הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן

7.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57363

⸱

7 בפברואר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Wuerzburg, 2Translational Center Regenerative Therapies (TLC-RT), Fraunhofer Institute for Silicate Research ISC, 3Fujifilm Manufacturing Europe B.V.

במאמר זה

סיכום

אנו מציעים הרחבה תא פרוטוקול על macroporous microcarriers ואת השימוש בהם כמערכת משלוח ב זלוף מגיב ביולוגי כדי להפיץ מטריצה רקמות decellularized. אנו גם כוללים טכניקות שונות כדי לקבוע התפשטות תאים ואת הכדאיות של תאים תרבותי על microcarriers. יתר על כן, נדגים את הפונקציונליות של התאים לאחר ביוריאקטור תרבויות.

תקציר

הנדסת רקמות הינו תחום מבטיח, התמקדו בפיתוח פתרונות עבור הביקוש הגובר על רקמות ואיברים בנוגע למטרות השתלת. התהליך ליצירת רקמות אלה הינו מורכב, וכולל שילוב של סוגי תאים ספציפיים, פיגומים לגירויים פיזיים או ביוכימי כדי להנחות צמיחת תאים ובידול. Microcarriers מייצגים כלי מושך כדי להרחיב את התאים microenvironment תלת מימד (3D), מאז הם לספק גבוה משטח-יחסי נפח ומחקים באופן הדוק יותר המצב ויוו לעומת שיטות מסורתיות דו-ממדית. מערכת כלי הדם, הספקת חמצן וחומרים מזינים לתאי ולהבטיח פינוי פסולת, מהווה את אבן בניין חשובה בעת יצירת רקמות מהונדסים. למעשה, רוב המבנים להיכשל לאחר להיות מושתל עקב חסר תמיכה בכלי הדם. במחקר זה, אנו מציגים את פרוטוקול להרחבת תא אנדותל על microcarriers מבוססי קולגן רקומביננטי בתנאים דינמיים טווה את הבקבוק, ריאקטורים, נסביר כיצד לקבוע את הגדרת תא הכדאיות ופונקציונליות. בנוסף, אנו מציעים שיטה למסירה תא למטרות vascularization ללא ניתוק נוספים השלבים הנחוצים. יתר על כן, אנו מספקים אסטרטגיה כדי להעריך vascularization תא פוטנציאליים ב זלוף מגיב ביולוגי על מטריצה ביולוגי decellularized. אנו מאמינים כי השימוש בשיטות שהוצגו יכול להוביל לפיתוח טיפולים חדשים מבוססי תאים עבור מגוון גדול של רקמות יישומי בתרגול קליני הנדסה.

מבוא

בעיה כללית אחת ביישומים הנדסת רקמות היא להניב מסה גבוהה תא עם פנוטיפ בידול הנכון במיקום של צריכה. היישום של microcarriers כדי לטפל בבעיה זו החלה בשנת 1967 עם הגדלת חשיבות לתאריך בתחומים כגון: הנדסת רקמות אורתופדי לייצור בקנה מידה גדול של עור, עצם, סחוס, גידים1. הם מאפשרים את הטיפול של תרבויות חסיד בדרכים דומה לזה של הבולם תרבויות2 על ידי הרחבת לתאים microscale תלת מימד (3D) סובסטרטים. ובכך התאים חווים היצע מזין הומוגנית ואינטראקציות תא מטריצה להוביל תחזוקה טובה יותר של ויוו3,בידול4 אשר לעיתים קרובות שאבדו עם הזמן בדו מימד מתקרב5. יחס גבוה יותר של השטח לבנפח - המוביל בסופו של דבר גבוה יותר תא התשואות6,7, גבוה יותר גז ושערי חליפין מזין השוואת מערכות סטטיות8, האפשרות לווסת ולהוריד נושא התרבות הפיזית גירויים9, ואת הפוטנציאל אולם שינוי קנה המידה של תהליך הרחבת7 הם עוד יתרונות. מספר תכונות כגון קוטר, צפיפות, נקבוביות, תשלום משטח הדבקה מאפיינים10,11 להבחין את שונים זמינים מסחרית מיקרו, מאקרו-מנושאות המטוסים שלו. עם זאת, אחד היתרון העיקרי הוא משלוח שלהם פוטנציאל microtissues האתר פגם או דרישה.

עבור יישומים של טכנולוגיית microcarrier בהנדסת רקמות העצם, אנחנו מאויר הדוח הקודם12 הייצור של microcarrier החדש סוג היוו של קולגן רקומביננטי אני פפטיד (RCP, זמינים מסחרית כמו Cellnest). Microcarrier חדש זה מאפשר את GMP התואם את קנה המידה של ההפקה בפיגומים ותא, כנדרש לצורך מסירה תאים תרחיש קליני. בהקשר זה, כוונון של יציבות לגרדום, השפלה קצב ומאפיינים השטח באמצעות בחירה נכונה של אסטרטגיה מתאימה crosslinking מאפשר להתאים את הטכניקה כדי היישום שנבחר, תא סוג של ריבית או היעד רקמת13. בפרט, פוטנציאל להעסקת הזה microcarrier כמערכת משלוח תא להזרקה עבור יישום טיפולי14 גורם להם מעניין במיוחד בסביבה קלינית.

בנייר זה, אנחנו ולכן להמחיש את ההליך culturing הבידוד והרחבה של מח עצם, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hBMSCs) ואת עורי microvascular אנדותל תאים אנושיים (HDMECs) על קולגן-אני מבוססי רקומביננטי microcarriers מבוססת על פפטיד, והכנתן למסירה בסביבה קלינית. יתר על כן, אנו מתארים פרוטוקולים נוספים שימושי לשם קיום התא הכדאיות על ההשתלה.

תא הכדאיות לאחר ההשתלה הוא למעשה תלויה בחום vascularization15,16,17, אשר מבטיחה חילופי חמצן וחומרים מזינים ואסטמה ומקילה על פינוי פסולת. אינקובטורים-מטלטל סיבובי מהווים גישה אחת להתגבר על אתגרים vascularization בהנדסת רקמות ולשמור על יכולת הקיום של התא, דרך זלוף בינוני תרבות ובכך מתן חמצן וחומרים מזינים18. כאן, אנו ממחישים שיטה במבחנה כדי להעריך את יכולת העברה של תאים אנדותל microvascular microcarriers RCP biomatrix ואת יכולתם לתרום vascularization דה נובו ואת אנגיוגנזה. Biomatrix הזה הוא קטע מעי צם חזירי decellularized הנקרא BioVaSc (ביולוגי Vascularized לגרדום), עשיר קולגן ואלסטין, עם לשימור מבנים כלי דם, אשר כולל עורק האכלה, המנקזים את הווריד19 כי כבר להחיל עבור בעיות השרשה20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

hBMSCs הם בודדו אותנו מהמתרחש בראש עצם הירך של דלקת מפרקים ניוונית חולים שעברו ניתוח להחלפת ראש עצם הירך. ההליך בוצע תחת האישור של ועדת האתיקה המקומית של האוניברסיטה של וירצבורג, הסכמה מדעת של החולים. ראשי תאי אנדותל microvascular הם בודדו אותנו מהמתרחש העורלה ביופסיות של תורמים לנוער. Representative(s) המשפטי שלהם סיפק מלאה מדעת בכתב. המחקר אושרה על ידי המנהלים אתית המקומי של אוניברסיטת וירצבורג (הצבעה 182/10).

1. בידוד של hBMSCs, HDMECs

  1. מח עצם, נגזר mesenchymal סטרומה תאים אנושיים (hBMSCs)
    1. הסר העצם הספוגית של ראש עצם הירך באמצעות כפית סטרילי.
      הערה: העצם הספוגית מופיע חומר רופף וגרגרים בתוך העצם בקליפת המוח, אשר קשה ונוקשה. יתכן צורך לגרד חלקי העצם הספוגית של עצם קורטיקלית באמצעות אזמל.
    2. הכנס את העצם הספוגית שהוסר שני צינורות 50 מ. הנפח של העצם הספוגית יכול להשתנות בין 5 עד 10 מ"ל לפי המימד של ראש עצם הירך שהוסרו בניתוח החלפת מפרק הירך.
    3. לשטוף עם DMEM-F12 (1:1 תערובת של מדיום DMEM וחזיר F12), מילוי ברכבת התחתית עם – 30 מ של מדיום.
    4. לנער את הצינור באופן ידני, בצורה אורכית, עבור 5 s לתת תאים אדיפוז מתוך העצם הספוגית. צנטריפוגה ב 300 x g ו- 22 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    5. האחות עם פיפטה פלסטיק של בוגר, את שכבת השומן-תא כ 20 מיליליטר תגובת שיקוע הנותרים. תן בינוני מספיק כדי לכסות את העצם הספוגית.
    6. למלא את הצינורות 10 מ"ל של DMEM-F12 ומנערים נמרצות longitudinally בעבודת יד, עבור s 10-15, לשחרר את התאים.
    7. להעביר 10-15 מ של השעיה תא עם פיפטה פלסטיק הדרגתי הצינורות צינור 50 מ.
    8. חזור על 2 - 3 פעמים מהשלב 1.1.6 באגירת יחד התליה תא שהושג עד העצם הספוגית שנאספו לשפופרת 50 מ ל הוא לבן.
    9. העברה התליה תא עם פיפטה פלסטיק הדרגתי שני צינורות חדשים, הימנעות כ רפה בעברית בגדר קולגן שהופקדו על החלק התחתון של הצינורות 50 מ.
    10. צנטריפוגה התליה תא-g 300 x ו- 22 מעלות צלזיוס במשך 5 דק למחוק את תגובת שיקוע על ידי כ רפה בעברית זה עם פיפטה פלסטיק בוגר.
    11. להוסיף 40 מ של DMEM-F12 10% FCS 1% 50 עט/סטרפ µg/mL Ascorbate-2-פוספט בצינור השלישי. העברה מ של המדיום הזה כל שפופרת המכילה בגדר התא. מחדש להשעות את כדורי תא על-ידי הבהוב התחתון של הצינורות נמרצות ולהעביר את המתלים תא הצינור המכיל בינונית בלבד.
    12. אופציונלי: 100 µL של תאים השעיה לספירת תאים למהול, דילול מטריים הראשון עם PBS, ואז 1:10 ב- trypan blue, על-ידי הוספת µL 15 של דילול הראשון ועד 15 µL של DPBS 30 µL Trypan כחולה כדי להשיג את DPBS: Trypan Blue יחס של 1:1. לספור את התאים עם תא נויבאואר סטנדרטי.
    13. זרע תאי-109 תאים/175 ס מ2 T-הבקבוק ב 25 מיליליטר בינוני כפי שמתואר ב 1.1.11. לחלופין, לחלק את המתלים התא כולו ב-175 ס מ עד 102 תא תרבות מבחנות מבלי לספור. בשלב זה, hBMSCs הם לא להבדיל בין אריתרוציטים, אשר במידה רבה עולים עליהם במספרם. hBMSCs יופיע בתור מושבות דליל (1-2/הבקבוק) במהלך 7 הימים הראשונים.
    14. לשנות בינוני לאחר 4 ימים של זריעה כדי לאפשר אינטראקציה של כדוריות דם עם hBMSCs. לאחר ההחלפה בינוני הראשונה, לשנות את המדיום כל 2-3 ימים. לבצע את ההחלפה בינונית על-ידי לחלוטין הסרת המדיום תרבות עם פיפטה פלסטיק הדרגתי, כביסה פעמיים עם DPBS (על-ידי הוספת 10 מ"ל של DPBS תאים חסיד והסרה לחלוטין את DPBS עם פיפטה פלסטיק בוגר), ולאחר מכן הוספת 20 מיליליטר בינוני טריים, כפי שמתואר ב 1.1.11.
  2. עורי microvascular אנדותל תאים אנושיים (HDMECs)
    1. לטיפול של ביופסיות העור, לבודד את HDMECs על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר21. בקצרה, לאחר הפרדת הדרמיס מכל האפידרמיס, דגירה הדרמיס בטריפסין למשך 40 דקות ב- CO 37 ° C ו-5%2. לאחר זמן הדגירה, להעביר הדרמיס צלחת פטרי המכילות בינוני תרבות, לגרד כל חתיכה עם השימוש של אזמל. העברת התליה תא שהושג שפופרת פלסטיק 50 מל ו צנטריפוגה למשך 5 דקות 300 x g ו- 22 מעלות צלזיוס. לספור התליה תא באמצעות נויבאואר תא הזרע-צפיפות של 1.2 x4 10 תאים/ס מ2. לשנות את המדיום לחלוטין בכל יום אחר.

2. הקמה של מבחנות טווה RCP microcarriers, ביוריאקטור עיקור

  1. טווה מבחנות, RCP microcarriers
    1. יום אחד לפני הניסויים, הגדרת תיבת הטווח מבחנות ולהכין אותן עיקור על ידי תא לחץ.
      הערה: להשאיר את הפקקים של המבחנות טווה רופף ולחטא, במידת האפשר, אותם בתנוחה זקופה.
      1. לעטוף את המבחנות טווה ברדיד אלומיניום סביב הפקקים צד בנפרד על מנת למנוע זיהום במהלך הסרת העטיפה. לעטוף את צלוחיות עם 1-2 שכבות של רדיד אלומיניום עבור autoclaving על מנת למזער סיכונים זיהום לאחר עיקור.
    2. שוקלים את הכמות הנדרשת של RCP macroporous microcarriers ב- 20 מ של DPBS.
      הערה: 30 מ"ג נדרש לכל טווה את הבקבוק. לתת להם מימה במשך לפחות שעה לפני העיקור חום על ידי תא לחץ (121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות).
  2. ביוריאקטור זלוף
    1. השתמש במערכת ביוריאקטור תיאר לייצר רקמת vascularized מקבילות20. ביוריאקטור הזה מורכב קיבול, שבו מניחים את biomatrix, מאגר בינוני ובקבוק לחץ.
      1. לחבר את כלי הקיבול ועם המאגר בינוני את הבקבוק לחץ דרך צינורות סיליקון (ראה איור 3C). לעזוב הפקקים רופף ומניחים אותו בתוך שקית פלסטיק החיטוי, לסגור טוב, אשים את זה. בתוך שקית פלסטיק השני אוטוקלב. לחטא על ידי תא לחץ.

3. תרבות של hBMSCs ו- HDMECs על RCP macroporous microcarriers

הערה: HDMECs נעשה שימוש כדי להפיץ את microcarriers RCP הודבקו תוויות עם RFP מאת התמרה חושית lentiviral. פרוטוקול זה שונה לאחר שפורסמו בעבר פרוטוקול5.

  1. תן את macroporous RCP microcarriers ליישב את העניין ולשטוף אותם עם 10 מ"ל של תרבות בינוני. חזור על 3 פעמים.
  2. רחץ טווה מבחנות עם 10 מ"ל של תרבות בינוני.
  3. להוסיף 30 מ"ג RCP microcarriers macroporous לכל טווה את הבקבוק 8 מ של תרבות בינוני. Equilibrate המבחנות טווה המכיל את microcarriers RCP-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות, לפני זריעה התאים.
    הערה: זה מבוסס על משקל יבש משוער של RCP microcarriers שלפני החיטוי.
  4. זרע 5 x 105 hBMSCs או HDMECs (פסקה 3) לכל טווה את הבקבוק ב 2 מ של תרבות בינוני.
  5. במקום המבחנות טווה על צלחת קדירות ולהתחיל זע ב 90 סל ד במשך 5 דקות ולנוח במשך 55 דקות, ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, עבור סכום כולל של 1 h סטטי/דינאמי דגירה. חזור על 4 פעמים.
  6. להוסיף 10 מ ל תא בינוני תרבות לכל טווה את הבקבוק ולאחר מכן להתחיל רציפה זע ב 95 סל ד. דגירה-CO 37 ° C ו-5%2.
  7. עם השימוש של micropipette לקחת דגימות-µL 1, 4 ו- 7:333 ימים עבור ה-DNA תוכן (~ 0.5 מ ג), 1000 µL לניתוח SEM (~ 1.5 mg) ו- µL 333 עבור צביעת חי/מת (~ 0.5 מ ג).
    הערה: זה מבוסס על משקל יבש משוער של RCP microcarriers שלפני החיטוי.
  8. שנה 10 מ"ל של תרבות בינוני בכל יום אחר. בשביל זה, לחכות עד microcarriers RCP ליישב את העניין, תשאף היטב 10 מ ל מן הבקבוק טווה, עם השימוש של פיפטה 10 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 10 מ של מדיום תרבות טריים.
  9. לשמור את התרבויות בצלחת קדירות לקבוע סל ד 95, ב- 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במשך 7 ימים.

4. DNA תוכן, ניתוח SEM, לחיות מכתים מת, לבלוב assay

  1. תוכן ה-DNA
    1. עם השימוש micropipette, לאסוף כ 0.5 מ ג של microcarriers מן הבקבוק טווה (הכלול µL 333 של השעיה) והעברת כל אל צינור פלסטיק 2 מ"ל.
      הערה: זה מבוסס על משקל יבש משוער של RCP microcarriers שלפני החיטוי.
    2. לשטוף פעם עם 1 מ ל DPBS, ואז האחות תגובת שיקוע.
    3. הסר שנותרו DPBS איזה שהוא לופילייזר, משקל של microcarriers lyophilized עבור נרמול מאוחר יותר.
    4. הקפאת דגימות ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שעות.
    5. דגירה בדגימות ב 60 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם µL 300 פפאין 5 U/mL.
    6. להקים עקומות טיטור המתאים ועקוב אחר ההוראות manufacturer´s של וזמינותו כימות (למשל, PicoGreen dsDNA assay) קיט ולבצע מדידה של אות פלורסנט-520 nm עם גלאי הפריה חוץ גופית.
  2. סריקה ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
    1. לאסוף ca. 1 מ ג של microcarriers כל הבקבוק טווה והעברה אל צינור פלסטיק 2 מ"ל.
    2. לשטוף microcarriers פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS.
    3. להסיר DPBS, דגירה של 1 מ"ל אתנול 70% לשעה.
    4. להסיר את תגובת שיקוע, דגירה של 1 מ"ל של 80% אתנול לשעה.
    5. להסיר את תגובת שיקוע, דגירה של 1 מ"ל של 90% אתנול לשעה.
    6. להסיר את תגובת שיקוע, דגירה של 1 מ"ל אתנול 100% מאובטח.
    7. להסיר את תגובת שיקוע, דגירה של 1 מ"ל של hexamethyldisilazane 10 דקות.
    8. פתח את מכסה ולתת דוגמאות הלילה יבש ברדס כימי.
    9. לתקן דוגמאות על התמיכה המתאים והמשך SEM ניתוח על פי פרוטוקולים הוקמה.
  3. דאפי, חי/מת מכתים
    1. יום 2, 4 ו- 7 לאחר זריעה על microcarriers התא לאסוף 0.5 מ ג של microcarriers טווה את הבקבוק והעברת כל אל צינור פלסטיק 2 מ"ל. לשטוף פעם עם 1 מ"ל של DPBS.
    2. דאפי
      1. לתקן את דגימות 10 דקות paraformaldehyde 4% מספיק לכסות אותן.
      2. לשטוף פעם עם 1 מ"ל של DPBS.
      3. דגירה בטמפרטורת החדר עם הפתרון מכתימים למשך 45 דקות על נדנדה מטרף.
      4. לאתר אות ניאון דאפי מיקרוסקופ זריחה עם מסנן פליטה nm 420, לרכוש תמונות.
    3. חי/מת מכתים
      1. דגירה דוגמאות µL 500 בפתרון צבע חי/מת. שומרים את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, מוגן מפני אור.
      2. לשטוף פעם עם 1 מ"ל של DPBS.
      3. לזהות קרינה פלואורסצנטית אות מתאים חיים עם מסנן פליטה 490 nm ו של תאים מתים עם מסנן פליטה nm 545-מיקרוסקופ זריחה. לרכוש תמונות.
    4. לבלוב assay עבור HDMECs
      1. µL 330 מיקס של קולגן R פתרון 0.4%, µL 170 של חומצה אצטית 0.1% ו- 50 µL של M199 בינוני צינור פלסטיק 15 מ"ל. לשמור על הקרח.
      2. קח ~0.375 מ"ג של microcarriers (250 µL) עם השימוש micropipette. להעביר צינור פלסטיק 1.5 mL, לחכות microcarriers RCP ליישב את העניין ולהסיר את המדיום לחלוטין.
        הערה: זה מבוסס על משקל יבש משוער של RCP microcarriers שלפני החיטוי.
      3. הוסף את הנפח של NaOH 0.2 N הנדרש כדי לנטרל את התערובת קולגן ומערבבים מיד עם microcarriers RCP.
        הערה: לקבוע את הכמות הנדרשת של NaOH 0.2 N מראש על-ידי הוספתו לתערובת עד שינוי ב- pH (פונה מן צבע צהוב כדי ורוד), ולאחר מכן מציבים את התערובת בחממה עבור 1 דקות, לאחר מכן ג'ל חייב להיווצר.
      4. צלחת התערובת microcarriers ג'ל-RCP קולגן בטוב של צלחת 24-. טוב. דגירה-37 ° C ו- 5% CO2 למשך 30 דקות.
      5. להוסיף 200 µL של כלי הדם צמיחה אנדותל (למשל, VascuLife VEGF-Mv תרבות בינוני). דגירה-37 ° C ו- 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
      6. להתבונן במיקרוסקופ נראה שלב ניגודיות באמצעות 10 X הגדלה אובייקט, ולרכוש תמונות.

5. Biomatrix seeding, התחלה של מערכת ביוריאקטור עבור HDMECs

  1. יום אחד לפני תחילת התרבויות ביוריאקטור, לחתוך פתח BioVaSc (biomatrix) longitudinally בצד antimesenteric ולתקן את זה בתוך מסגרת פוליקרבונט מחוטא בעבר (ראה איור 3 א, ב').
    הערה: BioVaSc הוא biomatrix המתקבל קטע decellularized jejunal חזירי, מוכנים כמו בעבר שפורסמו21.
    הערה: כאשר לא ניתן לעקר את המסגרת פוליקרבונט על ידי חום, לחטא אותה על ידי הדגירה 20 דקות באמבט סוניק (40 kHz) ואחריו הדגירה 3 פעמים באתנול 70% למשך 25 דקות. לאחר מכן, לשטוף את המסגרת 3 פעמים עם DPBS סטרילי.
    1. למקם את המערכת biomatrix-מסגרת 100 מ מ פטרי ולמלא אותו כלי הדם צמיחה אנדותל + 1% פניצילין סטרפטומיצין (עט/דלקת).
    2. Equilibrate את biomatrix על ידי המקננת בן לילה-CO 37 ° C ו-5%2.
  2. לאחר ניתוק וספירת תאי, להזריק 10 x 107 HDMECs ב 1000 µL של תרבות בינוני דרך להערכת משומרת של biomatrix, עם השימוש של מזרק 2 מ"ל.
    הערה: להזריק ~ 700 µL דרך הים עורקים ו ~ 300 µL דרך הווריד לשקע.
  3. דגירה-37 ° C ו- 5% CO2 במשך 3 שעות, כדי לאפשר התא מצורף.
  4. למלא את המערכת ביוריאקטור 350 מ ל כלי הדם צמיחה אנדותל + 1% עט/סטרפ דגירה -CO 37 ° C ו-5%2.
  5. להציב את המסגרת בתוך הכלי של ביוריאקטור. להתחבר pedicles ובורידים. כלי הקיבול.
  6. להתחיל את הטפטוף על-ידי התחברות למערכת ביוריאקטור משאבה סחרור. להגדיר את הלחץ ±1 10 מ מ כספית, משרעת.
  7. להגביר את הלחץ stepwise כל שעה עד שהגיע 100 מ מ כספית בלחץ, משרעת ± 20.
  8. לשמור על מערכת ביוריאקטור במשך 7 ימים בתנאים אלה-CO 37 ° C ו-5%2.

6. תוספת של RFP-HDMECs כדי biomatrix

  1. µL 330 מיקס של 0.4% קולגן R פתרון, 170 µL של חומצה אצטית 0.1% ו- 50 µL של M199 בינוני בשפופרת בז 15 מ"ל. לשמור על הקרח.
  2. סעו microcarriers RCP את המבחנות ספינר. הסר את המדיום תרבות לחלוטין.
  3. הוסף את הנפח של NaOH 0.2 N הנדרש כדי לנטרל את התערובת קולגן ומערבבים מיד עם microcarriers RCP.
  4. להוסיף את התערובת microcarriers ג'ל-RCP קולגן לומן של biomatrix. לאפשר gelation למשך 30 דקות.
  5. במקביל, לשנות את המדיום של ביוריאקטור על-ידי הסרת המדיום לחלוטין ולאחר מכן להוסיף 350 מ של טרום טריים, מחמם, כלי הדם צמיחה אנדותל + 1% עט/סטרפ.
  6. להתחבר ביוריאקטור את משאבת סחרור ולהגדיר את הלחץ ב- 100 מ מ כספית, משרעת ± 20.
  7. לשנות את המדיום מדי 7 ימים.
  8. לשמור את ביוריאקטור בתרבות 21 ימים.

7. ניתוח, הקריאות של תרבויות ביוריאקטור

  1. הכנת הדגימות
    1. נתק את biomatrix ביוריאקטור ולהסיר אותו מהמסגרת פוליקרבונט.
    2. לחתוך את פיסת שהושג למקטעים 6: 2 עבור MTT, 2 עבור פרפין הטבעה/צביעת ו-2 לניתוח SEM.
  2. פרפין הטבעה
    1. במקום הסעיפים בצלחת פטרי, לשטוף עם מספיק DPBS כדי לכסות אותם. למחוק את DPBS.
    2. לתקן בסעיפים 4% paraformaldehyde בין לילה.
    3. להכין הקלטות להטבעת פרפין ולבצע אותו על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    4. להכין את המקטעים בבלוקים פרפין וחותכים דגימות של מיקרומטר 3 עבור H & E מכתים, עם השימוש מיקרוטום.
  3. H & E מכתים
    1. כתם ולמיומנות סעיפים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים32.
  4. סריקה ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
    1. במקום הסעיפים בצלחת פטרי, לשטוף עם מספיק DPBS כדי לכסות אותם. למחוק את DPBS.
    2. לתקן את הסעיפים גלוטראלדהיד 4.75% בין לילה.
    3. לבצע התייבשות שרשרת עם הגדלת ריכוזי אתנול 50% - 100%.
    4. לכסות את הסעיפים עם hexamethyldisilazane (HMDS) עבור 10 דקות להשליך HMDS בשימוש ולהוסיף HMDS טריים.
    5. לאפשר את הסעיפים כדי לילה יבש מתחת fume המנוע ולאחר מכן להכין את הדגימות עבור הדמיה.
  5. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT)
    1. מערבבים הכימית MTT עם כלי הדם צמיחה אנדותל, בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
    2. דגירה בסעיפים הפתרון MTT עבור 90 דקות-CO 37 ° C ו-5%2.
    3. לבחון את מבנה כלי הדם ואת מתחילה תא microcarriers בעין בלתי מזוינת או תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, כדי לזהות תאים פעילים סמויה. לרכוש תמונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כפי שמוצג באיור 1A, השגנו מספר גבוה של התאים קיימא על microcarriers RCP לאחר 7 ימים של תרבות, נקבע על ידי צביעת חי/מת. תוצאות אלה שאושרו על-ידי ניתוח SEM, שבה נצפו microcarriers לחלוטין להפקר סביב הנקבוביות, חלקית overgrowing אותם (איור 1B). מצד שני, ניסויים שבהם התאים היו לא אחיד נזרע הביא מספר microcarriers ריק. ניסויים כושלים מאופיינים על ידי מספר גבוה באופן חריג של תאים מתים, זה לא צריך להיות מעל 10% מהסכום הכולל תא (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אחת המטרה העיקרית של microcarrier היא ההרחבה של תאים תוך שמירה על בידול שלהם על מנת להעביר תאים במקום הצורך. השיטה מייצגים מציגים RCP microcarriers שבו התאים היו מסוגלים לצרף להתרבות, ליישב את microcarriers עם צפיפות גבוהה התא. זה נצפתה על ידי חי/מת מכתים, שבו התגלו יותר מ 90% מכלל התאים קיימא ואילו רק כמה תאים מתים התקבלו לאחר 7 ימים של תרבויות דינמי. כמו כן, תמונות SEM אישר כי התאים מכוסה השטח כולו של microcarriers לאחר 7 ימים של תרבויות.

כדי להבטיח הישרדות cell במודלים תלת-ממד, חשוב לשמור ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחקר שהוביל את התוצאות הללו קיבלה מימון מן האיחוד האירופי השביעי מסגרת תכנית האיחוד FP7/2007-2013 תחת גרנט הסכם n ° 607051 (ביו-השראה). אנו מודים וקרולין מדריכים סיורים במתחם ואן Spreuwel-גוסנס של Fujifilm ייצור Europe B.V., לקבלת סיוע טכני במהלך הייצור RCP, ורנר סטרקה ממוסד פראונהופר עבור סיליקט מחקר ISC, לקבלת סיוע בניתוח SEM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT)Serva Electrophoresis GmbH20395.01
4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI)Sigma-AldrichD9542
חומצה אצטית 100%Sigma-Aldrich533,001
איזון אנליטי קרן EG 2200-2NMקרן & Sohn GmbH
Ascorbate-2-phosphateSigma-AldrichA8960
ביו-ריאקטורלהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, וירצבורג, גרמניה
מיקרוסקופ שדה בהיר Axiovert 40CCarl Zeiss AG
CellnestFujifilm
צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל, 50 מ"ל)Greiner Bio-One
תמיסת קולגן R 0,4%Serva Electrophoresis GmbH47254.01
DMEM-F12Gibco11320-033
Dulbecco's Phosphate Buffered SaltSalt Sigma-AldrichD8537מעובד, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלוריד
אאוזין 1%מורפיסטו10177.01000
אתנול 96%Carl Roth GmbHT171.4
סרום עגל עוברי מפורק (FCS)Bio& למכורFCS. ADD.0500לא מומת חום
מיקרוסקופ פלואורסצנטי BZ-9000Keyence
HaematoxylinMorphisto10231.01000
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191דרגת ריאגנט, ≥ 99%
חממה לביו-ריאקטוריו"ר הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, וירצבורג, גרמניה
ערכת צביעה כפולה של תאים חיים/מתיםFluka04511KT-F
צלחת מערבל מגנטית2Mag80002
בינוני 199Sigma-AldrichM065010X
קורא מיקרו
Tecan Infinite M200		Tecan
מחט 21 גרם 16 מ"מVWR613-5389
פפאין מלטקס פפאיהSigma-AldrichP4762אבקה ליופילית, ≥ 10 יחידות/מ"ג חלבון
פרפיןCarl Roth GmbH6642.6
פניצילין/סטרפטומיציןSigma-AldrichP4333
משאבה פריסטלטיתIsmatec
Quanti-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקתתרמו פישר מדעיP7589
היסטופיקס 4%קארל רוט GmbHP087
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק סופרה 25Carl Zeiss AG
תמיסת נתרן הידרוקסיד 1.0 NSigma-AldrichS2770
(25 מ"ל)356879Wheaton
1 מ"לVWR720-2561
צלוחיות תרבית רקמות (25 ס"מ2, 75 ס"מ2, 150 ס"מ2)TPP Techno Plastik Products AG
Trypan כחול 0.4%Sigma-AldrichT8154
VascuLife VEGF-Mvטכנולוגיית תאיםLifeline LL-0005
יו"ר צלוחיות ספינר מזרק

מקורות

  1. Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), Translation 51-57 (2015).
  2. Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
  3. Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025(2015).
  4. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
  5. Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O'Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
  6. Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
  7. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
  8. Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
  9. Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
  10. Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
  11. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
  12. Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
  13. Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
  14. Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
  15. Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23(2012).
  16. Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
  17. Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  18. Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
  19. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
  20. Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
  21. Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460(2013).
  22. Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
  23. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , New York. (2002).
  24. Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
  25. Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
  26. Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
  27. Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885(2016).
  28. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  29. Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
  30. Plunkett, N., O'Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
  31. Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
  32. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986(2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

קולגן רקומביננטי אני Microcarriers פפטיד עבור הרחבת התא והשתמש פוטנציאלי שלהם כמערכת מסירה תאים במגיב ביולוגי מדגמן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.