ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

סיכום

יוני אשלגן לתרום פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, ריכוז K⁺ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של הסלולר דעתנית. אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K⁺-microelectrodes סלקטיבית. באמצעות אלקטרודות כזה מאפשר מדידת דינמיקה ריכוז K⁺ חשמלית עורר בפרוסות בהיפוקמפוס למבוגרים.

תקציר

יוני אשלגן לתרום באופן משמעותי פוטנציאל ממברנה מנוחתו של תאים, לכן, ריכוז K⁺ חוץ-תאי הוא מווסת מכריע של התא דעתנית. שינו את ריכוזי משפיע על K⁺ חוץ-תאית את מנוחתו ממברנה פוטנציאליים וסלולריות דעתנית על ידי הסטה של שיוויי משקל בין מדינות סגור פתוח, מוחלש תעלות יונים תלוית מתח העומדים בבסיס פוטנציאל הפעולה חניכה, הולכה. . מכאן, זה חשוב למדוד ישירות את הדינמיקה K⁺ חוץ-תאית של הברית חולות ובריאות. כאן, אנו נתאר כיצד להפוך, לכייל ולהשתמש monopolar K⁺-microelectrodes סלקטיבית. אנחנו לפרוס אותם לפרוסות מוח בהיפוקמפוס למבוגרים כדי למדוד דינמיקה עורר חשמלית של ריכוז K⁺ . שימוש מושכל אלקטרודות כאלה היא חלק חשוב של ערכת הכלי הדרושים להעריך המנגנונים הסלולר ואת biophysical לשלוט ריכוזים K⁺ חוץ-תאית במערכת העצבים.

מבוא

ריכוז יון אשלגן מוסדרים בחוזקה במוח, תנודות שלהם השפעה חזקה על פוטנציאל ממברנה מנוחתו של כל התאים. לאור בתרומותיה קריטי, מטרה חשובה של ביולוגיה היא לקבוע את המנגנונים הסלולר ואת biophysical המשמשים בחוזקה לווסת את הריכוז של K⁺ בחלל חוץ-תאית באיברים שונים של גוף^{1 , 2}. דרישה חשובה במחקרים אלה הוא היכולת למדוד ריכוזים K⁺ במדויק. למרות רכיבים רבים אשר תורמים אשלגן הומאוסטזיס במוח במצבים בריאים וחולים היה להיות מזוהה^3,4,5, עוד התקדמות האיטה בשל אופי מיוחדות הכנת יון סלקטיבי microelectrodes למדידה אשלגן. חיישנים microelectrode מייצגים את תקן זהב למדידת K⁺ ריכוזים במבחנה, פרוסות רקמות ו vivo בתוך.

גישות חדשות יותר עבור K⁺ ניטור נמצאים בפיתוח באמצעות חיישנים אופטיים, אולם אלה לא זיהית ריכוזים של טווח רלוונטי מבחינה ביולוגית של K⁺ או לא נבדקו במערכות ביולוגיות, למרות תוצאות ראשוניות מופיעים^6,מבטיח^7,8. בהשוואה לחיישנים אופטיים, microelectrodes מוגבלות באופן מהותי מדידה נקודת המקור של יונים, למרות אלקטרודה מערכים יכול לשפר את הרזולוציה המרחבית⁹. מאמר זה מתמקד החיישנים microelectrode חד-קני לניטור K⁺ dynamics.

בעבודה זו, אנחנו מדווחים הליכים מפורטים stepwise כדי להפוך K⁺ microelectrodes סלקטיבית, באמצעות ionophore של אשלגן מבוססי valinomycin המתיר סלקטיבי מאוד (10⁴ קיפול K⁺ ל נה⁺ סלקטיביות) K⁺ תנועת הקרומים¹⁰. מפוליפפטיד המתרחשים באופן טבעי, valinomycin פועל כמו נקבובית חדיר K⁺ ואסטמה ומקילה על הזרימה של K⁺ למטה. זה הדרגתי אלקטרוכימי. אנחנו גם מתארים כיצד לכייל את האלקטרודות, כיצד לאחסן ולהשתמש בהם, ולבסוף כיצד לפרוס אותם כדי למדוד דינמיקה ריכוז K⁺ מוח בהיפוקמפוס חריפה פרוסות של עכברים בוגרים. שימוש כזה אלקטרודות יחד עם עכברים מהונדסים שאין תעלות יונים וברצפטורים ספציפיים מוצע להסדיר את הדינמיקה K⁺ חוץ-תאית לחשוף את המנגנונים התאיים המשמשים את מערכת העצבים כדי לשלוט של החוק, K ⁺ ב חצרו חוץ-תאית.

פרוטוקול

כל הניסויים נערכו על פי המכון הלאומי של בריאות המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ואושרו על-ידי ועדת המחקר של בעל חיים של הקנצלר ב אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס. כל העכברים שוכנו עם מים ואוכל זמינים ad libitum בסביבה בהירה-כהה 12 שעות. כל בעלי החיים היו בריאים ללא שינויים התנהגותיים ברור, לא היו מעורבים במחקרים קודמים, הוקרבו במהלך מחזור אור. נאספו נתונים לניסויים של עכברים בוגרים (בן לניסויים כל 6-8 שבועות).

1. הכנת microelectrodes סלקטיבית K⁺

1. Silanization של זכוכית בורוסיליקט
   1. הסרת נימים זכוכית מספקת האריזה ומניחים לתוך צינור חרוטי 50 מ. למלא צינור חרוטי העליון 1 מ' אלקטרודות HCl. לשטוף עם עצבנות עדין ב- HCl בן לילה או לקבוצות של 6 שעות.
   2. בקצרה לשטוף נימים עם 70% אתנול, ואז יבש לחלוטין ב 100-120 מעלות צלזיוס במשך 6-8 שעות. לאחסן נימים שטף מכולות עם נטול מים סידן גופרתי סופג לחות עד 4 שבועות לפני להמשך השימוש.
   3. לפני silanization, הצמד נימים טיפ בסדר באמצעות של פולר microelectrode. Microelectrodes בהם אנו משתמשים הם כ- 2-5 מיקרון קוטר. תמיד להתמודד עם שטף נימים עם כפפות, כמו שמנים של העור יכולים להפריע silanization.
   4. המקום microelectrodes לתוך מיכל זכוכית כך האלקטרודות גבוהות מהתחתית כדי למנוע שבירה עצה. לתקן את microelectrodes אל המיכל באמצעות קלטת autoclavable או סרט דביק דומה.
   5. הסר כ- 0.5 מ"ל של פתרון silanization 5% dichlorodimethylsilane (DDS) המכיל שלו באמצעות שיטת החלפת חנקן (ראה איור 2). למלא בלון גז חנקן, לצרף הבלון מזרק או שפופרת ואת המחט. הכנס את המחט לתוך המיכל DDS תוך כדי ציור למעלה DDS לתוך מזרק נפרד באמצעות מחט ארוך יותר.
   6. החלת הפתרון silanization dropwise עד קצות מדי סוכר ומכסים מיד. הכנס את המיכל אל מחזיק את microelectrodes עם silanization פתרון לתוך תנור מראש ומחוממת מעבדה (170-180 מעלות צלזיוס) למשך 10-12 שעות או ב- 200-220 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות
   7. לאחר הדגירה, לכבות את התנור, לאחר מכן הסר את הלוחית של התנור. היה זהיר בעת הסרת את הצלחת החממה, שזה מאוד חם. מניחים את הצלחת על ספסל בטמפרטורת החדר במשך 10-15 דקות לאפשר את כלי הזכוכית להתקרר.
   8. להסיר את microelectrodes הצלחת (באמצעות גילוח או להב סכין לחתוך את הקלטת) למקם אותם לתוך מיכל אטום מילוי סופג לחות. Microelectrodes Silanized כל הזמן ללא של לחות יכול לשמש עבור עד שבוע 1 בעקבות silanization.
2. הטרמה האלקטרודות
   1. להכין פתרון מניות של K⁺ ionophore קוקטייל: 5% w/v valinomycin, 93% v/v 1, 2-דימתיל-3-nitrobenzene, 2% w/v אשלגן tetrakis(4-chlorophenyl) בוראט¹¹. פתרון זה הוא חלש צבע צהוב. לשמור בכלי אטום, אטום לאוויר בטמפרטורת החדר. אם נשמרת כראוי פתרון זה יכול להימשך חודשים רבים.
   2. להכין פתרון מניות של 10 מ מ HEPES buffered 300 מ"מ NaCl ב- pH 7.4. לתקן את האלקטרודה לתוך מלחציים מילוי עם NaCl במאגר באמצעות טיפ microfil 28 גרם מחובר מזרק. שים לב כי תמיסת מלח הגיע לסוף של קצה microelectrode. לאשר microelectrode חינם של בועות גדולות שעלולה להפריע זרימת הזרם.
   3. לשבור את קצה האלקטרודה רחב, באמצעות הצד הקהה של אזמל או גילוח כ 10-20 מיקרומטר.
   4. שימוש של micropipette, להחיל droplet קטן (~0.1 µl) של ionophore K⁺ סמוך לקצה microelectrode. אם האלקטרודה כבר כראוי silanized שה-droplet ייקלטו הקצה השבור. מילוי האלקטרודה 1-2 מ"מ עם K⁺ ionophore, ולהסיר עודפי באמצעות ממחטת נייר.

2. כיול של K⁺ Microelectrodes סלקטיבית

1. אופן ההכנה של פתרונות כיול
   1. להכין פתרונות של ריכוזים שונים של אשלגן בנוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) שווה osmolarity על-ידי החלפת אשלגן כלורי NaCl. השתמשנו 0.1, 1, 4.5, 10 ו- 100 מ מ K⁺ , חנה המבר לצורך כיול של האלקטרודות. המתכונים האלה פתרונות כיול מפורטים בטבלה 1.

כימית	MW	מ מ הסופי	0.1 מ מ [K +]	1 מ"מ [K +]	4.5 מ מ [K +]	10 מ מ [K +]	100 מ מ [K +]
	(g / mol)
NaCl	58.44	משתנה	1.51 g	1.50 גרם	1.44 g	1.4 גרם	0.345 g
אשלגן כלורי	1 מ' מניות	משתנה	20 µl	200 µl	900 µl	2 מ	20 מ
CaCl2	1 מ' מניות	2	400 µl
MgCl2	1 מ' מניות	1	200 µl
2PO NaH4	119.98	1.2	0.29 g
NaHCO3	84.01	26	0.437 g
D-גלוקוז	180.16	10	0.360 g
מים	q.s. 200 מ ל

טבלה 1. אשלגן כיול פתרונות

2. כיול microelectrode
   1. בועה כל הפתרונות ב- 95% או₂/5% CO₂ לפחות 20 דקות לפני תחילת הניסוי. להתחיל פרפוזיה האמבט עם 4.5 מ מ [K⁺] חנה המבר בקצב של 3 מ ל לדקה. למקם את האלקטרודה סלקטיבי K⁺ מחזיק אלקטרודה מחוברת headstage האלקטרודות על manipulator. Headstage הזה מחובר מגבר המתאים. הכנס את קצה האלקטרודה perfusate אמבט.
   2. ודא שהאלקטרודה הקרקע Ag/AgCl והכל טובל הפתרון אותו הזרם יציב. להחיל כיול פתרונות אופנה stepwise ולהקליט את השינויים פוטנציאליים ב mV לאורך קצה האלקטרודה. לחכות הפוטנציאל בקצה האלקטרודה להגיע ערך יציב לפני המעבר הפתרון הבא
   3. למדוד את השינוי מתח מצב יציב בתגובה היישום של הפתרונות כיול אל קצה האלקטרודה. לאשר כי השיפוע של תגובת אלקטרודה היא 52 לפחות לא יותר מ 58 mV לכל יומן בשינוי [K⁺].

3. הכנת פרוסות המוח בהיפוקמפוס חריפה

1. אופן ההכנה של פתרונות פרוסה
   1. הכנת 500 מ"ל סוכרוז חיתוך פתרון מורכב: 194 מ"מ סוכרוז, 30 מ מ NaCl, 4.5 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ D-גלוקוז, 1 מ MgCl₂,₂PO NaH 1.2 מ מ₄, ו 26 מ מ NaHCO₃, 290-300 mOsm, רווי 95% O₂ ו- 5% CO₂.
   2. להכין 1-2 ליטר פתרון הקלטה (כלנית חדד) מורכב: 124 מ"מ NaCl, 4.5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl₂, 10 מ מ D-גלוקוז, מ מ 2 CaCl₂, 1.2 מ מ NaH₂PO₄ו- 26 מ מ NaHCO₃; pH 7.3-7.4 (לאחר מבעבעים), 290-300 mOsm, רווי 95% O₂ ו- 5% CO₂. מילוי גביע המכיל חדר בעל המוח פרוסה עם הקלטה פתרון ולשמור אותו ב- 32-34 מעלות צלזיוס. למלא את התא vibratome הרפש קרח-מים.
2. הכנה חריפה פרוסה
   1. עמוק עזים ומתנגד עכבר על-ידי הצבתו בתוך צנצנת precharged עם 2-3 מ ל איזופלוריין. בדוק אם רפלקס קמצוץ הבוהן, אם לא מגיב, במהירות לערוף אותו בעזרת זוג מספריים חדים או גיליוטינה כמו פרוטוקול החיות שלך דורש.
   2. עושים חתך 2-3 ס מ באמצעות המזמרה מחלק סימטרית של הגולגולת לחתוך את הקרקפת לאורך הקו האמצעי. בזמן באופן ידני בכדי לבטל את הקרקפת, לעשות שני 1 ס מ אופקי חתכים של המאגנום נקב לאורך הצד של הגולגולת. אז, בעזרת מזמרה בסדר, חותכים חתך האורך של הגולגולת, לאורך הקו האמצעי מהחלק האחורי של הגולגולת האף.
   3. באמצעות מלקחיים בסדר מוכנס ליד הקו האמצעי, תמשוך את הגולגולת חרות בשני חלקים. לחלץ את מוח העכבר הגולגולת ולהשתמש להב להסיר את המוח ואת הריח נורות, אשר ממוקמים בהתאמה החלקים סימטרית, rostral של המוח. אלה יכול להיות מזוהה על ידי סדקים גדולים, אשר מפרידים בינם לבין קליפת המוח.
   4. הר הרחוב המוח על מגש vibratome באמצעות דבק סופר. למלא את המגש vibratome פתרון חיתוך קר כקרח.
   5. חותכים מקטעי רקמת במטוס הילתית ב 300 עובי מיקרומטר. בדרך כלל ניתן לאסוף 6 פרוסות בהיפוקמפוס הילתית.
   6. לאחר כל מקטע הוא נחתך, מיד להעביר את הפרוסות הפרוסה מחזיק גביע התחמם עד 32-34 מעלות צלזיוס. להשאיר הסעיפים בטמפרטורה זו כעשרים דקות לפני הסרת כשהספל המכיל את המקטעים ולמקם זה בטמפרטורת החדר במשך 20-30 דקות לפחות לפני ההקלטה.

4. מדידת דינמיקה חשמלית עורר K⁺

1. הגדרת ההכנה פרוסה
   1. הנח בעדינות את הפרוסה המוח באמבטיה באמצעות פיפטה של פסטר, בעדינות שיצמיד אותו למקום עם נבל פלטינה עם ניילון מחרוזות.
   2. ודא הטיפים של האלקטרודה גירוי דו קוטבית מקבילים אחד לשני, נמצאים בגובה המטוס הפרוסה. . לאט, במשך 6-7 שניות, הכנס האלקטרודות CA3 הרובד radiatum כ- 40-50 מיקרומטר עמוק כדי לעורר שפר בהתקפה. בסעיפים הילתית, CA3 יכול להיות כ מזוהה כמו החלק של ההיפוקמפוס לרוחב מתאים לשכבת תא גרגר-מסכות בהיפוקמפוס, עם radiatum הרובד נופל המדיאלי, הגחון בשכבת תאים כפירמידה.
   3. להוסיף בזהירות את K⁺-סלקטיבית אלקטרודה לתוך CA1 שכבה radiatum כ 50 מיקרומטר עמוק, על-ידי הנמכת לאט האלקטרודה מעל כ- 3-4 שניות. לאפשר בעל פוטנציאל לייצב על פני האלקטרודה לפני החלת stimulations כדי הפרוסה: זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות. אם הפרוסה תערוכות ספונטנית שינויים חוץ-תאי K⁺ לאחר מכן למחוק, חזור על תהליך זה עם פרוסה חדשה.
2. מדד עורר שחרור K⁺
   1. להחיל רכבות של גירוי חשמלי (8 פולסים) על ידי באופן ידני מדכא על ההדק על ממריץ תוך כדי הקלטה דיגיטלית תגובות. החל גירוי ב-10 הרץ ו 1 רוחב פולס ms, החל מ- 10 משרעת הגירוי µA.
   2. החל amplitudes גירוי גדל והולך לפי פקטור של 2 עד משרעת התגובה המרבית K⁺ מזוהה. אם אינך רואה תגובה כלשהי, העבר את המיקום של האלקטרודה K⁺ קרוב יותר לאתר גירוי 100 מיקרומטר בהפרשים
   3. לקבוע את משרעת גירוי שמייצר את התגובה מקסימלי חצי. מניסיוננו, זה בין 40-160 µA, כתלות באיכות ההכנה, הגיל של בעלי חיים, לבין המרחק בין גירוי אלקטרודות אלקטרודה סלקטיבי K⁺ .
   4. הפרוסה אותה, באמצעות משרעת של הגירוי בשלב אחד נמוך יותר מאשר משרעת שמייצר את התגובה מקסימלי חצי (למשל אם 80 µA מייצרת לתגובה חצי-מקסימלי, להשתמש 40 µA) החל גירוי רכבות של הגדלת מספר פולסים. בתחילה, השתמשנו רכבות של פולסים 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128.
   5. כדי לוודא כי K⁺ אותות הם מתווכת על-ידי ירי פוטנציאל הפעולה של האמבטיה בהתקפה שפר חשמלית מגורה, החל 0.5 מיקרומטר TTX בחנה המבר במשך 10 דקות וחזור על פרוטוקול גירוי. אין עורר תגובות להתייחס.
   6. לאחר שסיים את הניסוי פרוסה, לאשר האלקטרודה הקפיד שלה responsivity על ידי כיול מחדש האלקטרודה בפתרונות כיול ו הבטחת התגובה סטה לא יותר מ 10% מ כיול הראשונית

תוצאות

למדידה סלקטיבי של K חוץ-תאית⁺, הכנו microelectrodes סלקטיבית יון מצופה בשכבה הידרופובי דרך silanization של פיפטות זכוכית בורוסיליקט נקי (איור 1 א'). ציפוי זה מאפשר את ionophore K⁺ המכיל valinomycin לנוח בקצה האלקטרודה ולא להתיר רק K⁺ שטף דרך פתח צר בקצה אלקטרודה (איור 1B). לאחר הטרמה האלקטרודות עם תמיסת מלח עצמם נסתמו, את ionophore K⁺ , האלקטרודות ניתן לבחון את תגובתם המהירה וארוך stepw...

דיון

השיטה שבה נתאר כאן אפשרה לנו להעריך K⁺ dynamics בתגובה גירוי חשמלי של שפר בהתקפה חריפה פרוסות בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים. אופן הכנת K⁺ יון סלקטיבי microelectrodes דומה מוקדם יותר המתואר הליכים^12,13,14,15. אולם, שיטה זו יש יתרונות על פני תצורות אלקטרודה חלופי כי הוא מהיר ולא מסובך להכין K⁺ microelectrodes סלקטיבית. לאחר כיול המתאים, האלקטרודות נמצאו למדוד robust...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Vibratome	DSK	Microslicer אפס 1
עכבר: C57BL / 6NTac עכברים מולדים	מלאי Taconic	# B6
מיקרוסקופ	אולימפוס	BX51
חולץ אלקטרודות	סאטר	P-97
Ag / AgCl גלולה קרקעית	WPI	EP2
pCLAMP10.3	התקנים מולקולריים	n/a
מותאם אישית microfil 28G tip	מכשירי דיוק עולמיים	CMF28G
טונגסטן רוד	A-M מערכות	716000
אלקטרודות מגרות דו קוטביות	FHC	MX21XEW(T01)
מבודד גירוי	מכשירי דיוק עולמיים	A365
דשא S88 ממריץ	דשא מכשירים	S88
פיפטות זכוכית בורוסיליקט	מכשירים דיוק עולמיים	1B150-4
A ל-D לוח	Digidata 1322A	Axon Instruments
מגבר אותות	Multiclamp 700A או 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch Computer	Dell	n/A
נתרן כלוריד	סיגמא	S5886
אשלגן כלורי	סיגמא	P3911
HEPES	סיגמא	H3375
נתרן ביקרבונט	סיגמא	S5761
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא	S0751
D-גלוקוז	סיגמא	G7528
סידן כלורי	סיגמא	21108
מגנזיום כלוריד	סיגמא	M8266
ולינומיצין	סיגמא	V0627-10 מ"ג
1,2-דימתיל-3-ניטרובנזן	סיגמא	40870-25 מ"ל
אשלגן טטראקיס (4-כלורופניל) בוראט	סיגמא	60591-100 מ"ג
5% דימתילדיכלורוסילן בהפטן	סיגמא	85126-5 מ"ל
TTX	קיימן חברת כימיקלים	14964
חומצה הידרוכלורית	סיגמא	H1758-500 מ"ל
סוכרוז	סיגמא	S9378-5 ק"ג
מיקרומניפולטור פיפטה	סאטר	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
עדשת אובייקטיבית		Olympus PlanAPO 10xW

חברה