הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

10.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/57593

⸱

2 במאי 2018

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת זקיקי השחלה בתרבית של עכברים צעירים ללא חלוקתה טורי. שימוש immunofluorescence כל איבר ורקמה ניקוי, חלוקתה הפיזי מוחלף עם חלוקתה אופטי. שיטה זו של הכנת הדוגמא והדמיה שומר על תקינות האיברים ואסטמה ומקילה על כימות אוטומטיות של תאים ספציפיים.

תקציר

המחקר בתחום הביולוגיה הרבייה יונקים כרוך לעתים קרובות הערכת הבריאות הכללית של השחלות, האשכים. באופן ספציפי, אצל נקבות, כושר השחלות הוא לעיתים קרובות לאומדן להמחיש וכימות זקיקים ו- oocytes. מכיוון השחלה רקמות תלת מימדי אטום, הגישות המסורתיות דורשים בעמל רב חותך את הרקמה למקטעים טורי רבות כדי להמחיש תאים לאורך האיבר כולו. יתר על כן, מכיוון כימות בשיטה זו בדרך כלל כרוכה מניה רק ערכת משנה של המקטעים מופרדים על-ידי הקוטר המשוער של oocyte, זה נוטה דיוקים. כאן, פרוטוקול המתואר במקום מנצל כל האיבר רקמות סליקה ו- immunofluorescence מכתים של השחלות העכבר כדי להמחיש זקיקים ו- oocytes. לעומת גישות מסורתיות יותר, פרוטוקול זה יש יתרון להמחשת תאים בתוך השחלה מסיבות רבות: 1) השחלה נשאר שלם במהלך הכנת הדוגמא ועיבוד; 2) שחלות קטן, אשר קשה למקטע, תוכל להיבדק בקלות; 3) כמת סלולריים מושגת בקלות רבה יותר ובאופן מדויק; . ו-4) כל האיבר עם תמונה.

מבוא

ללימוד הרכב הסלולר ואת תכונות מורפולוגיות של השחלות יונקים, מדענים לעיתים קרובות לסמוך על ויוו ניסויים ואחריו immunohistological מכתים פרפין מוטבע השחלות. נוסף לאחרונה אף, השחלה כל איבר תרבות הוכיחה להיות חלופה יעילה ללמוד תפקוד השחלות1,2,3,4 , כי הטכניקה יכולה להיות בשילוב עם כאחראית ו כימות כלים. באופן מסורתי, ניתוח של מורפולוגיה השחלות תלוי בשחזור אדריכלות השחלות תלת מימדי ממקטעים טורי פרפין מוטבע, אבל, בנוסף להיותו מפרך, זמן רב, באופן סדרתי חלוקתה פרפין מוטבע רקמות לא ערובה שחזור נכונה של האיבר, סעיפים לעיתים קרובות אבדו או הורה בזיהוי שגיאות בתהליך.

בנוסף האתגרים הטכניים הקשורים עם חלוקתה טורי, ישנם גם וריאציות של השיטות בשימוש שגרתי לכמת זקיק מספרים לאדם שחלה5,6. ההשתנות מתודולוגי בשימוש כיום פוגע מטא אנליזה של השחלות מילואים לאורך הלימודים5,7. לדוגמה, זקיק מספרים מתוך מאמרי מחקר שונים יכול להשתנות על ידי 10-fold או יותר בין הגילאים התפתחותית דומה בתוך זן ספציפי6. אלה הבדלים גדולים כימות שדווחה זקיק יכול להוביל לבלבול, יש הפריע קרוס-לימוד השוואות. השפעול, גישות מסורתיות זקיק כימות ממקטעים טורי מבוצעות על ידי ספירת זקיקים של מספר סעיפים מוגדרים מראש (למשל, החלטה, העשירי, או מקטע אחר). השתנות בתוך זקיק ספירות באמצעות גישה זו מתעוררת לא רק בשל את תקופתיות ב אילו מקטעים נספרים אלא גם וריאציות עובי סעיף ב, ניסיון טכני ביצירת המקטעים טורי5,6. בנוסף ההשתנות שלו, חיסרון נוסף של רקמה מסורתית חלוקתה היא כי חלוקתה של השחלות קטן מבעלי חיים צעירים הוא מאתגר במיוחד, תלויים במידה רבה רקמות התמצאות8.

פרוטוקול שלהלן מתאר את טכניקת תרבות1 שחלה בשימוש שגרתי אך הוא משפר באופן משמעותי על כימות זקיק מסורתי על ידי החלפת חלוקתה פיזי ברקמות ניקוי ואת חלוקתה אופטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית8 ,9. ניקוי באמצעות רקמות טבילה (ללא צורך זלוף טראנס או אלקטרופורזה) ב שתנן בסורביטול מבוססות פתרון (למשל, ScaleS(0)10) הוכיח תואם immunostaining ואת המותר עבור הפחתת ניקוי זמן מבלי להתפשר על עומק הדמיה. שיטות אחרות (למשל, ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12ו- ClearT212) הם גם יותר זמן רב או אל תאפשר מעמיק רזולוציה אופטית של המדגם. חלוקתה אופטי הוא יתרון, כי זה פחות עמל רב ומתחזק של האיבר ארכיטקטורה תלת מימדי7,8. יתרון נוסף של גישה זו היא הכנת הדגימות לא דורשת ריאגנטים יקר כדי לנקות את הרקמה והוא יכול להתבצע בקלות יחסית.

באופן ספציפי, הפרוטוקול המתואר מוטבה עבור העכבר בתרבית השחלות ביום כמחנכת חמש, אבל התנהל על השחלות החל כמחנכת יום 0 - 10. השיטה עושה שימוש במערכת התרבות שחלה בו הרקמה באופן טבעי מייחסת הקרום שעליו זה הוא תרבותי, הקלת איברים טיפול ומניפולציה. מערכת התרבות תיאר יכול לשמש כדי לשמור על השחלות explanted עד 10 ימים, כדי להעריך כמה תנאים ניסיוני עלולים להפריע oocyte הישרדות13. ההליך כימות המתואר מתבצע באמצעות התמונה מסחרי עיבוד החבילה פיג'י-ImageJ14 , יכול להתבצע על רוב המחשבים האישיים. יתר על כן, התמונות המשמשות על כימות יהיה זמין נרחב עבור הקהילה המדעית, ובכך מאפשר עבור העתיד מטא אנליזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אוניברסיטת קורנל של טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) אישר את כל השיטות המתוארות כאן, תחת פרוטוקול 2004-0038 למטות.

1. הכנת כלי נגינה ומדיה תרבות

  1. לנגב אזור עבודה נקי עם 10% מלבין ולאפשר האקונומיקה להישאר על משטח אזור העבודה לפחות 5 דקות. לאחר 5 דקות, להסיר את עודף אקונומיקה עם מגבות נייר נקי ו-70% אתנול (EtOH). לנקות את המיקרוסקופ ויבתר ביסודיות עם 70% EtOH.
    הערה: חשוב כי אזור העבודה להיות לפחות חצי סטרילי כדי למנוע זיהום של תרבויות איברים.
  2. לעטוף נקי מלקחיים ומספריים במגבת נייר לחה עם 70% EtOH עד למועד השימוש.
    הערה: כלי ניתוח אידיאלי עשוי להשתנות לפי מידת/הגיל של השחלה. התוצאות הטובות ביותר מתקבלים באמצעות אחת חדה מיקרו ויבתר מספריים, עצה בסדר שני מלקחיים (או מספר 5 או 55) ומיקרו אחד לנתח מספריים איריס.
  3. צינור חרוטי, ודא 50 מ של השחלה תרבות המדיה וחמים באמבט מים 37 º C.
    1. כדי להפוך את השחלה תרבות בינוני4, תוספת 1 x תקשורתי חיוני מזערי (מאמ) עם 10% סרום שור עוברית (FBS), 25 מ מ (-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 חומצה (HEPES), 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, 0.25 µg/mL המפוטריצין (למשל, 45 מ ל גברתי, 5 מ של חום להשבית FBS, 1.25 מ של HEPES ו- 0.5 מ ל 100 x מלאי של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B שהוא גוסס).
  4. להכין צלחות מוסיף לפני התרבות השחלה.
    1. בשכונה תרביות רקמה, להוסיף 1 מ"ל של השחלה תרבות בינוני צלחת תרביות רקמה 35 מ מ.
    2. להשרות טרום הכנס רפידה עם המדיום תרבות. הוסף מדיה מספיקה, בדרך כלל בערך 0.55 מ"ל לכל, צלחת תרביות רקמה מנשא טוב 24 והמקום תרבות תא להוסיף בתוך הבאר. ודא ממברנה שתותב נוגע לתקשורת.
    3. הכן את מספר צלחות 35 מ מ ווולס עם תא מוסיף תרבות לפי המספר הצפוי של השחלות לניסוי. מקם את הצלחות 35 מ מ המכיל 1 מ"ל הלוח המוביל 24-ובכן המכיל מוסיף 37 ° C, 5% CO2ו החממה באטמוספירה של2 O ומדיה תרבות ומדיה תרבות.
  5. לארגן צלחת חמה ליד הטווח לנתיחה והגדר את הטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס. שמור של 37 ° C, 5% CO2 והוא החממה באטמוספירה של2 O קרוב לחדר ניתוח.

2. השחלה לנתיחה ותרבות איברים

הערה: השחלות יכול להיות גזור בטמפרטורת החדר כל עוד החשיפה הטמפרטורה לא אידאליות הוא מינימלי.

  1. המתת חסד העכברים נקבה ביום אחרי לידה 5, על-ידי עריפת ראש, אחד בכל פעם.
    הערה: המתת חסד להתבצע בהתאם להנחיות IACUC נוכח המתקן שבו מתבצע המחקר.
  2. לרסס את החיה עם 70% EtOH. מקם את החיה על מגבת נייר יבש מתחת למיקרוסקופ לנתיחה. מניחים צלחת תרביות רקמה 35 מ מ המכיל השחלה מדיה תרבות קרוב המיקרוסקופ לנתיחה.
  3. בעזרת מלקחיים או ניתוח מיקרו איריס מספריים, לעשות חתך דרך העור של החיה, לתוך חלל הבטן, באמצעות התראה לא לחתוך לתוך המעיים. לדחוף את המעיים מתוך חלל הבטן ואתר השחלות. לחלץ את השחלות, למקם אותם לתוך המנה תרביות רקמה 35 מ מ המכיל תרבות המדיה.
  4. ברגע השחלות יש כבר גזור מן החיה, להגדיל את דרגת ההגדלה של מיקרוסקופ לנתיחה כדי להמחיש השחלות ואת כל הרקמה המצורפת. עם לנקות עצה בסדר מלקחיים, להסיר את כל הרקמות ללא השחלות, בורסה ו רקמות שומן. להיות זהירים כדי להשאיר את השחלות ללא שינוי בעת הסרת הרקמה ללא השחלות המצורפת.
  5. לאחר השחלות מבודד, למקם את הזוג הכיסויים התרבות תאים טרום רטוב של צלחת 24-ובכן המוביל (עיין שלבים 1.4.2 ו 1.4.3) ולכוונן את העוצמה של המדיום כדי להבטיח כי זה מספיק לשמור את האיבר לחות (ללא לחלוטין השוקע זה).
    זהירות: היזהרו לא דקרו הממברנה של התא הקדמי תרבות בעת העברת השחלות.
  6. המקום explanted איברים 37 ° C, 5% CO2ו החממה באטמוספירה של2 O.
  7. חזור על שלבים 2.1-2.6 עד השחלות של כל בעל חיים גזור והניח על התרבות התא הכנס של צלחת 24-ובכן המכיל המדיום תרבות השחלה.
  8. שינוי המדיום תרבות השחלה כל יומיים, באמצעות חימם השחלה מדיה aliquots מ באמבט מים 37 ° C והמשך חלק 3 של הפרוטוקול בנקודת הזמן ניסיוני הרצויים.

3. רקמות קיבוע

  1. צינור חרוטי 15 מ"ל, להכין 4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (למשל, להוסיף 2 מ"ל של 16% PFA מיקרוסקופ אלקטרונים כיתה 6 מ של PBS 1 x).
    התראה: PFA הוא חומר מסוכן ויש לטפל ברדס כימי.
  2. לתקן את השחלות בתרבית, מבלי להסיר את הרקמה מהמכסה התרבות, על ידי כיסוי הרקמה עם הפתרון PFA הטרי של 4%. לאטום את הקצוות של הצלחת עם דבק פלסטיק (כדי למנוע אידוי) מקום הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: על מנת להקל על הטיפול ושלמות הרקמות, להימנע ועקרו מבתיהם השחלות מהמכסה התרבות התא לאורך ההליך כולו. בתרבית מצורף אל פני השטח של הקדמי שהשחלות יתרון לטיפול ללא גרימת נזק או אובדן איבר המין.
  3. לשטוף את הרקמה 3 x עם 70% EtOH ולאחר מכן המשך לשלב 4.1 או חנות זה נצנוץ הבקבוקונים מלאים 70% EtOH ב 4 ° C עד יותר עיבוד.
    הערה: אם באמצעות רקמות endogenously המבטאים חלבונים פלורסנט, אחסון הדגימות עם 70% EtOH ייתכן מאוד לצמצם את האות. לחלופין, רקמות יכול להיות לשטוף ומאוחסנים מגניב עם אזיד הנתרן 0.2% (נאן3). נאן3 , אולם הוא רעיל מאוד מהווה סיכון רציני אינהלציה. להפוך את הפתרון מניות בשכונה fume וטפל ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון מעבדה מעילו ואת nitrile כפפות.

4. כל הר Immunofluorescence

  1. מקום הרקמה קבוע 1 x PBS ב RT לפחות 4 שעות לפני השלב permeabilization 4.3.
  2. להכין permeabilization פתרון פתרון חסימה.
    1. להכין פתרון permeabilization כמתואר. כדי 1 x PBS, להוסיף 0.2% אלכוהול (PVA), 0.1% נתרן borohydride (NaBH4) פתרון (מתוך wt.% 12 בפתרון הידרוקסיד הנתרן (NaOH) 14 מ') ו- 1.5% פוליאתילן טרט -octylphenyl גליקול (דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית). צינור חרוטי 50 מ ל, הוסף 5 מ של 10 x PBS, 0.1 גר' PVA µL 50 NaBH4, µL 750 של דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית, ולאחר מכן להוסיף הנדסה גנטית מים עד 50 מ ל, להתסיס היטב בטמפרטורת החדר עד שהתערובת לחלוטין בפתרון.
    2. להכין פתרון חסימה כמתואר. 1 x PBS, מוסיפים חומרים פעילי שטח ללא יונית 0.1% דטרגנט, 0.15% של 2.5 מטר גליצין pH 7.4, סרום עז נורמלי 10%, 3% אלבומין שור (BSA), נאן 0.2%3, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100 ו 0.25 µg/mL שהוא גוסס B. להכין פתרון מניות של 2.5 גליצין מ' על ידי המסת g 93.8 של גליצין במים הנדסה גנטית לאמצעי הסופי 500 מ"ל (pH 7.4) ופתרון מניות של 10% נאן3 על ידי המסת 5 g ב- 50 מ ל מים הנדסה גנטית; לאחר מכן, צינור חרוטי 50 מ ל להכין את הפתרון חסימה על-ידי הוספת 5 מיליליטר 10 x PBS, 50 µL של חומרים פעילי שטח ללא יונית דטרגנט, 750 µL של פתרון מניות גליצין, 5 מ של עז סרום, 1.5 גר' BSA, 1 מ"ל של נאן3 מניות פתרון , ו- 0.5 מ ל 100 x מלאי של פניצילין, סטרפטומיצין, ו- B שהוא גוסס. מוסיפים מים הנדסה גנטית עד נפח סופי של 50 mL ומזרק מסנן הפתרון הסופי.
  3. להסיר, למחוק את PBS 1 x מ המבחנה, ולאחר מכן להוסיף לפתרון permeabilization מספיק לגמרי להטביע את השחלות. מקם את הדגימה permeabilization פתרון על שייקר מסלולית (למשל, nutator) בטמפרטורת החדר במשך 4 שעות.
    הערה: זמן הדגירה עשויים להשתנות בהתאם לעובי איברים.
  4. החלף את הפתרון permeabilization מספיק לפתרון חוסם לגמרי להטביע את השחלות. לאטום את המבחנה עם דבק פלסטיק ולהשאיר את הרקמה המקננת למינימום 12 שעות בטמפרטורת החדר-תפקודי לב / נשימה.
  5. להכין נוגדן ראשוני דילול בפתרון חסימה לפי גליון הנתונים של היצרן.
    הערה: שימו לב כי לא כל נוגדנים תואם הסוכן סליקה. אמצעי האחסון הממוצע צורך לכל דגימה היא בערך 750 µL.
    1. על כימות oocyte, להשתמש TAp63 (סמן גרעיני oocyte) ו MVH (סמן cytoplasmic תא הנבט).
      הערה: הנוגדנים בשימוש של תמונות immunofluorescence הם העכבר anti-p63 וארנבת אנטי-MVH). הפתרון נוגדן ראשוני ניתן לשימוש חוזר 2 x או יותר אם האחסון ב 4 ° C בין מכתים פרוטוקולים, טופלו כהלכה כדי למנוע התפתחות חיידקים.
  6. למקם את תותב המכיל את הרקמה לתוך צלחת 24-ובכן, להוסיף בערך 750 µL של נוגדן ראשוני פתרון. ודא כי השחלות לגמרי טובע. חותם את הצלחת עם דבק פלסטיק למזער אידוי ולעזוב את הרקמה המקננת ארבעה ימים בטמפרטורת החדר-תפקודי לב / נשימה.
  7. להכין את הפתרון כביסה.
    1. להכין פתרון כביסה כמתואר. להפוך 1 x PBS, להוסיף דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית PVA ו- 0.15% 0.2%. צינור חרוטי 50 מ ל, הוסף 5 מ של 10 x PBS, 0.1 גר' PVA, µL 75 של דטרגנט חומרים פעילי שטח ללא יונית ומים הנדסה גנטית עד נפח סופי של 50 מ.
  8. להסיר נוגדן ראשוני לדילול ומוסיפים כמות נדיבה של הפתרון כביסה. תמיד הקפידו להטביע את השחלות. לאפשר את השחלות כדי להשרות את הפתרון ללילה בטמפרטורת החדר-תפקודי לב /.
  9. להחליף את הפתרון כביסה, דגירה על תפקודי לב / נשימה במשך שעתיים או יותר.
  10. חזור על השלב 4.9 פעם נוספת.
  11. להכין נוגדן משני הדילול בחסימה פתרון.
    הערה: הנוגדנים משני המשמש הן אנטי-העכבר 488 הפלורסנט וגדל עז אנטי-ארנב 594 הפלורסנט העולות עז. ראה שלב 4.5. עבור אמצעי האחסון הממוצע צורך לכל דגימה.
  12. הפתרון כביסה להסיר השחלות ולהוסיף פתרון נוגדנים משניים. להגן על הדגימות מפני אור (צלחת פלסטיק ברדיד אלומיניום) ויסגור את הצלחת עם דבק פלסטיק כדי למזער את אידוי. דגירה דוגמאות על תפקודי לב / נשימה בטמפרטורת החדר במשך יומיים.
    הערה: המשך הגנה על הדגימות מן האור באמצעות נייר אלומיניום במהלך כל השלבים הבאים הדגירה.
  13. הסרת פתרון נוגדנים משניים מדגימות ולהוסיף הפתרון כביסה. דגירה על תפקודי לב / נשימה במשך 8 שעות.
    הערה: אם, 4, 6-Diamidino-2-phenylindole (דאפי) צביעת רצוי להוסיף 50 ננוגרם למ"ל של דאפי לצעד רחיצת הראשון (~ 8 h הדגירה).
  14. החלף את הפתרון כביסה ושטוף לילה.
  15. בעת הכנת הפתרון סליקה (ראו סעיף 5), להחליף את הלילה שטיפה פתרון פתרון טריים, שומרים את הדגימות-תפקודי לב / בטמפרטורת החדר.

5. השחלה ניקוי והדמיה

  1. להכין ScaleS(0) ניקוי פתרון.
    1. להכין ScaleS(0) ניקוי פתרון10 על-ידי הוספת ריאגנטים ביחס נתון של: 40% D-(-) בסורביטול (w/v), גליצרול 10%, אוריאה 4.3 מ' ו- 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), pH 8.1 (למשל צינור חרוטי 50 מ ל, להוסיף 2.5 מ של גליצרול, 10 גרם של בסורביטול , 5 מ של דימתיל סולפוקסיד ולאחר 12 מ של 9 מטר אוריאה עבור הנפח הכולל של 25 מ ל. לערבב פתרון על-ידי היפוך ב 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, דגה לפני השימוש.)
  2. להסיר את הפתרון כביסה ויציפו את הדגימות לפנות פתרון. לקבלת תוצאות טובות יותר לשמור על דגימות על ניעור מסלולית.
  3. להחליף את פתרון סליקה 2 x מדי יום עד הרקמה הופך שקוף (כ- 2 ימים).
  4. ברגע הרקמה אינה מסומנת, להכין את הדגימה עבור הדמיה על-ידי הסרת בזהירות את הקרום הוספה המכיל את השחלות תרבותי עם קנס עצה המדגם. אזמל והצבת על משטח זכוכית.
  5. המשך הדמיה הדגימות על מיקרוסקופ המסוגל חלוקתה אופטי.

6. oocyte כמת

הערה: ישנם תוכניות מחשב שונים רבים יכולים לכמת תאים. המתוארים להלן הוא פרוטוקול על כימות oocyte באמצעות החבילה עיבוד התמונה מסחרי, פיג'י-ImageJ14.

  1. באמצעות הקרנה שעברו שיטוח העוצמה המקסימלית של Z -מחסנית התמונה הסדרה עבור הסמנים סלולרית ספציפית עניין (ללא הערוץ דאפי), המירו את התמונה לתמונת שחור-לבן 8 סיביות תחת סוג ב התמונה הנפתחת תפריט.
  2. תחת התפריט הנפתח התמונה , לסמן את הכרטיסיה התאם ולאחר מכן בחר הסף.
  3. כוונן באופן ידני את הסף לרמה הטובה ביותר המזהה כל oocyte בודדים. ברגע הרמה נקבעת, לחץ על החל כדי להפיק תמונה בשחור-לבן. עם סיום, לכמת את הדגימה באמצעות התוחמים את סמל סגלגל או פריהנד .
    הערה: פיג'י-ImageJ יש אפשרויות שונות לחידוד התמונה שתשמש עבור כימות של חלקיקים. למשל, ב- תהליך | בינארי טאב, קיימות אפשרויות שונות, יכול לשמש כדי לשפר את הגילוי של מה ייספרו. איור 4, האפשרויות להשתמש טוב יותר לצורך זקיקים היה לשחוק, ואחריו למלא חורים, ולבסוף קו פרשת המים.
  4. תחת התפריט הנפתח נתח , בחר נתח חלקיקים. להגדיר את הפרמטרים על פי הרזולוציה הרצויה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה כולל 6 שלבים עיקריים בעקבות ניתוח של השחלות, כמתואר באיור1. איור 2 , איור 3 , איור 4 להדגיש את התכונות הכי חדשניים של פרוטוקול זה, הכוללים אופטימיזציה של רקמות ניקוי השחלות, כימות oocyte כל רקמה באמצעות פיג'י-ImageJ. איור 2A מראה תמונות של מחציתה 5 ימים לאחר הלידה קבוע שחלה לפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המחקר של רבייה יונקים דורש שימוש וכימות תאים מיוחדים נתונות לא שגרתי תרבית תאים. עם זאת, שמחוץ תרבות מערכות יעילים בשמירה השחלה ואת זקיק הכדאיות1,15. במהלך תרבות השחלה, הרקמה דורש שטח פנים גדול יותר עבור חילופי חומרים מזינים באמצעות דיפוזיה. לכן, העכבר 5 - בן יום השחלות אידיאליים בגודל ולגיבוש לתרבות איברים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור השחלות נשמר במשך שבעה ימים בתרבות, אך אורך תרבות השחלה יכול להיות מותאם על פי שאלה מדעית ספציפית1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים רבקה ויליאמס ו ג'ואנה דלה קרוס של הדמיה קורנל BRC ו אנדרו Recknagel על ההערות המועילות וסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על המכונים הלאומיים לבריאות גרנט S10-OD018516 (כדי מתקן הדמיה של קורנל), T32HD057854 כדי J.C.B., R01-GM45415 כדי J.C.S.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מספריים מיקרו כריתה 4.5 ", ישר, נקודות חדותRobozRS-5912מיקרו מספריים ניתוחים
מלקחיים בסגנון תכשיטנים 4-3/8 ", סגנון 5Integra Miltex17-305Xמלקחיים בקצה עדין
מספריים מיקרו איריס 4 ", ישר, נקודות חדותIntegra Miltex18-1618מספריים מיקרו כריתת קשתית או מספריים קפיציים מיקרו מנתחים
1X מינימלי מדיה חיונית (MEM)ThermoFisher Scientific11090-081
קורנינג סריום בקר עוברי35011CV
HEPES (1M)Gibco15630080
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה (100X)Gibco15240062בשימוש בשלב 1.3.1
35 מ"מ טיפול בתרבית רקמות430165
נונק ומסחר; צלחת מנשא 24 באר לתרבית תאים מוסיפהThermoFisher Scientific141006גודל נקבוביות: 8μ m
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710תמיסה 16% 1X
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco10010023
Nutator Mixer GyroTwister™LabnetS1000-A-Bשייקר תלת מימדי
סרום עיזים רגילVWR103219-578
סרום בקר אלבומין (BSA)VWR97061-416
נתרן אזיד (NaN3)Sigma-AldrichS2002-25G
תמיסת נתרן בורוהידריד (NaBH4)Sigma-Aldrich452904-25MLהשתמש בתמיסה, במקום ב צורת טבליות או אבקה 
אלכוהול פוליוויניל (PVA)סיגמא-אולדריץ'P8136-250Gטריטון מסיס במים קרים
ומסחר; X-100Sigma-Aldrich93443-100MLפוליאתילן גליקול tert-octylphenyl
אתר מסנני מזרקThermoFisher Scientific725-252025 מ"מ
10 מ"ל מזרקיםBD309695
עכבר אנטי-p63 נוגדן (4A4)Biocare MedicalCM 163Aדילול 1:500
ארנב אנטי-MVH נוגדןAbcamab13840דילול 1:600
Alexa Fluor® עיזים נגד עכבר 594ThermoFisher ScientificA-11032דילול 1:1000
Alexa Fluor® עז נגד ארנב 488ThermoFisher ScientificA-11034דילול 1:1000
4,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) תרמו-פישר סיינטיפיק62248
D-(-)סורביטול סיגמא-אולדריץ'240850-100 גרם
גליצרולסיגמא-אולדריץ'G9012-100 מ"ל
אוריאהסיגמא-אולדריץ'U5378-500G
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D2650-5X10 מ"ל
FIJI-ImageJתוכנה לעיבוד תמונה
פיפטות חד פעמיות להעברת פלסטיקVWR414044-034
,

מקורות

  1. O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
  2. Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
  3. Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture. Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).
  4. Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis. Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).
  5. Tilly, J. L. Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3. Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).
  6. Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies. Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).
  7. Skodras, A., Marcelli, G. Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments. PLOS ONE. 10 (3), e0120242(2015).
  8. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice. Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Scientific Reports. 7, (2017).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  12. Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  13. Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death. Genetics. , genetics.117.203455 (2017).
  14. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  15. Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro. Nature. 418 (6897), 497(2002).
  16. Faire, M., et al. Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary. Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).
  17. Byrne, C., Hardman, M. J. Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis. Epidermal Cells. , 127-136 (2005).
  18. Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Development. 6, 10(2011).
  19. Laronda, M. M., et al. A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice. Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Fiji ImageJ
Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.