ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

Summary

יוני אשלגן לתרום פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, ריכוז K⁺ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של הסלולר דעתנית. אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K⁺-microelectrodes סלקטיבית. באמצעות אלקטרודות כזה מאפשר מדידת דינמיקה ריכוז K⁺ חשמלית עורר בפרוסות בהיפוקמפוס למבוגרים.

Abstract

יוני אשלגן לתרום באופן משמעותי פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, לכן, ריכוז K⁺ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של התא דעתנית. שינו את ריכוזי משפיע על K⁺ חוץ-תאית את מנוחתו ממברנה פוטנציאליים וסלולריות דעתנית על ידי הסטה של שיוויי משקל בין מדינות סגור פתוח, מוחלש תעלות יונים תלוית מתח העומדים בבסיס פוטנציאל הפעולה חניכה, הולכה. . מכאן, זה חשוב למדוד ישירות את הדינמיקה K⁺ חוץ-תאית של הברית חולות ובריאות. כאן, אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K⁺-microelectrodes סלקטיבית. אנחנו לפרוס אותם לפרוסות מוח בהיפוקמפוס למבוגרים כדי למדוד דינמיקה עורר חשמלית של ריכוז K⁺ . שימוש מושכל אלקטרודות כאלה היא חלק חשוב של ערכת הכלי הדרושים להעריך המנגנונים הסלולר ואת biophysical לשלוט ריכוזים K⁺ חוץ-תאית במערכת העצבים.

Introduction

ריכוז יון אשלגן מוסדרים בחוזקה במוח, תנודות שלהם השפעה חזקה על פוטנציאל ממברנה מנוחתו של כל התאים. לאור בתרומותיה קריטי, מטרה חשובה של ביולוגיה היא לקבוע את המנגנונים הסלולר ואת biophysical המשמשים בחוזקה לווסת את הריכוז של K⁺ בחלל חוץ-תאית באיברים שונים של גוף^{1 , 2}. דרישה חשובה במחקרים אלה הוא היכולת למדוד ריכוזים K⁺ במדויק. למרות רכיבים רבים אשר תורמים אשלגן הומאוסטזיס במוח במצבים בריאים וחולים היה להיות מזוהה^3,4,5, עוד התקדמות האיטה בשל אופי מיוחדות הכנת יון סלקטיבי microelectrodes למדידה אשלג....

Protocol

כל הניסויים נערכו על פי המכון הלאומי של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי ועדת המחקר של בעל חיים של הקנצלר ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס. כל העכברים שוכנו עם מים ואוכל זמינים ad libitum בסביבה בהירה-כהה 12 שעות. כל בעלי החיים היו בריאים ללא שינויים התנהגותיים ברור, לא היו מעורבים במחקרים קודמים, הוקרבו במהלך מחזור אור. נאספו נתונים לניסויים של עכברים בוגרים (בן לניסויים כל 6-8 שבועות).

1. הכנת microelectrodes סלקטיבית K⁺

1. Silanization של זכוכית בורוסיליקט
   1. הסרת נימים זכוכית מספקת האריזה ומניחים לתוך צינור חרוטי 50 מ. למלא צינור חרוטי העליון 1 מ' אלקטרודות HCl. לשטוף עם עצבנ....

Results

למדידה סלקטיבי של K חוץ-תאית⁺, הכנו microelectrodes סלקטיבית יון מצופה בשכבה הידרופובי דרך silanization של פיפטות זכוכית בורוסיליקט נקי (איור 1 א'). ציפוי זה מאפשר את ionophore K⁺ המכיל valinomycin לנוח בקצה האלקטרודה ולא להתיר רק K⁺ שטף דרך פתח צר בקצה אלקטרודה (איור 1B). לאחר הטרמה האלקטרודות עם תמיסת מלח עצמם נסתמו, את ionophore K⁺ , האלקטרודות ניתן לבחון את תגובתם המהירה וארוך stepw.......

Discussion

השיטה שבה נתאר כאן אפשרה לנו להעריך K⁺ dynamics בתגובה גירוי חשמלי של שפר בהתקפה חריפה פרוסות בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים. אופן הכנת K⁺ יון סלקטיבי microelectrodes דומה מוקדם יותר המתואר הליכים^12,13,14,15. אולם, שיטה זו יש יתרונות על פני תצורות אלקטרודה חלופי כי הוא מהיר ולא מסובך להכין K⁺ microelectrodes סלקטיבית. לאחר כיול המתאים, האלקטרודות נמצאו למדוד robust.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer אפס 1
עכבר: C57BL / 6NTac עכברים מולדים	מלאי Taconic	# B6
מיקרוסקופ	אולימפוס	BX51
חולץ אלקטרודות	סאטר	P-97
Ag / AgCl גלולה קרקעית	WPI	EP2
pCLAMP10.3	התקנים מולקולריים	n/a
מותאם אישית microfil 28G tip	מכשירי דיוק עולמיים	CMF28G
טונגסטן רוד	A-M מערכות	716000
אלקטרודות מגרות דו קוטביות	FHC	MX21XEW(T01)
מבודד גירוי	מכשירי דיוק עולמיים	A365
דשא S88 ממריץ	דשא מכשירים	S88
פיפטות זכוכית בורוסיליקט	מכשירים דיוק עולמיים	1B150-4
A ל-D לוח	Digidata 1322A	Axon Instruments
מגבר אותות	Multiclamp 700A או 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch Computer	Dell	n/A
נתרן כלוריד	סיגמא	S5886
אשלגן כלורי	סיגמא	P3911
HEPES	סיגמא	H3375
נתרן ביקרבונט	סיגמא	S5761
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא	S0751
D-גלוקוז	סיגמא	G7528
סידן כלורי	סיגמא	21108
מגנזיום כלוריד	סיגמא	M8266
ולינומיצין	סיגמא	V0627-10 מ"ג
1,2-דימתיל-3-ניטרובנזן	סיגמא	40870-25 מ"ל
אשלגן טטראקיס (4-כלורופניל) בוראט	סיגמא	60591-100 מ"ג
5% דימתילדיכלורוסילן בהפטן	סיגמא	85126-5 מ"ל
TTX	קיימן חברת כימיקלים	14964
חומצה הידרוכלורית	סיגמא	H1758-500 מ"ל
סוכרוז	סיגמא	S9378-5 ק"ג
מיקרומניפולטור פיפטה	סאטר	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
עדשת אובייקטיבית		Olympus PlanAPO 10xW