הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57466

⸱

10 באוגוסט 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Postgraduate institution, Guangzhou Medical University, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, 3Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopaedic Engineering, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 4Department of Chemistry, Chinese University of Hong Kong, 5Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג פרוטוקול כלכלי ופשוט עבור בידוד ישיר וטיהור של גזע mesenchymal של ניו זילנד הארנב הלבן synovial נוזל.

תקציר

גזע mesenchymal (MSCs) הם המקור העיקרי תא לטיפול מבוססת-תא. MSCs מן נוזל במפרק synovial יכול לשמש באופן פוטנציאלי הנדסת רקמות הסחוס. MSCs מ synovial נוזל (SF-MSCs) היה נחשב מבטיח מועמדים התחדשות מפרקיות, התועלת הטיפולית הפוטנציאלית שלהם גרמה להם נושא מחקר חשוב של המנוח. SF-MSCs מ חלל הברך של הארנב ניו זילנד הלבן יכול להיות מועסק כמודל translational ממוטבת כדי להעריך רפואה רגנרטיבית אנושי. באמצעות מבוססי CD90 מגנטי הופעל תא מיון טכנולוגיות (מקינטוש), פרוטוקול זה בהצלחה משיג ארנב SF-MSCs (rbSF-MSCs) ממודל זה ארנב ועל בהמשך מדגים באופן מלא על פנוטיפ MSC של תאים אלה על ידי גרימת אותם כדי להבדיל את תאי העצם, adipocytes ו- chondrocytes. לכן, ניתן ליישם גישה זו מחקר ביולוגיה של התא, הנדסת רקמות בעזרת ציוד פשוט ונהלים.

מבוא

MSCs שהוצעו מקור רב ערך עבור רפואה רגנרטיבית, במיוחד עבור סחוס נגעים. MSCs, כולל chondrocytes, תאי העצם, adipocytes, השלד של תאי שריר, תאי סטרומה מהבטן, בהרחבה להרחיב את אזורי עבור השתלת תא גזע עקב שלהם הרחבה גבוהה קצב ואת שושלת היוחסין מרובה בידול פוטנציאליים1. MSCs ניתן לבודד השלד שריר, synovium, מח עצם, רקמת שומן2,3,4. הממצאים יש גם confirmed את הנוכחות של MSCs בנוזל synovial, מחקרים קודמים זיהתה MSCs נגזר נוזל synovial (SF-MSCs) מבטיח מועמדים התחדשות מפרקיות5,6.

עם זאת, מחקר וניסוי פרה על דגימות האנושי כפופים סוגיות אתיות רבות. במקום זאת, ארנבים, ממשיכים להיות הכי נפוץ מיני בעלי חיים כדי להדגים כי השתלת של MSCs ניתן לתקן נזק לסחוס. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של חוקרים חקרו ארנב בתאי גזע mesenchymal (rbMSCs) בשני במבחנה , ויוו, כמו תאים אלה הם MSCs דומה האדם בפיזיולוגיה ביולוגיה ורקמות הסלולר שלהם. באופן דומה, rbMSCs מסוגלים הקפדה על משטחי פלסטיק, הצגת ציר-פיברובלסט מורפולוגיה כמו MSCs אנושי. יתרה מזו, דגימות mesenchymal הארנב הם פשוט וקל לקבל7. בנוסף, הנקודות המכריעים הם rbMSCs אקספרס סמני פני השטח, כגון CD44, CD90, CD105, ו הבידול השושלת מרובה פוטנציאליים נשמר, שהוא מסכים עם הקריטריונים לזיהוי של אוכלוסיות MSC כמו מוגדרת על ידי האגודה הבינלאומית הסלולר8,9. בפרט, chondroprogenitors נוזלים synovial מסוגלים chondrogenesis שאינם היפרטרופית כאשר שנגזרות TGF-β1, ובכך הופך אותם מקורות תא מתאים עבור10,התחדשות הסחוס במפרק phenotypically11, 12.

עם זאת, בידודו של SF-MSCs שונה במידה רבה רקמות אחרות, כולל את חבל הטבור, רקמת שומן, דם היקפיים ו מח עצם. כיום, הגישות הנפוצות הטיהור ומיון של SF-MSCs הם cytometry זרימה ומיון immunomagnetic מבוסס-חרוז, למרות השיטה cytometry זרימה דורש סביבה ספציפיים עם מכשירים יקרים מאוד13.

מאמר זה מציג שגרה עבור האוסף פשוטה ולא פולשנית של דוגמיות של נוזל synovial מניו זילנד וארנבים לבנים. במהלך ההליך, rbSF-MSCs stably המורחב במבחנה , ואז מבודדים CD90 נהלים חיובי מבוסס-חרוז מגנטי. לבסוף, הפרוטוקול מראה כיצד להשיג MSCs עם טוהר גבוהה, הכדאיות מן המקורות תא שנקטפו.

ב פרוטוקול זה, מבודד rbSF-MSCs מאופיינים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם, ביטוי של סמנים ספציפי, pluripotency של תאי גזע. Immunophenotyping מבוססי cytometry זרימה מגלה ביטוי חיובי משמעותי של CD44 ו- CD105, ואילו הביטוי של CD45 ו- CD34 הוא שלילי. לבסוף, וזמינותו במבחנה עבור rbSF-MSCs מדגים את הבידול osteogenic, adipogenic ו- chondrogenic של תאים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה אזוריות ולאחר כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על-ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה של שנג'ן השני של אנשים החולים, אוניברסיטת שנג'ן.

1. לבודד, תרבות rbSF-MSCs

  1. ההכנות לקראת ההליך בעלי חיים
    1. להתכונן לבגרות skeletally הנשי ניו זילנד וארנבים לבנים האוסף של rbSF-MSCs. לבצע בדיקה קלינית של הארנבים יום אחד לפני ההליך arthrocentesis והרדמה.
      הערה: בדיקות גופניות צריך לכלול משקל (2.0-2.5 ק"ג), מגדר (נקבה), ואת טמפרטורת הגוף, קצב נשימה, קצב הלב. פרמטר מרווחי לארנבים קלינית בריא הם 30-50 דקות עבור קצב נשימה, 220-280 דקות עבור קצב הלב, 38-39 מעלות צלזיוס על טמפרטורת הגוף.
    2. מהר החיות במשך 6 שעות לפני ההרדמה.
  2. ההכנות וההליך לקבלת ההרדמה בעלי חיים
    1. לרסן את הארנב. כלוב (ראה טבלה של חומרים), ואת להזריק 3% סודיום פנטוברביטל לווריד אוזן שולי במינון של 1 מ"ל/ק"ג על הרדמה כללית.
    2. הצב את הארנב בתנוחה הגבי-שכיבה נוחה.
    3. לנטר את קצב הנשימה, קצב הלב, טמפרטורת הגוף של הארנב במהלך הרדמה.
    4. השתמש משחה ophthalmologic את עיניו כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
    5. להעריך את עומק מההרדמה שאחרי הסיווג של Guedel14.
  3. הכנה MSCs בידוד והטיפוח -תרגול
    1. לטפח rbSF-MSCs, הכנת 500 מ"ל של מדיום תרבות מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בתוספת 10% מסחרי תוספת (ראה טבלה של חומרים), 10% עוברית שור סרום (FBS), ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. דגירה המדיום תרבות ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    3. היכונו 500 מ"ל תמיסת מאגר פוספט (PBS) בידוד תא, התא כביסה.
    4. היכונו 100 מ ל תמיסת מלח מול ההליך arthrocentesis חלל הברך.
  4. אוסף של מפרקיות fl synovial uid מתוך הברך של הארנב
    1. בחר אזור כ 5 x 5 ס מ בגודל סביב הברך, לגלח את השיער ארנב מהאזור הזה באמצעות גילוח של בטיחות.
    2. לסירוגין, לחטא האתר הליך 3 x עם povidone יוד פתרון ו- 75% אתנול. לאחר מכן, להחיל תחבושות חיטוי לאחר האזור ביסודיות יבש.
    3. להזריק 1-2 מ ל תמיסת מול, באמצעות מחט תת-עורית סטרילי (2 מ"ל), לתוך חלל משותף הברך מן המרחב מפרקיות לרוחב, להזיז את הברך 3-4 x ולאחר מכן למצוץ כל הנוזל synovial בטמפרטורת החדר.
    4. לסנן את fluid synovial דרך מסננת תא ניילון מיקרומטר 40 כדי להסיר את כל הלכלוך בתוך 4 שעות.
  5. תרבות של rbSF-MSCs
    1. לאסוף את fluid המסוננות ב 50 מ ל צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה-1,500 סל ד 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה, לשטוף את גלולה עם PBS, resuspend בגדר עם המדיום תרבות שלמה ולאחר מכן צלחת המדיום במנות 100 מ מ.
    3. דגירה כל המנות של 37 ° C באווירה humidified, המכילה 5% CO2.
    4. לאחר 48 שעות, לחדש את הכלים בינונית טרייה כדי להסיר תאים שאינם מחסידי. החלף את המדיום פעמיים בשבוע במשך שבועיים כמו המעבר 0 (P0).
      הערה: צריך להיות בערך 1 x 104 תאים חסיד. תאים למ"ל קיימא ב- SF הן בערך 2 x 102/mL.
    5. אחרי 14 יום לאחר ציפוי הראשונית של מושבות רבות צריך יצרו במנות תרבות. בחר את המושבות הגדולים מ- 2 מ מ קוטר. לסמן היכן ממוקמים המושבות שנבחר ע י איתור שלהם היקף בתחתית צלחת.
    6. למחוק את המושבות < 2 מ מ רחב, באמצעות תא מגרדים. לעכל את המושבות שנבחרו עם µL כ-5 של 0.25% טריפסין, באמצעות צילינדר שיבוט, ולהעביר את המושבות תבשיל חדש כמו מעבר 1 (P1).
  6. לאחר הניתוח טיפול בבעלי חיים
    1. בצע את ההליכים הפעלה מוסדי רגיל עבור ניטור שלאחר הניתוח של ההתאוששות מן ההרדמה.
    2. לעקוב אחר הסימנים החיוניים של הארנב כל 10 דקות עד שזה שהכרתו. לבסוף, העברת החיה בהכרה לכלוב. אל תשיבו ארנב עבר ניתוח החברה של בעלי חיים אחרים עד זה הוא החלים לחלוטין.
    3. פעולה-מאוחרת, לחטא את האתר עם 0.1% povidone יוד, 2 x ביום למשך 3 ימים.

2. CD90-חיוביות מגנטי הופעל התא מיון (מקינטוש) של rbSF-MSCs והתרבות העיקריים

  1. הכנת הדוגמא
    1. כאשר התאים מגיעים בסביבות 80% confluency, תשאף המדיום, ולאחר מכן להוסיף 1-2 מ של 0.25% טריפסין-EDTA על כל מנה.
    2. דגירה המנות למשך 2-3 דקות לאפשר ניתוק התא.
    3. ברגע התאים מנותקים, להוסיף כמות שווה של המדיום תרבות כדי להשבית את טריפסין.
    4. עוברים התליה תא דרך מסננת תא 40 µm, לאסוף את פילטרט של צינור 15 מ"ל, ואז לסובב את התאים ב g 600 × 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. Resuspend בגדר תא במקינטוש הפעלת מאגר (PBS, pH 7.2, אלבומין שור 0.5%, ו- 2 מ מ EDTA), ואז לספור את התא.
  2. תיוג מגנטי
    הערה: למיין את rbSF-MSCs עם תא מגנטי מופעל מיון קיט המכיל עמודות, דוכן, מפרידים (ראה טבלה של חומרים).
    1. לקבוע את מספר התא באמצעות של hemocytometer.
    2. Centrifuge התליה תא ב 300 גרם × 10 דקות ב 4 º C. לגמרי מחוק לגמרי את תגובת שיקוע.
    3. הוסף µL 80 resuspension מאגר לכל 10 תאים סה כ7 .
    4. עבור 107 הכולל תאים, להוסיף 20 µL של גרגרי מצומדת עם נוגדן CD90 monoclonal אנטי-ארנב.
    5. לערבב את beads מגנטי תאים בשכבה אחידה הצינורות ולאחר מכן דגירה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך.
    6. להוסיף 1 מ"ל של מאגר לכל 107 תאים הצינור ולאחר מכן centrifuge זה ב 300 גרם × 10 דקות ב 4 ° C כדי לשטוף את התאים. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה.
    7. Resuspend בגדר ב 500 µL מאגר לכל 107 תאים.
  3. הפרדה מגנטית
    1. מקם את העמודה המכילה הכנפיים עמודה לחזית לתוך השדה המגנטי למפריד מגנטי.
    2. יש לשטוף את העמודה מפריד מגנטי (MS) עם 500 µL מאגר לכל 107 תאים.
    3. העברת התליה תא בודד לתוך העמודה. תן התאים שלילי לעבור דרך השדה המגנטי כדי למחוק את התאים האלה ללא תווית.
    4. לשטוף את עמודת x 1-2 עם µL 500 מאגר לכל 107 תאים וזורקים את הזרימה דרך.
    5. להעביר את העמודה לתוך שפופרת צנטרפוגה (15 מ"ל).
    6. להוסיף 1 מ"ל של המאגר לכל 107 תאים בעמודה, ולאחר מכן לדחוף מיד על הבוכנה לתוך העמודה כדי. להוריד את התאים שכותרתו מגנטית.
    7. חזור על הפעולות הנ עם עמודה MS השני כדי להגדיל את הטוהר של CD90+ תאים, אשר יכולים להעשיר את השבר eluted.
    8. Centrifuge התליה תא ב 300 גרם × 10 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend זה עם המדיום תרבות.
  4. תרבות של CD90+ rbSF-MSCs
    1. לחסן את התאים במנות 100 מ מ לאחר המיון תא מגנטי הופעל.
    2. דגירה כל המנות של 37 מעלות צלזיוס חממה תא humidified עם 5% CO2.
    3. כאשר הנהרות 80-90% של התרבות העיקרי מושגת, על 7-10 ימים, לעכל את תאים חסיד עם 0.25% טריפסין-EDTA ומעבר אותם לדילול 1:2 לבצע מעבר 2 (P2).
    4. להשתמש באותה השיטה כדי להעביר את התאים כדי מעבר 3 (P3), אשר יכול לשמש את מבחני במבחנה .
      הערה: לאחר תת התרבות ועל טיהור, בערך 1 x 107 rbSF-MSCs מתקבלים.

3. זיהוי של rbSF-MSCs

  1. סמן משטח אישור rbSF-MSCs מאת cytometry זרימה
    1. כאשר MSCs 80-90% confluent-P3, לשטוף את התאים עם PBS ולטפל בהם עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA. לאחר מכן, דגירה של MSCs ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות עד התאים הם צמודי קרקע.
    2. לקצור את התאים באמצעות 10 מ"ל ל- PBS, להעביר אותם לתוך צינור חרוטי (15 מ ל), centrifuge אותם ב g × 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. למחוק את supernatants. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL ל- PBS והעבר אותו לתוך צינור 1.5 מ.
    4. דגירה לדילול מטריים FITC מצומדת ו PE מצומדת נוגדנים (isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) עבור h 1 בחושך ב 4 º C.
    5. Centrifuge תערובת זו ב g × 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS על ידי צנטריפוגה ב g × 300 במשך 5 דקות בכל פעם. למחוק את supernatants.
    6. Resuspend תאי µL 500 ל- PBS, העברת התליה תא לתוך צינור עגול-התחתון (5 מ"ל) ולנתח אותו באמצעות cytometer של זרימה.
      הערה: לרכוש נתונים cytometer מצויד בשני ערוצים זריחה: 533/30 ו- 585/40. עבור כל זריחה isotype, להשתמש בפקד isotype כדי להתאים את המתח לייזר המתאימים, להגדיר את עוצמת המינימלי הדרוש כדי לקבל היסטוגרמה פלורסצנטיות המציג הן השמאליים והימניים של הפסגה. לאסוף למינימום של 10,000 לאירועים ניתוחים סטטיסטיים.
  2. Multidifferentiation של rbSF-MSCs
    הערה: שימוש P3 rbSF-MSCs עבור במבחנה מבחני multidifferentiation.
    1. בידול osteogenic
      1. להכין המדיום אינדוקציה osteogenic: DMEM basic (1 x) המכיל 50 מ מ של אסקורבית L חומצה-2-פוספט, 10 מ מ של α-glycerophosphate ו- 100 ננומטר של דקסאמתאזון.
      2. זרע תאי-10 תאים/ס מ3 2 בצלחת תרביות רקמה 6-ובכן, תרבות אותם במדיום אינדוקציה osteogenic.
      3. לשנות את המדיום אינדוקציה כל 3 ימים למשך 3 שבועות.
      4. לתקן את התאים עם 4% פורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר השלמת את הבידול, מכתים את התאים עם 1% רד Alizarin במשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם 3 x עם PBS15.
    2. בידול Adipogenic
      1. להכין המדיום אינדוקציה adipogenic: DMEM basic (1 x) בהיקף של 100 מ מ של indomethacin 10 מ"ג/מ"ל של אינסולין רקומביננטי אנושי, 1 מ מ דקסאמתאזון, 0.5 מ מ 3-איזובוטיל-1-methylxanthine.
      2. פנקו את rbSF P3-MSCs למשך 3 שבועות במדיום אינדוקציה adipogenic.
      3. לאחר 3 שבועות, כתם של וקואלות השומנים נייטרלי באמצעות שמן אדום O כדי לאשר את הבידול adipogenic. לתקן את התאים בפתרון פורמלדהיד 4% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף אותם 3 x עם PBS16.
    3. בידול Chondrogenic
      1. להכין המדיום אינדוקציה chondrogenic: DMEM basic (1 x) בהיקף של 10 ננוגרם למ"ל של TGFβ1, 1% תוספת שלה, 0.35 מ מ L-פרולין, 100 ננומטר של דקסאמתאזון, 50 מ מ של אסקורבית L חומצה-2-פוספט, ו- 1 מ מ של נתרן פירובט.
      2. השתמש צניפה culturing עבור אינדוקציה chondrogenic. צנטריפוגה 5 × 105 P3 rbSF-MSCs ב 1500 סל ד 10 דקות צינור פוליפרופילן (15 מ ל) כדי ליצור גלולה.
      3. תרבות כדורי למשך 3 שבועות עם המדיום אינדוקציה chondrogenic.
      4. לשנות את המדיום כל 3 ימים למשך 3 שבועות.
      5. לאחר 3 שבועות אינדוקציה, להטביע בגדר תא עם פרפין, סעיף זה פרוסות 4 מ מ, כתם אותם באמצעות 0.1% טולדין כחול למשך 30 דקות-בטמפרטורת החדר17.
  3. סה כ החילוץ-RNA וניתוח מאת כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית)
    1. לנתק הרנ א הכולל של התאים לאחר אינדוקציה 3 שבועות בידול באמצעות החילוץ RNA מסחרי קיט (ראה טבלה של חומרים).
      1. להסיר את המדיום תרבות בצלחת תרבות ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט בידוד.
      2. Lyse בתאים על-ידי pipetting חוזרות ונשנות עד שהתמיסה אחידה. דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
      3. להעביר את התא lysate לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
      4. להוסיף 100 µL של כלורופורם, לנער את זה על ידי יד 15 x, דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
      5. Centrifuge את הצינור ב g × 12,000 למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר את supernatants לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge.
      6. להוסיף 500 µL של אלכוהול איזופרופיל, לזרז את הרנ א 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. צנטריפוגה ב 12,000 × g עבור 10 minat 4 ° C. בגדר RNA צריך להיות גלוי בחלק התחתון של הצינור.
      8. הסר את תגובת שיקוע ולאחר מכן להוסיף 500 µL של 75% אתנול. בקצרה לסובב את הצינור למשך מספר שניות לשטוף את בגדר RNA. Centrifuge זה ב 7,500 g × במשך 5 דקות ב 4 º C.
      9. הסר האתנול שיורית.
      10. להמיס בגדר RNA ב 10 µL DEPC מים ומניחים הצינורות על קרח.
    2. הפוך לתמלל RNA הכולל לתוך cDNA לסינתזת DNA קיט (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: ביצוע כל ההליכים הבאים על קרח.
      1. מכינים את תערובת הבסיס של שעתוק במהופך.
      2. להוסיף 25 µL של RNA שטופלו DNase כל שפופרת עם µg 1 של RNA.
      3. דגירה התערובת בטמפרטורות הבאות באמצעות הצנטרפוגה תרמי של ה-PCR: 26 ° C 10 דקות (כדי לאפשר את hexamers אקראי anneal), 42 º C למשך 45 דקות (שעתוק במהופך) ו- 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (להשבית את רוורס טרנסקריפטאז).
      4. מיד לנתח את cDNA שנוצר על ידי ה-PCR כמותי בזמן אמת, או לאחסן אותו ב-20 ° C.
    3. לבצע את ניתוח ביטוי גנטי עם מערכת ה-PCR כמותי בזמן אמת.
      1. השתמש מיקס מאסטר לרביעיית-PCR (ראה טבלה של חומרים) כדי לבצע PCR. צבעי יסוד PCR GAPDH, Runx2, קנאה, PPARγ מפורטות בטבלה 1.
      2. לחשב ביטוי גנים בשיטתΔΔCT 2−.
      3. לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית סטנדרטי. להשתמש במבחן t מדגם עצמאית כדי להשוות את האמצעים קבוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד, טיהור והתרבות של rbSF-MSCs:
פרוטוקול זה משתמש מקינטוש לבודד rbSF-MSCs, מבוסס על הביטוי של סמן משטח MSC CD90. תזרים תהליך של rbSF-MSCs בידוד, טיהור, אפיון ואת פרוטוקול תרבות במבחנה מוצג באיור1.

מורפולוגיה תאים לאחר מגנטי תא מופעל מיון (מקינטוש) עם CD90:
ראשית, עבור MACS, immunolabel MSCs עם חרוזים מגנטי CD90. לאחר צנטריפוגה, resuspend לכל היותר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

קיומו של MSCs בנוזל synovial מספק אלטרנטיבה לטיפול מבוססת-תא. מחקרים קודמים הראו כי פגיעה האתרים מכילים כמויות גבוהות של גזע mesenchymal בנוזל synovial שלהם, אשר עשוי להיות בקורלציה עם התקופה לאחר פציעה5. MSCs בנוזל synovial עשוי להיות מועיל לרקמות לשיפור ריפוי ספונטני לאחר18,פגיעה19. לעתים נדירות כבר מכוסה היישום הקליני של SF-MSCs בספרות, בעיקר בגלל המנגנון של SF-MSCs במפרקים נשאר לא מוגדר20. ג'ונס ואח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך על ידי המענקים הבאים: יסודות מדעי הטבע של סין (מס 81572198; מס ' 81772394); הקרן לבנייה מלימודי הרפואה ברמה גבוהה של שנז'ן יוניברסיטי (מספר 2016031638); קרן המחקר הרפואי של בפרובינצית גואנג-דונג, סין (מס ' A2016314); שנג'ן המדע ואת הטכנולוגיה פרויקטים (מס ' JCYJ20170306092215436; לא. JCYJ20170412150609690; לא. JCYJ20170413161800287; לא. SGLH20161209105517753; לא. JCYJ20160301111338144).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
MesenGroStemRDMGro-500 1703חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
תוסף MesenGroStemRDMGro-500 M1512רכיב של מדיום תרבית MSCs
DMEM בסיסיGibco Inc.C11995500BTמדיום בידול MSCs
תמיסת מלח איזוטוניתליטאי, סין5217080305מגיב הליך ארתרוצנטזיס בחלל
מי מלח פוספט חוצץ (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, ללא Ca2+/Mg2+
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco Inc.10099-141רכיב של תרבית MSCs בינונית
תמיסת יוד Povidoneגואנגדונג, סין150605חומר עיקור
75% אתנולLircon, סין170917חומר עיקור
0.25% Trypsin/EDTAGibco Inc.25200-056מגיב דיסוציאציה של תאים
1% פניצילין-סטרפטומיציןGibco Inc.15140-122רכיב של MSCs בינוני
MACS מאגר רץMiltenyiBiotec5160112089המכיל תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA), ו-2
נוגדן mMEDTA CD90 מצומד מיקרו-חרוזיםMiltenyiBiotec5160801456למיון תאים פעילים מגנטיים
נתרן פירובטסיגמא-אולדריץ'P2256רכיב של MSCs כונדרוגני התמיינות
דקסמתזוןסיגמא-אולדריץ'D1756מרכיב של MSCs התמיינות אוסטאוגנית
ITSBD3543521%, מרכיב של MSCs התמיינות כונדרוגנית
L-פרוליןסיגמא-אולדריץ'P56070.35 מ"מ, מרכיב של MSCs התמיינות כונדרוגנית
L-חומצה אסקורבית-2-פוספטסיגמא-אולדריץ'A896050 מ"מ, מרכיב של MSCs התמיינות כונדרוגנית
3-איזובוטיל-1-מתילקסנטיןסיגמא-אולדריץ'I58790.5 מ"מ, מרכיב של התמיינות אדיפוגנית
אינדומתציןסיגמא-אולדריץ'I7378100 מ"מ, מרכיב של התמיינות אדיפוגנית
TGF ובטא; 1Peprotech100-2110 ננוגרם/מ"ל, רכיב של MSCs התמיינות כונדרוגנית
&אלפא;-גליצרופספטסיגמא-אולדריץ'G6751רכיב של MSCs התמיינות אוסטאוגנית
CD34 נוגדן פוליקלונלי, FITC מצומדBiossbs-0646R-FITCסמן תאי גזע המטופויאטיים
עכבר אנטי-ארנב CD44Bio-RadMCA806GAממברנת Thy-1 גליקופרוטאין (סמן MSCs)
CD45 (נוגדן חד-שבטי)Bio-RadMCA808GAסמן תאי גזע המטופויאטיים
נוגדן CD105GenetexGTX11415סמן MSCs
אלכוהולאיזופרופיל סיגמא-אולדריץ'I9030מזרז מיצוי RNA שלבים אורגניים
טריכלורומתאןוונגה, סין61553תמצית RNA כולל
TrizolInvitrogen15596-018מבודד סה"כ RNA
SYBR תערובת מאסטר ירוקהTakara Bio, יפןRR420Aבדיקת
PCR ערכת סינתזת cDNATakara Bio, יפןRR047Aתעתיק הפוך ל-DNA משלים
אליזרין אדוםסיגמא-אולדריץ'A5533צביעה של תרכובות סידן
טולואידין כחולסיגמא-אולדריץ'89640צביעה של רקמת סחוס
שמן אדום תמיסת OSigma-AldrichO1391Lצביעת ואקואול ליפידים
<חזק>ציוד
מפריד MiniMACSMiltenyiBiotec130-042-102למיון תאים פעילים מגנטיים
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303למיון תאים פעילים מגנטיים
עמודות MSMiltenyiBiotec130-042-201למיון תאים פעילים מגנטיים
מסננת תאיםFALCON Inc.35234040 μ מ ניילון
המוציטומטרISOLAB Inc.075.03.001ספירת תאים
פלקון 100 מ"מ צלחתקורנינג353003צלחת תרבית תאים
צינור מיקרוצנטריפוגהAxygenMCT-150-Cמיצוי RNA
וצינורות צנטריפוגהSigma-Aldrich91050מהירה מעוקרת גמא
Eppendorf5804Rתאי צנטריפוגה
תא פחמן דו חמצני חממהתרמו סיינטיפיק3111תרבית תאים
מכשיר PCR בזמן אמתLife TechQuantStudioאמת תגובת שרשרת פולימראז כמותית
ציטומטר זרימהBD Biosciences342975מנתח תאים
פיפטוראפנדורףO25456F להעביר את גליל השיבוט הנוזלי
סיגמא-אולדריץ'C3983-50EAלבודד ולבחור מושבות תאים בודדות
מזרק היפודרמי סטריליDouble-Dove, סין131010הליך ארתרוצנטזיס
כלוב ארנבZhike, סיןZC-TGDלרסן את הארנב
PCR צנטריפוגה בזמן

מקורות

  1. Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
  2. Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
  3. De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
  4. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  5. McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
  6. Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
  7. Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
  8. Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
  9. Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390(2014).
  10. Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
  11. Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281(2015).
  12. Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
  13. Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
  14. John, T., Lerche, P. Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , Mosby Elsevier. St. Louis, Missouri. (2011).
  15. Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
  16. Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
  17. Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
  18. Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
  19. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
  20. Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
  21. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  22. Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
  23. Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
  24. Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
  25. Gronthos, S., Zannettino, A. C. W. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. , Vol. 449 of Methods in Molecular Biology 45-57 (2008).
  26. Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616(2012).
  27. Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096(2015).
  28. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  29. Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308(2008).
  30. Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
  31. Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD90MSC
מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.