslip תתנפץ.
   7. הכנס של מחט בקוטר 22 ליציאת בבסיס ודרך את האטם.
   8. ממלאים מזרק 3-mL עם ~ 1.5 מ של פתרון-2.
   9. הר מחט 25-מד על המזרק.
   10. הכנס את המחט מזרק לתוך הנמל מול ודרך את האטם.
   11. ודא כי האוויר בבית הבליעה היא אוורור דרך המחט 25-מד אחרים, בעדינות להזריק פתרון-2and מילוי החדר.
   12. הסר את המחט ואת המזרק ולמקם התא בשקופית זכוכית גדול על הבמה מיקרוסקופ קונפוקלי.
3. לחלופין, חותכים בארות מותאם אישית מתוך יריעות סיליקון PDMS.
   1. עם מספריים לחתוך 25.4 × 25.4 מ מ² חתיכה מן הגיליון PDMS.
   2. באזמל חותך ~ 12.7 × 12.7 מ מ² היטב החתיכה.
   3. הקש את החתיכה בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ.
   4. למלא את הבאר לפסגה עם פתרון-2.
   5. להעביר את פיסת רקמה המיקרו-ברכבת התחתית למרכז של הבאר.
   6. עם מלקחיים שקצהו בסדר להניח coverslip בראש הבאר כגון התחתון של coverslip זה wetted עם פתרון-2.
   7. טעינת ההרכבה סייקס מור קאמרית עם רקמת על הבמה מיקרוסקופ קונפוקלי.

5. מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. להכניס את הרקמה בבית הבליעה פוקוס עם מטרה 10 x.
2. לעבור את השלב מיקרוסקופ למעלה ולמטה מטוס מוקד כדי למדוד את המרחק בין החלק העליון והחלק התחתון של הרקמה.
3. הזז את הבמה 2.5 מיקרומטר צעדים כדי לאסוף את קובץ תמונת וידאו המכיל ערכת תמונות דרך הרקמות מלמעלה עד למטה.

6. היפוך קרחת היער

1. הפוך קרחת היער על-ידי העברת הרקמות מיקרו-שפופרת המכילה > 20 x הנפח של 100% אתנול. ב- 1 h במרווחי זמן להחליף 70% אתנול, ואז 50% אתנול, ולבסוף PBS. לאחסן ב 4 ° C בחושך.
   הערה: תהליך עכשיו את רקמת להטבעת פרפין סטנדרטי, אופטים ובניה של היסטולוגית או צביעת חיסונית-פתולוגיה.

7. deconvolution

הערה: עבור השלבים הבאים, תוכנה פקודות, כרטיסיות ותפריטים הנפתחת מופיעים בכתב נטוי.

1. הפעל את התוכנה deconvolution ופתח את קובץ התמונה.
2. הזינו את הפרמטרים הרשומים בחלון'ערסלy'.
   1. עבור 'Spacings' להזין את voxel x, y ו- z מידות מיקרומטר.
   2. עבור כל אחד מערוצי הצבע, בחר את הפלורסנט המשמש את immunostaining מתוך התפריט הנפתח.
   3. עבור 'מודאליות ', בחר לייזר קונפוקלי סורק מתוך התפריט הנפתח.
   4. עבור 'המטרה עדשה ', בחר 10 x מתוך התפריט הנפתח.
   5. עבור 'בינוני טבילה ', בחר אוויר מתוך התפריט הנפתח.
   6. לחץ על 'החל ' לחצן.
3. לחץ על הכרטיסיה'Deconvolution'.
4. לחץ על 'Deconvolution תלת-ממד ' בתפריט הנפתח.
5. '3D - Deconvolution' חלון להבטיח שההגדרות הן: 1) מסתגלת PSF עיוור PSF תיאורטי 2), 3) שימוש (ברירת מחדל PSF אדפטיבית, 10 חזרות, רעש בינוני), 4) בסיס שם.
6. לחץ על 'כפתור הסימון הירוק ' כדי להפעיל את התוכנית.
7. בסיום, חזור על שלבים-7.6 7.3 כדי להפעיל מחדש את התוכנית. כאשר סיים אותו מחדש בפעם השלישית והאחרונה.
8. ב 'נתונים מנהל ' חלון, לחץ על הקובץ עם קידומת "10-10 - 10-".
9. לחץ על 'קובץ ' טאב ולאחר מכן לחץ על 'שמור בשם '.
10. בחלון'שמור As' בחר 'מספר שלם ללא סימן של 8 סיביות ' מ 'סוג נתונים ' התפריט הנפתח ולחץ בעת שמירה.

8. עיבוד תמונה

1. להפעיל תוכנה פיג'י.
   1. לחץ על 'קובץ ', לחץ על 'פתוח " ובחר את קובץ התמונה Deconvolved ולחץ על 'פתוח" לחצן ב 'פתוח ' חלון.
   2. לחץ על 'תמונה/צבע/פצל ערוצים ו להמיר תמונת תלת-צבעי קובץ לתוך שלושה קבצים חדשים המכילים רק בצבע אחד. שמור קובץ התמונה אדומה המכילה את התמונה נימי villous חלקית immunolabeled להגדיר. למחוק את קבצי התמונה כחול וירוק.
   3. להחסיר את פלורסצנטיות רקע מקובץ תמונת אדום עם: 'רקע תהליך/חיסור '.
   4. בתפריט הנפתח מוגדר רדיוס הכדור מתגלגל 10 פיקסלים.
   5. השאר את אפשרויות התפריט 4 לא מסומנת ולחצו על 'אישור '.
   6. לחץ על 'כן בתפריט תהליך מחסנית.
   7. הסרת רקמת הגלום קרינה פלואורסצנטית (autofluorescence) על-ידי פתיחת 'תמונה/התאמת/בהירות-ניגוד ' תפריט ושינוי ההגדרות מינימום, מקסימום, הבהירות והניגודיות. יש להיזהר לא להסיר כל אחד immunofluorescence נימי.
   8. למזער הנותרים לא רלוונטי זריחה על-ידי פתיחת 'תמונה/התאמת/סף ' תפריט והזזת את המחוונים כך immunofluorescence נימי מודגשת. בדוק 'הרקע הכהה ' התיבה ולאחר מכן לחץ על 'החל '. על 'להמיר הנפתחת בינארי ' תפריט הסימון 'שחור רקע ' התיבה ולאחר מכן לחץ על 'אישור '. שמור את קובץ תמונת שחור-לבן (בינארי) עבור ניתוחים להלן.

9. ניתוח

1. אובייקט סופר, Skeletonization.
   1. בחר את קובץ תמונה בינארי שנוצר בשלב 8.1.8.
   2. לחץ על 'ניתוח/3D אפשרויות OC . ואבדוק רק 'נפח ' , 'תוצאות, חנות ' תיבות בתפריט הנפתח. להבטיח כי התיבה 'הצג מספרים' אינה מסומנת. לחץ על 'אישור ' כפתור.
   3. Cli kcב- 'לנתח/3D אובייקטים מונה '. בתפריט הנפתח, להגדיר 'גודל סנן: דק ' עד 5000. להבטיח 'לא לכלול אובייקטים בקצוות של התיבה אינה מסומנת. בדוק כי 'אובייקטsשל סטטיסטיקה , 'סיכום ' תיבות מסומנות. לחץ על 'אישור ' כפתור.
      הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות בהתאם לתצורת המחשב וגודל הקובץ.
   4. לשמור את הטבלה סטטיסטיקה קובץ מפת אובייקטים.
   5. בחר את קובץ מפת אובייקטים. לחץ על 'תוספים/שלד/Skeletonize 2D-3D' כדי skeletonize לרשת הנימים בקובץ הבינארי. לחץ על 'קובץ/לשמור כמה. בחר 'Tiff. ' בתפריט הנפתח. שמור חלון TIFF להוסיף "סקל-" שם קובץ מפת אובייקט, לחץ על 'להציל ' לחצן.
   6. לחץ על 'לנתח/שלד/ניתוח שלד 2D-3D'. בתפריט הנפתח לקבל את הגדרות ברירת המחדל, לחץ על 'אישור ' כפתור. שמור את הטבלה 'מידע' סניף, 'תוצאות הטבלה ולאחר שני קבצי פלט (סקל אובייקטים-שכותרתו - שלדים והשלד מתויגים).

Results

הדמיות 3D שנוצר של הנימים אשכולות של מסוף villi בשליה האדם מגיל 8 שבועות הריון לשם משלוח המונח נספר כ אשכולות נפרדים, skeletonized לניתוח רשת. היחידות פונקציונלי של השליה (איור 1א') הם העצים סיסי הם הרחבה של קיבול שבו הם יש שחדר parenchyma השליה (איור 1Bומוגדל ב ג 1). חתיכות של החלק הדיסטלי של עץ גזור (Figure1D ו- 1E) היו אז immunolabeled להראות ...

Discussion

ועדת הבדיקה מוסדיים אישרה את האוסף של היפרדות רקמות villous חלקית עבור פורמלין קיבעון של הריונות שהופסקו electively. לפני ההליכים בוצעו, סקירה קצרה של הרשומה הרפואית ציין גיל אימהי, זוגיות, ואישר את העדר כל רפואי המשמש כבסיס (כגוןיתר לחץ דם, סוכרת, לופוס) או עוברית (מבנית או כרומוזומליות חריגות, גדילה לא תקינה) בוצעה. דף הנתונים ואת כל דגימות שנאספו הודבקו תוויות רק עם מזהה המחקר לכן, כל דגימות היו בטל שזוהה לפני צאתו חבילת ההפעלה. Villi שנאספו על ידי משקיף מיומן (CMS); רותמי וצלחת שליה הוסרו, נאספו רק חינם צף v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
תמיסת פורמלדהיד 10% (w/v) במאגר פוספט מימי	Macron Fine Chemicals	H-121-08	חומר קיבוע כללי, מוכן לשימוש פורמולה, היזהר מכיוון שאדים רעילים
להבי אזמל	ThermoFisher Scientific	08-916-5B מס' 11
אזמל	ThermoFisher Scientific	08-913-5
מלקחיים עדינים	שירותי	מיקרוסקופיה אלקטרונית78354-119
מיקרו שפופרת (1.7 מ"ל)	PGC Scientifics	505-201
פוספט חוצץ מלח	סיגמא	D8537	PBS
פיפטה	VWR	52947-948	חד פעמי, פיפטת העברה 3 מ"ל
Triton X-100	Boehriner Mannheim	789 704	מדולל ל-0.1% מהמלאי
סרום עיזים	Gibco	16210-064	מדלל ל 2% בתמיסת PBS
עכבר חד שבטי אנטי-ck7 קרטין 7 Ab-2 (שיבוט OV-TL 12/30)	ThermoFisher Scientific	MS-1352-RQ
ארנב אנטי-CD31 נוגדן	Abcam	ab28364
פולט ירוק (520 ננומטר) פלואורוכרום	Invitrogen	A11017	Alexa-Fluor 488
פלואורוכרום פולט אינפרא אדום (652 ננומטר)	Invitrogen	A21072	Alexa Fluor 633
אלכוהול אתנול 200 הוכחה	Pharmco-Aaper	111000200	לדלל לריכוזים נמוכים יותר באמצעות PBS לפי הצורך
Solution-1	Visikol Inc.		Visikol Histo-1
Solution-2	Visikol Inc.		Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers	BellCo Glass Inc.	P / N 1943-11111
25 מחט מד	ThermoFisher Scientific	14-826AA	BD Precision Glide Needs
3 מ"ל מזרק	ThermoFisher Scientific	14-823-40	BD מזרק חד פעמי
PDMS יריעות סיליקון	McMaster-Carr	P/N 578T31
מיקרוסקופ קונפוקלי	Nikon Inc.		Nikon C1 Confocal
Microscope Deconvolution תוכנה Media	Cybernetics		AutoQuant X22
Fiji תוכנה לעיבוד			בחינם, קוד פתוח  זמין ב https://fiji.sc
Hematoxylin	Leica Biosystems	3801570	רכיב 1 של SelecTech H& מערכת צביעה E
Alcoholic Eosin	Leica Biosystems	3801615	רכיב 2 של SelecTech H& מערכת צביעה
E Blue Buffer	Leica Biosystems	3802918	רכיב 3 של SelecTech H& מערכת צביעה E
Aqua Define MCX	Leica Biosystems	3803598	רכיב 4 של SelecTech H& מערכת צביעה E
מערכת זיהוי אימונוהיסטוכימיה	ThermoFisher Scientific	TL-125-QHD	UltraVision Quanto Detection System HRP DAB