כאן נתאר הליך כדי לבחון את התא ההעברה במבחנה עם מיקרוסקופ אופטי מצלמה אוטומטית. וזמינותו מאפס כבר בשימוש נרחב שבו הסגר על השריטה מלווה קצוב. מיקרוסקופ אופטי מאפשר זיהוי אמין וזול של נדידת תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אופטימיזציה Assay מאפס במבחנה בדיקה של נדידת תאים עם מצלמה אופטית אוטומטית
במאמר זה
סיכום
תקציר
נדידת תאים הוא תהליך חשוב זה משפיע על היבטים רבים של בריאות, כגון ריפוי הפצע סרטן, וזה, לפיכך, חיוני לפיתוח שיטות ללמוד את ההעברה. וזמינותו מאפס כבר זמן רב השיטה הנפוצה ביותר במבחנה לבדיקת תרכובות בעלות מאפיינים migration נגד פרו בגלל הליך שלו זולה ופשוטה. אולם, לבעיית וזמינותו מדווחים לעתים קרובות היא ההצטברות של תאי מעבר לקצה של השריטה. יתר על כן, כדי להשיג מידע וזמינותו, תמונות של חשיפות שונות חייב להילקח על פני תקופה של זמן, באותו מקום בדיוק כדי להשוות את התנועות של ההעברה. ניתן להשתמש בתוכניות ניתוח שונים כדי לתאר את הסגר מאפס, אך הם עבודה אינטנסיבית, אינו מדויק, ואת כוחות מחזורים של שינויי טמפרטורה. במחקר זה, נדגים שיטה ממוטב עבור בדיקת ההשפעה ההעברה, למשל עם החלבונים המתרחשים באופן טבעי האדם - ו שור-לקטופרין, שלהם פפטיד N-מסוף Lactoferricin על הקו תאים אפיתל HaCaT. אופטימיזציה מכריע היא לשטוף את לגרד ב- PBS, מה שמבטל את הצטברות תאים לאורך הקצה הנ. זו יכולה להיות מוסברת על ידי ההסרה של קטיונים, אשר הוכחו יש השפעה על חיבור תאים תאים תקין. כדי להבטיח זיהוי נכון של הגירה, בטיפול מראש עם מיטומיצין C, מעכב סינתזת ה-DNA, נוספה לפרוטוקול. לבסוף, נדגים אוטומטיות אופטי למצלמה, מה שמבטל מחזורי בטמפרטורה הקיצונית, כפיים עם ניתוח סגירת מאפס, תוך שהיא משפרת על הפארמצבטית להבטיח ניתוח קטעים זהים של השריטה לאורך זמן.
מבוא
ההעברה היא תהליך חשוב המשפיע מספר היבטים פיזיולוגיים. בריפוי הפצע, העברת מקל epithelization מחדש של העור. הפצעים ללא ריפוי, כגון לפצעים כרוניים, חיידקים הזדמנותית לגרום לזיהום הפצע, פצעים פתוחים הם אידיאליים עבור גידול חיידקים ועל היווצרות biofilm1,2. Biofilm הוא אחד הגורמים להתפתחות חיידקים עמידים, אשר הוא אחד האיומים הגדולים ביותר שלנו בחברה המודרנית3. בריפוי הפצע, תאים חיסוניים לא יכול לחדור את biofilm. ב סרטן, העברה של תאים סרטניים הוא צעד מכריע של גרורות, שהוא הגורם העיקרי למוות אצל חולים עם גידולים מוצקים4,5. לכן, זה הכרחי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הגדרת הניסוי נערך מסכים עם אוניברסיטת רוסקילדה, ויש אין מגבלה אתית ומשפטית. סקירה כללית של הסידור ניסיוני ניתן לראות באיור 1 ואת המנגנונים של המצלמה אופטי באיור2.
1. הכנה
- לבצע את כל הצעדים זרימה שכבתית-ספסל סטרילי על-ידי ניקוי הספסל, חסכון כל עם 70% אתנול לפני התחלת הניסוי.
- מקם את המצלמה אופטי חממה קונבנציונאלי ב 37 ° C עם 5% CO2 ליצירת תנאים אופטימליים עבור התאים.
- לגדל תאים HaCaT בתקשורת DMEM עם 10% FBS ואנטיביוטיקה 1 x (פניצילין, סטרפטומיצין) בבקבוקון T75.
- השתמש טריפסין 1 x 1 מ"ל כדי לנתק את התאים ואת תת מטפח אותן כל 3-4 ימים, על....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
HaCaT הוא קו תא תקין, אחד הסוגים התא הנפוץ ביותר של העור. כאשר פצע, תאי העור מתחיל להתרבות ולהעביר מעל למיטה הפצע כדי לסגור את הפצע (איור 3). שני התהליכים הם, לכן, חשיבות עליונה עבור ריפוי תקין.
המצלמה אופטי יכול לעקוב אחר שני תהליכים בזמן אמת. עבור העברה, המערכת נותנת שלוש ערכות נתונים: תא מכוסה באזור, רוחב המרווח ואזור הפער. כאשר ניטור שריטות שטופלו לקטופרין, Lactoferricin או EGF, מיקרוסקופ אופטי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
החשיבות של ההגירה במחקרים של פיתוח, ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וסרטן הוביל מספר שיטות שונות ללמוד ההעברה. ההעברה יכול להיות ביטוי של ההתרחבות או סגירת הפער על ידי התאים. לרוב הסגר על השריטה נבדק, כפי שהוא קל יותר לגדל תאים חד שכבתי ולאחר מכן לבצע שריטה יותר גוברת התאים לטופס מסוים8. המחקר שלנו מדגים שיטת אופטימיזציה עבור מגרד ידנית, כמו השיטה אינה קלה ועלות נמוכה. הצגנו את מיטומיצין מעכב סינתזה של דנ א ג, ושטוף נוספת כדי למטב את השריטה לעומת שיטות שפורסמו18ולאחר השימוש של מצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המועצה הדנית למען מחקר עצמאי, טכנולוגיה, ייצור, להעניק #4005-00029
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| oCelloScope | BioSense Solution ApS | מצלמה אופטית | |
| תוכנת UniExplorer | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
| HaCaT | נתרם מבית החולים Bispebjerg | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | מדיום עבור HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | סרום בקר עוברי |
| PBS | Gibco | D837 | ללא Mg+ ו-Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | אנטיביוטיקה |
| טריפסין (10x) | Sigma | T3924 | |
| מיטומיצין C | Tocris | 3258 | מעכב התפשטות |
| צלחת מיקרוטיטר | גריינר ביו-וואן | 677 180 | |
| אינקובטור | פנסוניק | 37° C, 5% CO2 | |
| המוציטומטר | מסייע | Tü rk (0.1 מ"מ) | |
| Pipet boy | Accu-Jet pro |
מקורות
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
