מאמר שיטה

בסיוע פורמלדהיד בידוד של אלמנטים הרגולציה על אמצעי נגישות כרומטין בתאים בתרבית

DOI:

10.3791/57272

⸱

2 באפריל 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Oncohematology and Genetics. Institute of Biomedicine of Seville (IBiS), University Hospital Virgen del Rocío, 2Institute of Biochemistry, Medical Faculty, Friedrichstrasse 24, Member of the German Center for Lung Research, Justus-Liebig-University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפלסטיות המדהימה של אדריכלות גרעיני נשלטת על ידי מנגנוני epigenetic דינאמי כולל ללא קידוד RNAs, DNA מתילציה, שינוי מיקום נוקלאוזום וכן היסטון הרכב השינוי. כאן נתאר פרוטוקול Formaldehyde-Assisted בידוד של הרגולציה אלמנטים (שלהם) אשר מאפשר קביעת כרומטין נגישות בצורה פשוטה, זולה הדירים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי גנים המתאימים בתגובה רמזים חוץ-תאית, כלומר, ספציפיים ברקמות או שושלת ג'ין שעתוק, אנושות תלויה מאוד מוגדרים מצבים של הארגון כרומטין. הארכיטקטורה דינמי של הגרעין נשלטת על ידי מנגנונים מרובים ומעצבת את התוכניות פלט תעתיק. חשוב, לכן לקבוע לוקוס ספציפיים כרומטין נגישות באופן אמין זה רצוי עצמאית של נוגדנים, יכולים להיות מקור מבלבלים פוטנציאל ההשתנות ניסיוני. נגישות כרומטין ניתן למדוד באמצעות שיטות שונות, כולל את הבדיקה Formaldehyde-Assisted בידוד של הרגולציה אלמנטים (שלהם), המאפשרים קביעת כרומטין כללי הנגישות במספר נמוך יחסית של תאים. כאן נתאר פרוטוקול שלהם המאפשר זיהוי פשוטה, אמינה ומהירה של אזורים גנומית עם תפוסה חלבון נמוכה. בשיטה זו, ה-DNA covalently חייב את החלבונים כרומטין באמצעות פורמלין כסוכן crosslinking, לכסנתם לחתיכות קטנות. ה-DNA חופשי לאחר מכן מועשר באמצעות פנול: כלורופורם החילוץ. היחס של ה-DNA חינם נקבעת לפי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) או רצף הדנ א (DNA-seq) לעומת דגימת הבקרה המייצג DNA הכולל. האזורים עם מבנה כרומטין רופפת יותר מועשר בדוגמת ה-DNA חינם, ובכך מאפשר זיהוי אזורים גנומית עם דחיסת כרומטין נמוכה יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-DNA גנומי של התאים האיקריוטים צמוד גדושות לתוך נוקליאוזומים, אשר צריך להסירו או ועיצבנו מחדש על מנת לאפשר את האינטראקציה של חלבונים אחרים עם ה-DNA. הפעלת גנים ברמת השעתוק של גנים מוביל בדרך כלל תצורה פתוחה יותר של מבנהו nucleosomal, בפרט נוקלאוזום +11, כדי להקל על שעתוק על ידי RNA פולימראז. בנוסף, אזורים רגולטוריות כגון היזמים משפרי עוברים שינויים דינמיים בנגישות כרומטין שלהם כדי לאפשר האינטראקציה עם כרומטין מגבילים או גורמי שעתוק2. מספר גישות פותחו כדי לזהות אזורים אלה ללא נוקלאוזום. אלה כוללים את רגישות nucleases כגון DNase אני3 או נוקלאז micrococcal4, אשר ניתן לגשת רק את ה-DNA כאשר הוא לא כרוך בצורה הדוקה סביב נוקליאוזומים. שיטות אחרות לצורך זיהוי כרומטין פתוח או DNA חינם כוללים בתיווך transposase שילוב של אלמנטים retrotransposable (Assay עבור Transposase-נגיש כרומטין, ATAC)5, או באמצעות immunoprecipitation (ChIP) כרומטין נוגדנים נגד שינויים היסטוניים. השיטה שלהם אינה מבוססת על הקיבולת של אנזים כדי להגיע אל ה-DNA או הכריכה של נוגדן ל חלבון מסוים, אך במקום זה מסתמך על הטיהור של אזורים ללא נוקלאוזום באמצעות פנול: כלורופורם חילוץ6,7. בשיטה זו, ה-DNA covalently נמדד כרומטין חלבונים על ידי הסוכן crosslinking פורמלדהיד, הוא לכסנתם לאחר מכן לחלקים קטנים על ידי sonication. כרומטין אציקלוביר אזורים יהיה crosslinks DNA/חלבון בשפע, ואילו DNA אזורים עם נוקליאוזומים אין או כמה יהיו מעט או ללא מתחמי DNA/חלבון תפור. מיצוי פנול: כלורופורם מאפשר טיהור של הלא-תפור DNA חופשי בשלב מימית, בעוד תפור ה-DNA חלבונים לכידת את שלב אורגנים פנול או מימית-אורגנית לאטמוספרה יחד עם החלבונים. כימות של ה-DNA. חינם זה בהשוואה הפניה של דנ א סה כ מאפשרת זיהוי האזורים חינם כרומטין. השיטה שלהם יכול לשמש עבור אפיון אזורי גנומית בודדים כפי שמתואר כאן, אך מתאים גם הזיהוי של הגנום כולו כרומטין נגישות כאשר מצמידים רצף עמוק כפי שמתואר מודלים שונים8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. התוצאות המתקבלות על-ידי שלהם-seq ושיטות אחרות כגון האטא ק-seq חופפות במידה רבה14. השיטה שלהם היא מאוד חזקים, זול וקל לבצע שיטה לזיהוי אזורים ללא נוקלאוזום. בניגוד לשיטות אחרות, היא אינה דורשת ניסויים פיילוט כדי לקבוע את מידת העיכול כנדרש nucleases (DNase seq, MNase-seq) או transposases (האטא ק-seq) המתאים, דנו בפירוט סקירה האחרונות15. הפרמטרים היחידים יותאם הם sonication תנאים, במקרים מסוימים הזמן קיבוע. מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוטה זה סכמטי מוצגים באיור 1, זה לא דורש שום ציוד מיוחד חוץ sonicator. הפרוטוקול יכול להתבצע תוך זמן קצר יחסית והופך שלהם שיטה קלה ואמינה כדי לבדוק נגישות כרומטין במספר סוגי תאים שונים החל ריאות תאים11 לתאים יסודי המתקבל העכבר כבדי16.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יום 1: תרבית תאים

  1. התרבות התאים כדי להיות ניתח את הכמות הרצויה. תא תרבות ותנאים מדיה תלויים סוגי תאים תחת חקירה.
    הערה: באופן עקרוני, כל התאים האיקריוטים היא לבצע ניתוח של כרומטין נגישות על ידי שלהם. עבור ניסוי זה, 4 x 106 HEK-293T תאים הם נזרע בקערה אחת 10 ס מ בינוני DMEM בתוספת 10% (v/v) FBS ו 1% (w/v) פניצילין/סטרפטומיצין, מודגרות ב 5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה עד התאים מגיעים למפגש 70-80% (~ 8 x 10 6 תאים לכל מנה).

2. יום 2: Crosslinking פורמלדהיד, קציר תאים

התראה: פורמלדהיד הוא רעיל מאוד ויש להשתמש תמיד תחת ברדס fume. ללבוש בגדי הגנה (כפפות, חלוק המעבדה). להשליך את הפסולת כראוי.

  1. הוסף פורמלדהיד ישירות אל המדיום תרבות תא בשכונה fume להגיע ריכוז סופי של 1% (v/v) (270 µL של 37% (v/v) פורמלדהיד עד 10 מ"ל של התא תרבות בינוני). תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (20-25 ° C), השמדת לוחיות הרישוי באופן ידני כל 2 דקות.
    הערה: הזמן crosslinking ניתן להתאים בהתאם לסוג התא. עבור הרוב המכריע של שורות תאים, 10 דקות של crosslinking מספיקה. בשביל לרקמות, incubations יותר זמן יידרש כדי לאפשר את הקיבעון של כל התאים.
  2. להוסיף גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ' כדי להרוות את הפורמלדהיד (להוסיף 500 µL מניה גליצין 2.5 מטר 10 מ"ל של תרבות בינוני). תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, השמדת כל 2 דקות.
  3. לשטוף את התאים 3 x עם PBS קר קרח (8 g/L NaCl, 0.2 g/L אשלגן כלורי, 1.44 g/L נה2HPO4 · 2 H2O, 0.24 g/L ח'2PO4, להתאים את ה-pH ל 7.4 עם HCl או NaOH). האחות המדיום ולשטוף ישירות בתיבה תא תרבות מאכל או את הבקבוק על-ידי הוספת 10 מ"ל ל- PBS. חזור על שלב זה פעמיים נזהרים מאוד במקרה של תאים באופן רופף חסיד כגון HEK-293T. הוסף PBS בקפידה לצד המנה על מנת למנוע ניתוק של התאים.
  4. לאחר לשטוף את השלישי, resuspend התא 1 מ"ל של PBS קר קרח, העברת צינור התגובה 1.5 mL על קרח. להשתמש במגרדת התא כדי לנתק את התאים בעת הצורך.
    הערה: כאשר החל חומר מוגבל, השתמש צינורות DNA מחייב נמוך כדי למנוע אובדן מדגם במהלך ההליך.
  5. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 300 ב 4 ° C ומפרידה שולחן מקורר. למחוק את תגובת שיקוע על ידי בקפידה כ רפה בעברית.

3. תא פירוק ושברים כרומטין

  1. Resuspend בגדר תא 1 מ"ל מאגר של פירוק שלהם (1% (w/v), 10 מ מ EDTA, 50 מ מ טריס HCl pH 8.1, 10 µg/mL leupeptin, aprotinin µg/mL 10, 2 מ מ PMSF), resuspend את התאים על ידי בקפידה pipetting לאורך מספר פעמים. תקופת דגירה של 20 דקות על קרח. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס בשלב זה אם יש צורך.
  2. Sonicate תפור את הדנ א כדי להטות אותה לגודל הממוצע של 200-300 bp. הגדרות ספציפיות של sonicator צריכה להיקבע עבור כל מקור של המכשיר בשימוש sonication ודוגמאות. בכל מקרה, ודא כי ה-DNA ביעילות לכסנתם. שלב אופטימיזציה עבור הגז דנ א מתוארת תחת שלב 5.14. מגניב הדגימות על קרח במהלך sonication כדי למנוע חימום של המדגם.
  3. Centrifuge לדוגמה עבור 15 דקות ו- g x 13,000 ב 4 º C.
  4. להעביר את תגובת שיקוע צינור התגובה. לפצל את הדגימות ב 100 µL aliquots. אחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס, במידת הצורך.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מופרע בשלב זה.

4. דה-crosslinking של פקד ה-DNA

  1. קח µL 100 aliquot מהשלב 3.4 כדי להפוך את crosslink וכדי לשמש כהפניה DNA הכולל. להוסיף 10 µL של RNase-A (10 mg/mL), תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
  2. להוסיף 10 µL של Proteinase K (20 מ"ג/מ"ל). להשתמש התרמו-בלוק לתכנות דגירה במשך 4 שעות ב 37 ° C ולאחר מכן עבור 6-אייץ ' ב 65 ° C כדי לבקע את החלבונים וכדי להפוך את crosslinks. לבסוף, החזק את הדגימות ב 4 ° C עד הפרוטוקול הוא חידש ולאחר מכן המשך לשלב 5.
    הערה: פרוטוקולים אחרים שלהם להשתמש כרומטין דגימות מתאי אשר לא היה תפור כהפניה, ובכך המבטלת את הצורך דה-crosslinking11. העובדה כי הדוגמיות הללו אינם תפור עלול להוביל הבדלים את היעילות sonication או ב- DNA יציבות, לכן השימוש הכולל דוגמיות דנ א אשר עברו את אותו הנוהל כמו הבדיקה דוגמאות הוא מדויק יותר.

5. יום 3: טיהור פנול: כלורופורם של דנ א

  1. קח את הלא-דה-תפור aliquot מהשלב 3.4. להוסיף 10 µL של RNase-A (10 mg/mL), תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.
  2. קח את הצעד הלא-דה-תפור טופס aliquot 5.1 המדגם דה-תפור מ שלב 4.2 והמשך במקביל. הוסף H2O להגיע נפח סופי של 300 µL.
  3. הוסף µL 300 באלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl (25:24:1) fume הוד ו מערבולת נמרצות.
    התראה: פנול הוא מאכל רעילים ויש להשתמש תמיד תחת ברדס fume. בגדי מגן (כפפות, חלוק המעבדה), ודא הצינורות התגובה סגורות בחוזקה, להשליך את הפסולת כראוי.
  4. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
  5. להעביר בזהירות µL 280 מימית השלב העליון צינור התגובה. ודא כי לא לקחת שום פסולת לאטמוספרה אשר מכילה גם חלבונים. למחוק את השלב התחתון הנותרים כפסולת בממיסים אורגניים.
  6. חזור על שלבים 5.3 עד 5.5 ולהעביר בזהירות µL 270 מימית השלב העליון צינור התגובה.
  7. הוסף µL 270 של כלורופורם fume הוד ו מערבולת נמרצות.
    הערה: שלב זה משמש כדי לחסל את כל פנול הנותרים מדגם.
  8. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
  9. בזהירות העברה µL 250 מימית השלב העליון צינור התגובה, מטפל לא לשאת כל פסולת לאטמוספרה. למחוק את הדגימה הנותרים כפסולת בממיסים אורגניים.
  10. הוסף µL 25 של 5 M NaCl 250 µL של אלכוהול איזופרופיל. להוסיף 5 µL של גליקוגן (20 מ"ג/מ"ל) כנשא הדנ א. לערבב היטב על ידי היפוך הצינורות, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 13,000 ב 4 ° C, כדי לזרז את ה-DNA.
  11. לשטוף את צניפה DNA עם 400 µL של 70% (v/v) אתנול. צנטריפוגה 10 דקות ב 13,000 g x-4 מעלות צלזיוס.
  12. וארוקן את תגובת שיקוע בזהירות ולתת בגדר יבש למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend במאגר 100 µL TE (10 מ מ טריס pH 8, 1 מ"מ EDTA).
  13. דגירה הלא-דה-תפור חינם לדנ במשך 4 שעות ב 65 ° C כדי להסיר את crosslinks בין ה-DNA. לאחסן את הדגימות ב-20 ° C.
  14. לכמת את כמות הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים ולהפעיל את aliquot כדי לבדוק את גודל המקטע על ג'ל agarose 2% (w/v). כוונן את ההטיה והזמן עוצמות, בהתאם לתוצאות הניתוח גודל ה-DNA על-ידי agarose של ג'ל אלקטרופורזה, כדי להשיג את גודל ממוצע של 200-300 bp.

6. קביעת חינם לעומת, סה כ- DNA על ידי בזמן אמת כמותיים PCR (לרביעיית-PCR)

  1. היחס של DNA ללא נוקלאוזום (בחלק זה המכונה דנ א חינם) לעומת סך הדנ א נקבע על-ידי לרביעיית-PCR17,18. דוגמאות יכול גם להיות באופן כמותי נותחו על ידי הכלאה microarray או רצף עמוק עבור האישושים הגנום כולו.
  2. עיצוב תחל qPCR עבור האזורים להיבדק ועבור הפקדים חיוביים ושליליים.
    הערה: מתאים חיובי הבקרות תחל ממוקם האמרגן של משק פעיל משועתקים גנים כגון ACTB, GAPDH, TPI1 או TUBA1A (קידוד β-אקטין, GAPDH, TPI או α-טובולין). הפקדים המתאימים שליליים מצויים אזורים הטרוכרומטין או מדבריות גנים. פקדים אחרים שלילי מתאים ניתן לעצב גנומית אזורים סמוכים לוקוס מוסדר באופן דינמי תחת חקירה לפקד עבור העותק המקומי מספר הבדלים (טבלה 1).
  3. לדלל דגימות ה-DNA כדי ריכוז סופי של 10 ng/µL עם מאגר טה, ולקחת בחשבון לצורך חישובים סופית הגורם דילול (ראה שלב 6.5).
  4. להגדיר את תגובה qPCR triplicates בצלחת 96-ובכן, עם המיקס התגובה הבאה לאדם טוב: תבנית ה-DNA: 20 ng (2 µL), פריימר לפנים 200 ננומטר (0.4 µL מניה 5 מיקרומטר), פריימר הפוכה 200 ננומטר (0.4 µL מניה 5 מיקרומטר) , מוכן מסחרי השימוש תערובת התגובה המכיל צבע ירוק (5 µL מניה 2 x), ו- H2O כדי 10 µL.
  5. להפעיל את התקן qPCR בזמן אמת, באמצעות מצב כימות מוחלטת, וקבע ה-Ct של הדגימות עם זוגות שונים פריימר. לחשב את היחס של התאוששות של DNA חינם ל- DNA הכולל עבור כל פריימר באמצעות הנוסחה הבאה, לוקח בחשבון את הגורמים לדילול מהשלב 6.3:
    figure-protocol-1
    התוצאות נציג, חישוב דוגמה מקבלים בטבלה מס ' 2.
  6. כדי לפצות על ההבדלים בין דגימות, לנרמל של היחס שחזור בקרה חיובית:
    figure-protocol-2

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בשיטת שלהם כדי למדוד הבדלים הנגישות כרומטין של MHC class II גנים בתאים HEK293T כפי שפורסם19. MHC class II קידוד גנים מבוטאים אנטיגן הצגת תאים (נגמ שים), או צורונים או בתגובה ציטוקין איתות20. הביטוי של גנים MHCII מונעת על ידי activator מורכבים אשר נקשר רכיבים DNA ספציפיים, כינה תיבות XY, הממוקמות יזם, משפרי של אלה הגנים21,22. זה משתקף ברמה של כרומטין, כפי הניתוח שלהם שלנו של אזורים שנבחרו MHC class II גנים הלע-DPB1, הלע-DMA. הניסויים הראו שכי כרומטין פתוח האזורים המקיף את תיבות XY, אמנם זה יותר קומפקטי בגופים ג'ין (איור 2).

לדוגמה, עבור החישובים, בניסוי מסוים זה, אנחנו מדולל סה כ. דנ א 10 פעמים (דילול פקטור 10), לדנ חינם היה לא מדולל (דילול פקטור 1) עבור לרביעיית-PCR. Cts שהושג עבור אזורים שונים שנבדקו, מפורטים החישובים כדי לקבל את יחס שחזור הגמר ואת ההחלמה היחסית יחסי בטבלה 2. אלה יחסי שחזור היחסי התקבלו באמצעות יזם ACTB את הפקד חיובי. שימו לב כי החישובים האלה לאחד משכפל המשמש ליצירת התוצאות באיור 2.

בהקשר אחר, נגישות כרומטין נבדקה במודל על ביטוי גנים inducible. במקרה זה, שינויים מהירים של דחיסת כרומטין בתגובה הגורם לנמק הגידול גירוי הפרו דלקתיים (TNF) נמדדו. הלה תאים נותרו אינו מטופל או מגורה עם TNF לשעה ואחריו שלהם כדי למדוד את דחיסת כרומטין-יזם אזור השליטה הביטוי של הגן קידוד של אינטרלוקין ציטוקין TNF מגיב 8 (IL8). תוצאות אלו הראו נגישות של מוגבר בחום כרומטין ב האמרגן IL8 של תאים מגורה-TNF (איור 3). הנגישות ביזם IL-8 לאחר גירוי TNF הוא אפילו גבוה יותר למצוא מקדם ACTB מראה דרמטי כרומטין שיפוצים באזור זה רגולציה. כמו היחס שחזור שהושג במקרה זה הוא גבוה מזה שהושג בכל האזור משמש הפקד חיובי (מקדם ACTB) היחס שחזור היחסי הוא נעלה יותר.

figure-results-1
איור 1: זרימת העבודה שלהם. תאים הם תפור ישירות ב- הבקבוקון התרבות התא או צלחת על-ידי הוספת פורמלדהיד (A). לאחר שכבתה של הפורמלדהיד, תאים שלוש פעמים עם קרח PBS קר (B), שטופים הועבר צינור התגובה בהם הם resuspended במאגר פירוק שלהם, sonicated כדי להטות את הדנ א (ג). Aliquot אחד של כרומטין שחולצו דה-תפור על ידי חימום-65 ° C, כדי לקבל את ההפניה DNA הכולל (D), לאחר מכן ה-DNA חופשי מופק באמצעות פנול: כלורופורם הן את תפור והן את aliquots דה-תפור (E). לבסוף, ה-DNA הוא לכמת, היחס של חינם לעומת סה כ- DNA הוא מחושב (F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2
איור 2: קביעת כרומטין נגישות בגן MHC class II אשכול בתאים HEK293T. תאים HEK293T נותחו על ידי שלהם. היחס בין חינם לעומת סך ה-DNA (כלומר., היחס שחזור יחסית) נקבע ייצוג המקדם של הגן ACTB בתור פקד חיובית, אזור הטרוכרומטין על Chr. 12 כפקד שלילי, ואת אזורים רגולטוריות ג'ין גופות של MHC class II גנים הלע-DMA, הלע-DPB1. החלק העליון מראה ייצוג סכמטי של לוקוס המיקומים של תחל. קווי שגיאה לייצג סטיות תקן בין שני משכפל ביולוגי נמדד triplicates. הדמות שונה מ ח שפורסם19. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3
איור 3: שינויים DNA נגישות-ייצוג המקדם IL8 בתגובה לטיפול TNF. הלה התאים היו מגורה עם TNF (20 ng/mL) עבור 1 h ו שנותחה על ידי שלהם. היחס בין חינם לעומת סך הדנ א נקבע האמרגן של ACTB (בקרת חיובי), אזור הטרוכרומטין ב 12 Chr. (בקרת שלילי) של האמרגן IL8. קווי שגיאה לייצג לשגיאות תקן של הממוצע (SEM) בין שלושה משכפל ביולוגי נמדד כפילויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4
איור 4: אופטימיזציה של התנאים sonication- כרומטין שחולצו מן התאים 293T היה sonified באמצעות sonicator ממוקד עם צינורות המתאים (טבלה של חומרים). כרומטין היה sonicated במשך הזמן המצוין עם חזרות של 30 s עם ההגדרות הבאות: שיא כוח 150, פקטור חובה 15, מחזורים לכל פרץ 500, ולאחריו s: 30 שיא כוח 2.5, פקטור חובה 15 מחזורים לכל פרץ 500. כרומטין וכתוצאה מכך היה דה-תפור, מטוהרת על-ידי מיצוי פנול: כלורופורם, נטען ב- 2% agarose ג'ל. אתידיום-ברומיד צבעונית ג'ל מוצג, העמדות של הסמנים משקל מולקולרי מסומנים ב- bp. בניסוי זה, גודל אופטימלי כרומטין (200-300 bp) הושג לאחר 20 דקות של sonication. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פריימררצף
ACTB-יזם-FAAAGGCAACTTTCGGAACGG
ACTB-יזם-RTTCCTCAATCTCGCTCTCGC
Chr. 12 בקרה שלילית-FATGGTTGCCACTGGGGATCT
Chr. 12 בקרה שלילית-RTGCCAAAGCCTAGGGGAAGA
הלע-DMA-XY-תיבת-FCATCAGTCACTGGGGAGACG
הלע-DMA-XY-תיבת-RGCTTCCCAGCCCAGTTACAT
הלע-DMA-5'-FGGAGAGAACAATCTCCGCTTCA
הלע-DMA-5'-RAGCTGCTATGTGTGGTTGGT
הלע-DMA-3'-FTGGGGACCTAGTTAGGGAGC
הלע-DMA-3'-RAGATCCATGGGAGGAGGCTT
הלע-DPB1-XY-תיבת-FGTCCAATCCCAGGGTCACAG
הלע-DPB1-XY-תיבת-RTGAAAAGAGCTGCAGTCAGGA
הלע-DPB1-5'-FGCGTGTTCATGTCTGCATCC
הלע-DPB1-5'-RTGATCCTCAGAGCCTGGACA
הלע-DPB1-3'-FCCAGCCTAGGGTGAATGTTT
הלע-DPB1-3'-RGCCTGGGTAGAAATCCGTCA
IL8 קדם-FGTGATGACTCAGGTTTGCCCT
IL8 קדם-RCTTATGGAGTGCTCCGGTGG

טבלה 1: צבעי יסוד qPCR.

figure-results-5
בטבלה 2: דוגמה חישובים של יחסי ההחלמה היחסית שלהם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלהם היא שיטה עמיד וזול המאפשר זיהוי אזורים ללא נוקלאוזום. היא מבוססת על העיקרון כי ה-DNA סביב נוקליאוזומים ניתן בקלות תפור שינויים היסטוניים. מיצוי פנול: כלורופורם משמש כדי להפריד את הלא-תפור ואת שברי DNA נטול חלבון חלבון מכורך הדנ א, אשר נמצא בשלב פנול התחתון והן במידה מסוימת, לאטמוספרה (איור 1). לכן, האזורים ללא נוקלאוזום במדיניותן של השבר של DNA חופשי בשלב מימית. מספר פרסומים לתאר את הפרוטוקולים מפורט של שלהם שיטת23,24,25,26, אשר ניתן להתייעץ עם כדי להשלים את ההליך המתואר כאן.

בדומה לשיטות אחרות כדי לקבוע את הכרומטין, השיטה שלהם גם אנושות תלוי הטיה אופטימלית של ה-DNA. אם השברים ארוכות מדי, בכל אזור נטול נוקלאוזום להיות רעולי פנים על-ידי ה-DNA כרומטין מכורך סמוכים. אם השברים הם קטנים מדי, זיהוי ע י qPCR או רצף עמוק הופך להיות קשה מאוד. מסיבה זו, sonication ה-dna הוא פרמטר קריטי זה חייב להיות מבוקר וממוטב על מנת לקבל שברי סביב 200-300 bp אורך, אשר מייצגים נוקליאוזומים 1-2 (איור 4).

פרמטר נוסף אשר יכולים להשפיע על התוצאה הסופית היא crosslinking המדגם. למרות הנוהל קיבוע המתוארים כאן אינו חוקי עבור רוב שורות תאים, החוקר בקפידה יכול להעריך צעד זה עבור המדגם מסוים שנבחנה, במיוחד בעת שימוש ברקמות, איפה עוד קיבעון פעמים יכול להיות נחוץ לאפשר פורמלדהיד להגיע לתאים כל דגימת הרקמות.

בניגוד לשיטות אחרות, כגון DNase אני נוקלאז micrococcal רגישות יתר, צ'יפ או האטא ק, שלהם אין להסתמך על פעילות אנזימטי או נוגדנים ספציפיים, ולכן הוא אינו צריך טיטור או אופטימיזציה של התנאים התגובה. זה הופך שלהם שיטה אידיאלית כדי למדוד כרומטין נגישות עבור מעבדות עם ניסיון מועט בתחום כרומטין. בנוסף, טייס הניסויים נדרשים רק כדי למטב את השלב חיתוך הדנ א ואת הזמן crosslinking, בעת הצורך.

השיטה פותחה בתחילה שמרים6, אבל זה גם הוארך בתרבית של תאים. דנ א טהור עם השיטה שלהם יכול לשמש עבור רצף עמוק, המאפשר אפיון הגנום כולו המצב כרומטין. זה כבר הוכיח שימושי במספר מחקרים8,9,10,11,12,13,19,27, 28.

תוצאות של ניסויים שלהם-seq יציג החפיפה עם התוצאות המתקבלות על ידי שיטות אחרות כגון DNase-seq14, למרות מתעוררות כמה הבדלים. זאת בשל הבדלים מתודולוגיים לדוגמה נוקליאוזומים רגועה או שופצה עדיין יכול לעכב את המחשוף מאת DNase, בעוד אזורי ה-DNA אלה יהיה פחות נוטה לייצר DNA/חלבון crosslinks, ובכך ייקבע גם ללא נוקלאוזום אזורים באמצעות שלהם9. גם, נוכחותם של חלבונים שאינם-היסטון כגון RNA polymerases או קורא חלבונים עבור סימני epigenetic עלולה לגרום DNA/חלבון crosslinks, ובכך להתפרש וגדוש חלבון אזורים בניסויים שלהם. מגבלות אלה הן הטבועה בכל שיטת מצפני המדינה כרומטין, ובכך מעלה את הצורך להשתמש בשילוב של שיטות שונות להשגת תובנה מקיף.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצה להודות טילמן Borggrefe (אוניברסיטת Giessen) עבור המכשיר sonication שיתוף בחביבות. העבודה מתוך M.L.S. נתמך על ידי מענקים את פתוח (SCHM 1417/8-3), SFB/TRR81, SFB1021, SFB1213, מצוינות לב-ריאה מערכת האשכולות (ECCPS, סיפורה ה 147/2), של דויטשה Krebshilfe (111447), התוכנית IMPRS-HLR אגודת מקס פלאנק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל 25: 24: 1קארל רוטA156.1
גליקוגן, 20 מ"ג/מ"לתרמו פישרR0561
ABsolute QPCR Mix, SYBR-Green, רוקסתרמו פישרAB1162B
פרוטאינאז K, 20 מ"ג/מ"לתרמו פישרEO0491
RNase A, 10 מ"ג/מ"לתרמו פישרEN0531
LeupeptinSigmaL8511
AprotininSigmaA1603
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma78830
milliTUBE 1 מ"ל AFA סיביםCovaris520130
מחזיק milliTUBE 1 מ"לCovaris500371
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovaris
מערכת PCR בזמן אמת StepOnePlusיישומית ביוזיסטמס4376600

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Struhl, K., Segal, E. Determinants of nucleosome positioning. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 267-273 (2013).
  2. Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why? Mol. Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
  3. Wu, C. The 5' ends of Drosophila heat shock genes in chromatin are hypersensitive to DNase I. Nature. 286 (5776), 854-860 (1980).
  4. Yuan, G. C., et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae. Science. 309 (5734), 626-630 (2005).
  5. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  6. Nagy, P. L., Cleary, M. L., Brown, P. O., Lieb, J. D. Genomewide demarcation of RNA polymerase II transcription units revealed by physical fractionation of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (11), 6364-6369 (2003).
  7. Nagy, P. L., Price, D. H. Formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. , (2009).
  8. Krinner, S., et al. CpG domains downstream of TSSs promote high levels of gene expression. Nucleic Acids Res. , 1-14 (2014).
  9. Gomez, N. C., et al. Widespread Chromatin Accessibility at Repetitive Elements Links Stem Cells with Human Cancer. Cell Rep. 17 (6), 1607-1620 (2016).
  10. Gaulton, K. J., et al. A map of open chromatin in human pancreatic islets. Nat. Genet. 42 (3), 255-259 (2010).
  11. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  12. Hurtado, A., Holmes, K. A., Ross-Innes, C. S., Schmidt, D., Carroll, J. S. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response. Nat. Genet. 43 (1), 27-33 (2011).
  13. Filion, G. J., et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
  14. Davie, K., et al. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 11 (2), e1004994(2015).
  15. Meyer, C. A., Liu, X. S. Identifying and mitigating bias in next-generation sequencing methods for chromatin biology. Nat. Rev. Genet. 15 (11), 709-721 (2014).
  16. Du, J., et al. Chromatin variation associated with liver metabolism is mediated by transposable elements. Epigenetics Chromatin. 9 (1), 28(2016).
  17. Skinner, D. Z. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. Crop Sci. 54 (1), 455(2014).
  18. Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice Guide for the Application of Quantitative PCR (qPCR). Natl. Meas. Syst. , 50(2013).
  19. Rodríguez-Gil, A., et al. The CCR4-NOT complex contributes to repression of Major Histocompatibility Complex class II transcription. Sci. Rep. 7 (1), 3547(2017).
  20. Steimle, V., Siegrist, C. A., Mottet, A., Lisowska-Grospierre, B., Mach, B. Regulation of MHC class II expression by interferon-gamma mediated by the transactivator gene CIITA. Science. 265 (5168), 106-109 (1994).
  21. Choi, N. M., Majumder, P., Boss, J. M. Regulation of major histocompatibility complex class II genes. Curr. Opin. Immunol. 23 (1), 81-87 (2011).
  22. Ting, J. P. -Y., Trowsdale, J. Genetic control of MHC class II expression. Cell. 109 Suppl, S21-S33 (2002).
  23. Nammo, T., Rodríguez-Seguí, S. A., Ferrer, J. Mapping open chromatin with formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements. Methods Mol. Biol. 791, 287-296 (2011).
  24. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  25. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. A detailed protocol for formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE). Curr. Protoc. Mol. Biol. , Chapter 21, Unit21.26 (2013).
  26. Giresi, P. G., Lieb, J. D. Isolation of active regulatory elements from eukaryotic chromatin using FAIRE (Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements). Methods. 48 (3), 233-239 (2009).
  27. Jung, S., Angarica, V. E., Andrade-Navarro, M. A., Buckley, N. J., Del Sol, A. Prediction of Chromatin Accessibility in Gene-Regulatory Regions from Transcriptomics Data. Sci. Rep. 7 (1), 4660(2017).
  28. Pique-Regi, R., et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data. Genome Res. 21 (3), 447-455 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FAIREDNAPCRDNA

מאמרים קשורים