גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנאפלואידיה עובריים הוא הגורם הגנטי פוריות אצל בני אדם. רוב האירועים האלה מקורם במהלך המיוזה הנשי, אמנם בקורלציה חיובית עם גיל, גיל לבד לא תמיד חזוי של הסיכון של יצירת העובר aneuploid. לכן, ג'ין גרסאות אולי חשבון סגרגציה כרומוזום שגוי במהלך oogenesis. בהתחשב בכך גישה oocytes האנושי מוגבל למטרות מחקר, סדרה של מבחני פותחו כדי לחקור פונקציה גנים אנושיים במהלך המיוזה אני משתמש בעכבר oocytes. ראשית, RNA שליח (mRNA) של ג'ין, ג'ין וריאנט של עניין הם microinjected לתוך prophase העכבר עצרתי oocytes. לאחר המאפשר זמן הביטוי, oocytes משתחררים באופן סינכרוני אל ההבשלה meiotic להשלמת מיוזה אני. על-ידי תיוג של mRNA עם רצף של עיתונאי פלורסנט, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (Gfp), הלוקליזציה של החלבון האנושי יכול להיות מוערך בנוסף התיקונים פנוטיפי. לדוגמה, רווח או הפסד של הפונקציה יכול ייחקרו על-ידי יצירת תנאים ניסיוני זה אתגר המוצר ג'ין כדי לתקן שגיאות meiotic. המערכת הזו אמנם יתרון בחקירת פונקציה חלבון אנושי במהלך oogenesis, פרשנות נאותה של תוצאות צריך להתבצע בהתחשב בכך ביטוי חלבון אינה ברמות אנדוגני, ו, אלא אם כן מבוקר על (קרי הפיל . או למטה), מאתר homologs נמצאים גם במערכת.
מבוא
פוריות היא מחלה המשפיעה על 10-15% מן האוכלוסייה האנושית של גיל הרבייה 1, שממנה כמעט למחצית מחפשים טיפול רפואי 2. למרות האטיולוגיה של בעיות פוריות היא מגוונת, ובמקרים רבים multifactorial, סטייה גנטית הנפוץ ביותר אצל בני אדם הוא אנאפלואידיה עובריים 3. אנאפלואידיה מוגדר הסטייה (רווח או הפסד) של המספר הנכון של הכרומוזומים בתא. התופעה של aneuploidy של עוברי אדם נפוצים, עולה עם גיל מתקדם 4,5. ארבעה מחקרים אקראיים מבוקרים הדגישו את היתרון של בחירת הנורמלי היחיד chromosomally (euploid) עוברי להעברה הרחם כי אסטרטגיה זו, גרמו המחירים השרשה מוגברת, נמוכים הפלה, זמן קצר יותר להשגת הריון 6,7,8,9. לכן, הבנת האטיולוגיה של aneuploidy האנושי יכול להיות השלכות חשובות ברבייה בסיוע.
למרות בדיקה גנטית טרום השרשה, עבור aneuploidies הוא מועיל בטיפולי פוריות, הבנה מעמיקה של מה aneuploidies מקורם עדיין לוקה בחסר. מקובל כי קיים מתאם חיובי של aneuploidies meiotic (מקורו בתהליך הייצור תא רבייה), גיל, עם זאת, כמה נשים אנאפלואידיה עובריים התעריפים הנוכחיים שסטו מהתעריף הממוצע שלהם נתון בגיל 4. במקרים אלה מראים כי גיל לבד אינה תמיד חזוי של הסיכון של יצירת העובר aneuploid. גורמים אחרים עשויים לשחק תפקיד בהגדלת הסיכון של aneuploidy עובריים, כגון גן משתנים.
היבט מרכזי של חוקרים פוטנציאל התרומה של variant ג'ין כדי אנאפלואידיה במהלך המיוזה oocyte היא לתכנן מערכת להעריך במהירות ג'ין meiotic הפונקציה. בשל אילוצים אתית גישה מוגבלת, זה לא מעשי לבצע ניסויים אלה באמצעות ביצים אנושי. נושאים אלה יכולים שיפרו באמצעות העכבר oocytes, ויש כאן סדרה של מבחני להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני המתואר. על ידי microinjecting קידוד RNA שליח (mRNA) את הווריאציה גנים של הריבית, הלוקליזציה של החלבון האנושי של הביצה העכבר יכול להיות דמיינו ועל משמש כדי לקבוע אם ביטוי חוץ רחמי של החלבון אדם פראי-סוג של מוטציה תוצאות בכל שינויים פנוטיפי העלולה להוביל אנאפלואידיה. פנוטיפים אלה כוללים עלייה ב- microtubules כי לצרף אחותי לא במקום קינטוכור וחוסר יכולת לתמוך יישור כרומוזום-מפה של מיוזה אני חשוב, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור גם להפסד ורווח של פונקציה וריאציות גנטיות על-ידי יצירת תנאים מסוימים ניסיוני לאתגר את אירועי מפתח oocyte מיוזה כגון ציר יישור ובניית כרומוזום 10.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שיבוט מולקולרי
- להשיג רצף קידוד באורך מלא של הגן עניין, פלסמיד במבחנה שעתוק (pIVT) וקטור11.
הערה: שיבוטים cDNA באורך מלא זמינים מסחרית של ספקים שונים או יכול להיווצר באמצעות תגובת שרשרת של פולימראז שעתוק במהופך (RT-PCR). המרכז הלאומי עבור משאב מקוון ביוטכנולוגיה מידע (NCBI) מספק התעתיק רצפי הגנים נוקלאוטיד ו ביטא רצף מתויג מסדי נתונים (EST). על מנת להקל על חלבון הדמיה וניתוח של רמות הביטוי, פיוז'ן כדי חלבון פלואורסצנטי ירוק (Gfp) או אחר מתאים תגית פלורסנט ייתכן בעיצובן באסטרטגיית שיבוט. - באמצעות אסטרטגיה שיבוט מאומתים, הכנס את רצף קידוד של הגן עניין האזור שיבוט מרובים של pIVT. תיאור מפורט של שיבוט מולקולרי ואת הפעולות הנדרשות כבר בעבר תיאר 12.
הערה: אם המוצר ג'ין-fusion שיווצר, להיות בטוח כי השיבוט הוא במסגרת שקריאה תקינה. - רצף הבונה באמצעות תחל גלובין להבטחת ההכנסה הגן הנכון, פיוז'ן במסגרת נכונה, כי אין מוטציות נקודה פולימראז-induced שנוצרו.
הערה: אם ציוד רצפי DNA סנגר אינה זמינה, חברות רבות מציעות אפשרויות בעלות נמוכה של רצפי DNA. - Mutagenize DNA אם יצירת פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) או הוספות/מחיקות (INDELS). מוטגנזה מכוונת דנ א מתואר במסגרת צעדים 1.5-1.7 להלן. עבור פראי-סוג המבנים, להמשיך עם הצעד לינאריזציה 1.7.
- עיצוב מוטגנזה מכוונת תחל והשלם את תגובת ה-PCR מוטגנזה מכוונת ליצירת מוטציה לבנות לכל הפרוטוקול של היצרן. בתיווך PCR מוטגנזה כבר שתואר לעיל 13. בנוסף, חברות רבות מציעות מוטגנזה קיטים הכוללים פרוטוקולים.
- להפוך mutagenized DNA חיידקי המארח. לבודד ולטהר פלסמיד.
הערה: חברות רבות לבצע ערכות שיכול לשמש בקלות לבודד, לטהר את הדנ א פלסמיד. בצע את יצרני פרוטוקול בהתאם. אם משתמש זן חיידקי גראם שליליים כגון e. coli, מומלץ להשתמש ערכת מסיר endotoxins. - רצף ה-DNA מבודד של חיידקי transformants באמצעות רצפי DNA סנגר סטנדרטי כדי לאשר מבוא הסנ פ או ויאסין הרצוי.
- Linearize המוצרים הסופיים באמצעות אנזים הגבלה יחיד העיכול של ה-DNA מטוהרים.
הערה: וקטור pIVT מכילה מספר יחיד-האנזים חותך אתרים רשומים במפת פלסמיד Addgene 14. - ודא שהמוצר ליניארית באמצעות agarose בג'ל. המתודולוגיה עבור agarose בג'ל בעבר כבר מוגדר 14.
הערה: כל השלבים הנותרים, לשימוש מכשול (מסנן) pipet עצות וחומרים ללא RNase כדי להבטיח ייצור איכותי יציב RNA. - לטהר המוצר מתעכל באמצעות פרוטוקול ניקוי הדנ א מאומתים או קיט, elute 30 µL RNase/DNase ללא מים.
הערה: ספין סיליקה-מטריקס ערכות מבוססי עמודה מומלצים לאיכות גבוהה, טהור הדנ א. בצע את יצרני פרוטוקול בהתאם. - במבחנה לתעתק את הדנ א באמצעות פולימראז T7 ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- לטהר, elute RNA ב 30 µL של מים בחינם RNase/DNase באמצעות מטריצה סיליקה ספין מבוססי עמודה חומצת גרעין ערכת טיהור ע פ הפרוטוקול של היצרן.
- מבצע denaturing agarose ג'ל אלקטרופורזה באמצעות פורמלין לאשר לגודל הסופי של מוצר ה-RNA. ראה שלבים 1.13-1.22 מתחת 14. (איור 1).
- הכנת ג'ל על ידי חימום agarose 1 g ב- 72 מ ל מים עד התפרקה, ואז צנני עד 60 מעלות צלזיוס.
- הכינו 10 X מגבים, מכשירי ריצה מאגר על-ידי הוספת 0.4 מ' מגבים (pH 7.0), 0.1 M סודיום אצטט ו 0.01 M EDTA.
- להוסיף 10 מ של 10 X מגבים, מכשירי הפעלה מאגר, ו- 18 מ של 37% פורמלדהיד (12.3 M) לפתרון agarose מקורר.
- קאסטה הג'ל על ידי מזיגת הפתרון agarose לתוך מיכל יוצרי ג'ל. השתמש מסרק גדול דיו כדי להתאים 10 µL. לאחר ג'ל הגדיר מוצקה למגע, להסיר בעדינות את המסרק.
- להרכיב את ג'ל אלקטרופורזה טנקים, והוסף מספיק 1 X מגבים, מכשירי ריצה מאגר, המבטיח שהג'ל מכוסה לגמרי.
- להכין RNA לדוגמה על-ידי הוספת 1 µg של RNA X 0.5, נפחי המכילים פורמלדהיד לצבוע טעינה.
- הוסף אתידיום ברומיד לפתרון ה-RNA-ריכוז של 10 µg/mL.
- Denature רנ א פתרון לדוגמה ב- 70 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- שימוש סטרילי, 10 טיפים מסנן µL, לטעון µL 5 של משקל מולקולרי סמן ו- 5 µL של RNA sample(s) לתוך בארות נפרדים של הג'ל electrophorese ב V 5/ס מ עד לצבוע יש היגרו לפחות שני שליש מאורכו של הג'ל.
- דמיינו את הרנ א הג'ל על המאייר טרנס UV. ודא שהרנ א תהיה בגודל הנכון על-ידי השוואת עד לסימון משקל מולקולרי.
- כדי למדוד את ריכוז וטוהר RNA, העברה µL 1.2 של RNA מטוהרים באמצעות סטרילי טיפים מסנן 10 µL אל ספקטרופוטומטרים-UV.
שים לב שיש RNA באיכות גבוהה ספיגת יחס של A260/280 (1.8-2.2), 260/230 (> 1.7) בהתאמה. - באמצעות 10 µL מסנן טיפים, aliquot את הרנ א מטוהרים הנותרים לתוך סטרילי 0.5 µL צנטריפוגה צינורות (3-5 µL/צינור). מאחסנים צינורות ב-80 מעלות צלזיוס עד מוכן microinjection.
הערה: ריכוז הזרקת הסופי של 500 ng/µL היא נקודת מוצא אופטימלית. מומלץ לדלל את הרנ א 1:2 ב RNase H20 לפני microinjection כדי להפחית את הדביקות של רנ א ב microinjection פיפטה חינם.
2. קינטוכור-Microtubule מצורף Assay
- לחלק oocytes קבוצות שוות עבור microinjection.
הערה: אוסף Oocyte, העברה, microinjection ו- meiotic ההבשלה בכללותה תוארה בפירוט יופיטר בעבר 15. - Microinject קבוצה אחת עם ה-mRNA ניסיוני ולא על קבוצות אחרות עם הפקד WT, PBS או Gfp mRNA.
הערה: 500 ng/µL הוא ריכוז הזרקה מומלץ להתחיל עם 10. Picoinjector יכול לשמש כדי לשלוט סכומי ההזרקה. אמצעי הזרקה של 5-10 pL מומלץ 15. - שימוש ביד או בפה מכשירים המופעלים pipetting איפה הזכוכית פיפטה הפתיחה הוא מעט גדול יותר מקוטר oocyte (100-150 מיקרומטר), העברה oocytes לתוך טיפת 100 µL מילרינון ללא תרבות במדיום צלחת פטרי מכוסה העובר איכות שמן מינרלי דגירה oocytes במשך 7 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% C02 כדי לאפשר התבגרות מספיקות כדי מפה של מיוזה אני (פגשתי אני) 15.
- לאחר דגירה, באמצעות המנגנון פיפטה אותו כאמור לעיל, להעביר oocytes לתוך תבשיל תרבות מרכז-ובכן איברים המכילים µL 700 בינוני אוסף המדיה חיוני המינימלי טרום מקורר (מאמ) במרכז טוב ו- 500 µL H20 בזירה מבחוץ, מניחים צלחת על קרח במשך 7 דקות.
הערה: מומלץ מראש להירגע MEM המדיה, מרכז טוב איברים מנות תרבות ב-20 מעלות צלזיוס למשך לפחות 20 דקות לפני טיפול של oocytes. - לתקן את oocytes על-ידי העברת אותם באמצעות המנגנון פיפטה לבאר של צלחת זכוכית שקופה ספוט המכיל 400 µL של 2% paraformaldehyde ב- PBS X 1 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- באמצעות אותו פיפטה המנגנון, להעביר את oocytes לבאר עוד על צלחת ספוט המכיל 400 µL פתרון חסימה (PBS + 0.3% BSA + 0.01% % Tween-20 + 0.02 נקודות נאן3) וחנות ב 4 ° C עד מוכן לעבד עבור immunostaining.
הערה: עבור אחסון oocytes ב 4 ° C, לוח הזכוכית המכסה ספוט עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע אידוי. - באמצעות אותו מנגנון פיפטה, העברה oocytes אל באר חדשה במקום צלחת פתרון permeabilization המכיל 400 µL (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + נאן 0.02%3), דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 הגבלת העברת oocytes במהירות באמצעות שלוש טיפות של 400 µL חסימת פתרון כדי להסיר את שאריות חומרי ניקוי.
הערה: צלחת זכוכית שקופה 9-ובכן ספוט עובד היטב עבור העברת קבוצות באמצעות טיפולים מרובים על מנה אחת (שלבים 2.4-2.5). - בצע את ההליכים immunocytochemistry הנותרים כדורים humidified, מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר. השתמש מיכל פלסטיק בגודל בינוני שלאורכו מגבות נייר לח ומכסים ברדיד אלומיניום.
- שימוש במנגנון פיפטה, להעביר oocytes 30 µL חסימת פתרון על המכסה 96-ובכן צלחת ומקום בתוך תא humidified למשך 10 דקות.
הערה: טיפות מוצבים על indentions מעגלית על הצלחת. - תווית centromeres, פלך, שימוש במנגנון פיפטה, להעביר oocytes 30 µL חסימת המכילה centromeric נגד אנטיגן (ACA, קרסט) (1:30) וטובולין אנטי-acetylated (1:1000), תקופת דגירה של פחות שעה.
- לשטוף oocytes על ידי העברת דרך µL 30 שלוש טיפות של חסימת פתרון עבור 10 דקות כל אחד.
- באמצעות המנגנון פיפטה, העברה oocytes כדי µL 30 ירידה של פתרון חסימה המכיל נוגדנים משניים משלימים את הגוף כמתואר לעיל (האדם אנטי איג 1:200, העכבר אנטי איג 1:200) ולאחר תקופת דגירה של 1 h.
- חזור על השלבים 3, 10 דקות השטיפה ב 30 µL חוסם הפתרון כפי שמתואר בשלב 2.11.
- להעביר את oocytes, באמצעות המנגנון פיפטה, אל תוך 3-5 µL הרכבה דאפי המכילות בינוני (5.9 µg/µL) על משטח זכוכית מיקרוסקופ.
- במקום 4 טיפות קטנות (בגודל של ראש סיכה) של וזלין על הפינות של תגית כיסוי כדי למנוע ריסוק של oocytes.
- הנח בעדינות את הצד וזלין מכסה את אותן לשקופית.
- חותם coverslip קצוות עם לק ויכין אפשר להתייבש במשך 5 דקות.
- לאחסן שקופיות ב 4 ° C, מוגן מפני אור, עד עיבוד באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
הערה: ודא מקדם שבירה של התאמות הרכבה בינונית, ואת coverslip, מטרות מיקרוסקופ מנוצל. הרכבה מומלץ חומרים היו בעבר תיאר 15. - תמונה oocytes באמצעות מטרה x 40-63 על מיקרוסקופ קונפוקלי, לכידת צעדים קטנים (≤ 1 מיקרומטר) ב z-המישור, ממוטב עבור המטרה עבודה וכן תמונה בכל האזור בכישור מפה של.
הערה: הקפד תמונה כל הערוצים 3 מבוסס על נוגדנים ספציפיים משני בשימוש בשלב 2.11. התמונה בממוצע ≥ 4 וזום של 3 הינם אידיאליים עבור פתרון הולם. גודל צעד 1 מיקרומטר מספק הדמיה ברורה של microtubules, kinetochores ב oocytes העכבר. ההליך עבור לכידת התמונה תשתנה מיקרוסקופ כדי מיקרוסקופ. עיין במדריך למשתמש קונאפוקלית של יצרני השלבים על אופן קביעת התצורה של הגדרות מיקרוסקופ. - לזהות מצב קובץ מצורף קינטוכור-microtubule באמצעות תוכנת הדמיה בעקבות צעדים 2.21-2.23 להלן.
הערה: השלבים הבאים מתארים הליך זה באמצעות תוכנה חופשית להורדה תמונות J (NIH), עם זאת, ניתן להשתמש בתוכנה הדמיה חלופי. מצב מצורפים סוגי בעבר היה מוגדר 16 . - תמונה פתוחה על-ידי גרירת קובץ לתוך סרגל הכלים תמונה J.
- נפתח z-הסדרה, הופכות כל ערוצי גלוי (DNA קינטוכור, פלך) על ידי לחיצה על 'מזג ערוציםזמינים בתפריט הנפתח 'תמונה', תחת הלשונית sub "צבע".
- שימוש של דו-מצבי בחלק התחתון של התמונה, לעבור כל z-פרוסה ולקבוע קינטוכור microtubule המצורף. מפורט מצורף התיאור היה בעבר תיאר 16
3. כרומוזום יישור אתגר Assay
- באמצעות המנגנון פיפטה כפי שמתואר בשלב 2.3, להעביר oocytes לתוך טיפת 100 µL מילרינון ללא תרבות בינוני תחת שמן ואת דגירה oocytes במשך 7 שעות לאפשר התבגרות מספיקות כדי מפה של מיוזה אני (פגשתי אני) כאמור שמתואר בשלב 2.3 17 .
הערה: ההליכים אוסף microinjection, ההבשלה Oocyte היו שתואר קודם לכן 15. עיין פרוטוקול assay מצורף בשלבים 2.1-2.2 עבור פקדים, ריכוזי microinjection RNA. - באמצעות אותו מנגנון פיפטה, העברה oocytes איברים. ובכן מרכז לתרבות מאכל המכיל 700 µL תרבות בינוני המכיל monastrol [100 מיקרומטר] מרכז µL 400 ובקו H20 בזירה שמסביב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
- לשטוף monastrol על ידי העברת oocytes, בעזרת המנגנון פיפטה כמו לעיל, דרך 3 טיפות של 100 µL CZB תרבות בינוני, ולאחר מכן להעביר את oocytes לצלחת תרבות מרכז-ובכן איבר חדש המכיל 700 µL תרבות בינוני + MG132 [5 מיקרומטר] עבור 3 שעות במרכז טבעת. להוסיף 400 µL H20 הטבעת מבחוץ.
- לתקן את oocytes על-ידי העברת אותם, באמצעות המנגנון פיפטה, לבאר של צלחת זכוכית שקופה ספוט המכיל 400 µL 2% paraformaldehyde ב- PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר קיבוע, להעביר את oocytes, באמצעות המנגנון פיפטה, לתוך באר חדשה של צלחת זכוכית שקופה ספוט המכיל 400 µL פתרון חסימה וחנות ב 4 ° C עד מעובד עבור immunostaining.
הערה: עבור אחסון oocytes ב 4 ° C, לוח הזכוכית המכסה ספוט עם מצלמות-מיקרוסקופים כדי למנוע אידוי. - Permeabilize, תווית oocytes ויה immunocytochemistry כמתואר בצעדים 2.6-2.16.
- תמונה oocytes באמצעות מטרה x 40-63-מיקרוסקופ קונפוקלי, לכידת < 1 מיקרומטר צעדים במישור z-מקפיד תמונה את כל האזור של מפה של כישור.
- כדי לזהות כרומוזום יישור מצב לפתוח קבצי תמונה באמצעות תוכנת הדמיה.
הערה: השלבים הבאים מתארים הליך זה באמצעות תוכנה חופשית להורדה תמונות J (NIH), עם זאת, ניתן להשתמש בתוכנה הדמיה חלופי. - גרור תמונה תמונה J הבקרה.
- בסדרה שנפתחו z-, השתמש בכלי פוינט (זמין על-ידי לחיצה על סמל הכלי נקודה על הבר פקד התמונה J) לסמן נקודות בסוף אחד מקטביו ציר ב- z-פרוסה בהתאמה שלהם על-ידי הצבת את הכלי מעל הקוטב פלך בתמונה ולחיצה על התמונה. להוסיף נקודות אלה לאזור של מנהל ריבית (ROI) על-ידי לחיצה על הפקודה + t במקלדת.
- לקבוע את נקודות הציון ספציפי לכל אחת העמדות שהגדרת בשלב 3.10 על ידי הדגשת הנקודה ספציפי במנהל רועי ולחיצה על לחצן אמצעי. פעולה זו תספק תוצאות המכיל טבלה x ו- y קואורדינטות עבור כל נקודה. הם יהיו הנקודות X1, Y1, ו- X1, Y2, בהתאמה.
- בשלב הבא, לקבוע את הקואורדינטה true Z. פעולה זו מתבצעת על-ידי הכפלת מספר הפרוסה הפרוסה z מסוים במחסנית z-שבו זוהה הקוטב פלך (קרי פרוסה #2 של 6) כי כל נקודה בודדת הוא על-ידי העובי מחסנית (כלומר 1 מיקרומטר) (דוגמה: פורסים 2 x 1 מיקרומטר = 2). הם יהיו נקודות Z1 Z2 בהתאמה.
- לקבוע אורך ציר באמצעות המשוואה משפט פיתגורס (2 + b2 = c2) באמצעות שהוגדרו בעבר x, y ו- z קואורדינטות מצעדי 3.11-3.13. עבור כל ציר האורך הסופי הוא שווה ל:
√((X1-X2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2) - לקבוע את midzone פלך. זה מחושב כמו חצי האורך של כישור. שימוש בכלי קו ב- J התמונה, על ידי לחיצה על סמל הקו בבר כלי תמונה J, לצייר קו זה מהקוטב ציר אחד כדי midzone ציר. האורך יוצגו בסרגל כלי תמונה J.
- לקבוע מצב היישור כרומוזום על ידי הערכת כרומוזום מרחק midzone פלך בעזרת הכלי מדידה קו. באמצעות הכלי קו זמינות על-ידי לחיצה על סמל קו בסרגל כלי תמונה J, לצייר קו מ midzone פלך הכרומוזום. האורך יוצגו בסרגל כלי תמונה J. כרומוזומים גדול מ- 4 מיקרומטר מ midzone פלך נחשבים unaligned 18.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר במבחנה שעתוק RNA באיכות גבוהה יהיה יחס A260/A280 של (1.8-2.2) ≥1.7 יחס של A260/A230 כאשר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטרים. התמונה באיור 1 מציגה את ההעברה של במבחנה-ייצרו RNA על ג'ל agarose denaturing לאחר אלקטרופורזה. להקה הוא מרוח תבנית או מדגם בעל מספר להקות בגודל ניתן לציין זיהום או השפלה של המדגם. לחלופין, מספר להקות עשוי להצביע על זה ה-mRNA הוא לא לגמרי שפגע בסימני או פלסמיד ההתחלתי היה לא לגמרי לליניארית. ה-mRNA יפעל גדולים יותר חזה ב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בגלל הזיהוי הגובר וברכבות של האדם משתנים גנטיים הקשורים במחלה, זה חיוני כי מערכות נקבעו כדי להעריך את משמעותם ביולוגי. הבנת וחלבון לתפקד מיוזה האנושי מציבה אתגרים מסוים כי oocytes האדם יקרים ואינם זרע נדיר, האדם לבצע מניפולציות גנטיות. עכבר oocytes הם מערכת מודל בתרבית של ערך להערכת ג'ין meiotic האנושי פונקציה 10,23. מודל זה עוקף את impracticalities של שימוש ביצים האנושי תוך מתן זמינים ומקור oocytes נמוכים, manipulable עוברים מיוזה דומים לתאי נבט האדם בזמן להיות ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של האגודה האמריקנית לרפואת פוריות ו מן צ'ארלס בוש לקרן יוהנה לומד, המדינה באוניברסיטה של ג'אי כדי K.S. A.L.N. נתמך על ידי מענק של N.I.H. (F31 HD0989597).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.2 מ"ל צינור PCR Seal-Rite | ארה"ב Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb סולם DNA | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp סולם DNA | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X טעינת DNA צבע | Thermo Scientific | R0611 | |
| צלחת ספוט זכוכית 9 בארות | תומאס סיינטיפיק | 7812G17 | |
| Agarose | סיגמא אולדריץ' | A9539 | |
| אלבומין מסרום בקר | סיגמא-אולדריץ' | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 מצומד נגד עכבר IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 דילול |
| Alexa-fluor-633 מצומד אנטי אנושי IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 דילול |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| שולחן נגד רעידות | Manufacturing Corp | כל דגם סטנדרטי | |
| טובולין אנטי אצטילציה נוגדן | סיגמא אולדריץ' | T7451 | 1:100 דיטוציה |
| נוגדנים אנטי צנטרומריים (CREST) | נוגדנים משולבים | 15-234 | 1:30 דילול |
| קצות מחסום (מסנן) פיפטות | Thermo Scientific | AM12635 | ודא שהוא תואם למותג הפיפטורים שלך. אלה תואמים לפיפטורים של המותג אפנדורף. |
| מדיית תרבית מיובשת BD Difco: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco מדיית תרבית מיובשת: מרק LB, מילר (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| צינורות נימיים | Sutter | B100-75-10 | |
| צלחת תרבית איברים במרכז באר | VWR | 25381-141 | |
| מיכל | לחממה | ||
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | כל דגם סטנדרטי | |
| צנטריפוגה (עם יכולת קירור) | תומס סיינטיפיק | כל דגם סטנדרטי | |
| כיסוי זכוכית 11 x 22 מ"מ | תומס סיינטיפיק | 6663F10 | |
| כיסויים | תומס סיינטיפיק | 6663-F10 | עובי ישתנה עבור מיקרוסקופים מסוימים |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| אמבטיה יבשה דיגיטלית | תרמו סיינטיפיק | 888700001 | |
| קל גבוה אנזים שיבוט נאמנות | Agilent | 600400 | לשיבוט DNA |
| להשתמש באנזימים ליניאריזציה של pIVT | ניו אינגלנד Biolabs | NdeI או KasI | |
| אתידיום ברומיד | תרמו סיינטיפיק | 155585011 | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי | ||
| פורמלדהיד (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| צבע טעינת RNA פורמלדהיד | אמביון | 8552 | |
| שקופיות מיקרוסקופ חלבי (לא טעונות) 25X75 מ"מ | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| שיבוטי | ניתן להשיג מכל ספק המספק קריאה פתוחה שיבוטי מסגרת | ||
| מכשיר אלקטרופורזה ג'ל | Bio-Rad | כל דגם סטנדרטי | |
| זכוכית פסטר פיפטס | פישר סיינטיפיק | 13-678-200 | |
| גלובין קדימה פריימר למבנה | pIVT 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. ניתן לרכוש מכל חברה המייצרת אוליגונוצלוטידים מותאמים אישית | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' ניתן לרכוש מכל חברה המייצרת אוליגונוצלוטידים מותאמים אישית | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| ניתן | ב-Illustra | ||
| Ready-To-Go חרוזי RT-PCR | |||
| כל | דגם סטנדרטי עם טכנולוגיית CO2 ומעטפת מים | ||
| הידבקות נמוכה 0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפג | ארה"ב סיינטיפיק | 1405-2600 | |
| מקוקטור | תוכנת ניתוח רצף | MacVector | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| שקופיות מיקרוסקופ | פישר סיינטיפיק | 12-544-3 | |
| סמני רנ"א מילניום-פורמלדהיד | אמביון | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | השעיה ב-DMSO ב-2.5 מ"מ |
| שמן מינרלי | Sigma-Aldrich | M5310 | שנבדק בעובר, מסונן |
| סטרילי השעיה ב-DMSO ב-100 מ"מ | |||
| מיכל | |||
| N2 | ללק שולחן נגד רטט | ||
| ; נקה | ניתן להשתמש בכל לק שקוף | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis ספקטרופוטומטר | Thermo Scientific | כל דגם סטנדרטי | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running | buffer Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS מאגר ריצה | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| צלחת תרבית איברים 60x15 מ"מ | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | ||
| PCR תרמי Cycler | תרמו פישר 4484075 | ||
| צלחת פטרי 139 מ"מ | תרמו פישר סיינטיפיק | 501V | |
| צלחת פטרי 35 מ"מ | תרמו פישר סיינטיפיק | 121V | |
| צלחת פטרי 60 מ"מ | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks מיקרו-מזרק | כל דגם סטנדרטי | |
| מושך פיפטה | חולץ מיקרופיפטה חום בוער | דגם P-1000 | |
| pIVT פלסמיד | AddGene | 32374 | וקטור ריק המתאים לביטוי ביציות. |
| סרום סוסה בהריון גונדוטרופין | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | טיהור של עד 20 uL של DNA פלסמיד |
| QIAquick PCR ערכת טיהור Qiagen | 28104 | ||
| Quikchange II ערכת מוטגנזה מכוונת אתר | Agilent | 200523 | ערכת מוטגנזה להוספות ומחיקות |
| Quikchange ברק רב אתרים מכוון ערכת מוטגנזה | Agilent | ערכת מוטגנזה 210512 לשינויים באתר יחיד | |
| מספריים (נקודה עדינה) | כלים מדעיים עדינים | 14393 | |
| מספריים (נקודה בינונית) | כלים מדעיים עדינים | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | ארה"ב Scientific | 1615-5500 | |
| מחמם | כל דגם סטנדרטי | ||
| ספקטרופוטומטר (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | כל דגם סטנדרטי | ||
| יעילות תת-שיבוט DH5a תאים מוכשרים | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| מזרק | BD Bioscienes | 309623 | 1 מ"ל, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | ניו אינגלנד Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine תפוקה גבוהה ערכת שעתוק RNA מכוסה | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| פינצטה (נקודה עדינה - גודל 5) | כלים מדעיים עדינים | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free מים מזוקקים | תרמו פישר Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure אתידיום ברומיד 10 מ"ג / מ"ל | תרמו פישר Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV / לבן לייט transilluminator | פישר | UV95041501 | |
| מדעי Vectashield הרכבה מעבדות וקטור בינוני | H-1000 |
מקורות
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Jr Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T. Jr, Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24(2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , John Wiley & Sons, Inc. (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
